徐建立，孫艷華，李 明，董 路，孟小晶

(滄州市人民醫(yī)院，河北 滄州 061001)

結(jié)腸癌是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅患者的身心健康[1]。結(jié)腸癌早期沒(méi)有明顯癥狀，中晚期才逐漸出現(xiàn)腹脹、消化不良、腹痛、黏液便或黏血便等癥狀[2]。因此，結(jié)腸癌一經(jīng)診斷往往是中晚期。目前，結(jié)腸癌的臨床治療主要包括傳統(tǒng)手術(shù)、化療、放療以及新興的靶向治療和免疫治療等[3]。新藥物的應(yīng)用以及治療策略的更新一定程度延長(zhǎng)了患者的生存周期，但結(jié)腸癌患者經(jīng)過(guò)一段時(shí)間治療后通常會(huì)出現(xiàn)獲得性耐藥，最終導(dǎo)致治療失敗[4]。

中藥紫草為紫草科多年生草本植物新疆紫草或內(nèi)蒙紫草的干燥根，別名紫丹、地血、山紫草等[5]。紫草性味甘、咸、寒，歸心、肝經(jīng)，主要用于血熱毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、瘡瘍、濕疹、水火燙傷等[5]。紫草的化學(xué)成分復(fù)雜，主要包括萘醌類、苯醌類、苯酚及酚酸類等[6]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，紫草具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、清熱、止血、降血糖等廣泛的藥理作用[6]。萘醌衍生物在紫草中含量較高，其中以紫草素相關(guān)研究最為廣泛。研究顯示，紫草素在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抗癌作用，如大腸癌、睪丸癌、胰腺癌等[7-9]。但紫草素在結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥中的作用尚不清楚。本研究以結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞為研究對(duì)象，5-氟尿嘧啶(5-Fluorouraci，5-FU)誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞HT-29/DR，觀察紫草素在HT-29/DR細(xì)胞耐藥中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系：人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞，購(gòu)自上海生物工程研究所。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：5-FU(批號(hào)44825，美國(guó)MCE公司)；DMEM培養(yǎng)基(批號(hào)8120033、2132094P)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(批號(hào)SUELN，青島思科捷公司)；FAK抗體、Src抗體、Fibronectin抗體(批號(hào)C2332、C1521、A2521，美國(guó)圣克魯斯公司)；E-cadherin抗體、p-Src抗體、p-FAK抗體、羊抗兔IgG-HRP抗體、羊抗小鼠IgG-HRP(批號(hào)15、3、8、28、33，美國(guó)CST公司)；GAPDH抗體(批號(hào)M29D22，南京巴傲得公司)；PBS、0.1%結(jié)晶紫染色液、總蛋白提取試劑盒、MTT試劑盒及RIPA細(xì)胞裂解液(北京索萊寶公司)；PVDF膜(美國(guó)Millipore公司)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(型號(hào)Multiskan SkyHigh，美國(guó)Thermo Scientific公司)；全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)系統(tǒng)(型號(hào)Tanon3500，上海天能公司)；倒置顯微鏡(型號(hào)CKX53，日本Olympus公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：采用90%的DMEM、10%胎牛血清、1%青-鏈霉素制備培養(yǎng)基，培養(yǎng)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱。

1.2.2 HT-29/5-FU細(xì)胞構(gòu)建：將HT-29細(xì)胞傳代至6 cm培養(yǎng)皿中，用起始濃度為0.01 μmol/L的5-FU處理細(xì)胞直至生長(zhǎng)穩(wěn)定。傳代2～3次，提高5-FU濃度(每次提高0.01 μmol/L)處理HT-29細(xì)胞直至生長(zhǎng)穩(wěn)定。繼續(xù)傳代2～3次，按上述操作提高5-FU濃度直至4.5 μmol/L，當(dāng)細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖：將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的HT-29/5-FU、HT-29細(xì)胞接種于96孔板，每孔8000個(gè)細(xì)胞左右。按照需要加入適量紫草素處理24 h，必要時(shí)加入0～200 μmol/L 5-FU繼續(xù)處理24 h。處理結(jié)束后每孔加入100 μl的MTT于培養(yǎng)箱孵育4 h。取出細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，加入濃度為150 μl的DMSO，于酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值。

1.2.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆能力：將HT-29和HT-29/5-FU細(xì)胞以每孔300個(gè)傳代至6孔板中，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。次日，各加入含5 μmol/L5-FU的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 d。棄去舊培養(yǎng)基，PBS洗2遍，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，PBS洗2遍，加入0.1%結(jié)晶紫染色液靜置10 min，清水洗2遍。用相機(jī)拍照記錄。

1.2.5 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)p-Src、p-FAK、E-cadherin和Fibronectin蛋白表達(dá)：將處理好的細(xì)胞收集于5 ml離心管，1000 r/min離心5 min，棄去上清液后加入1 ml的PBS重懸。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1 ml的EP管，1000 r/min離心5 min，棄去廢液。將細(xì)胞置于冰上，加入RIPA細(xì)胞裂解液裂解10 min，12000 r/min離心20 min，上清液即為總蛋白。取2 μl總蛋白以BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，而后以蛋白上樣緩沖液制備蛋白濃度為2.5 μg/μl的蛋白樣品，100 ℃變性5 min。變性好的蛋白樣品以10%的SDS-PAGE電泳進(jìn)行分離，隨后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%牛血清白蛋白封閉2 h，用p-Src(1∶1000)、Src(1∶2000)、FAK(1∶1000)、p-FAK(1∶500)、Fibronectin(1∶500)、E-cadherin(1∶2000)或GAPDH(1∶1000)抗體于4 ℃搖床孵育過(guò)夜，次日TBST洗3遍，孵育羊抗兔/鼠IgG-HRP二抗，TBST洗3遍，PVDF膜淋ECL化學(xué)發(fā)光液顯色，置于凝膠成像儀下顯影，讀取相應(yīng)蛋白條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 5-FU耐藥HT-29細(xì)胞驗(yàn)證 采用直接增加5-FU濃度，梯度誘導(dǎo)的方法成功構(gòu)建5-FU耐藥結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29/5-FU，5-FU處理后HT-29和HT-29/5-FU細(xì)胞存活率，見(jiàn)表1。經(jīng)計(jì)算，HT-29/5-FU耐藥指數(shù)為6.5?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，5-FU處理后HT-29細(xì)胞克隆形成率為100%，HT-29/5-FU細(xì)胞為(382.6±36.1)%；與HT-29細(xì)胞比較，HT-29/5-FU細(xì)胞克隆形成率較高，兩種細(xì)胞的克隆形成率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示HT-29/5-FU構(gòu)建成功(圖1)。

表1 不同濃度5-FU對(duì)HT-29和HT-29/5-FU細(xì)胞存活率影響

圖1 5-FU對(duì)HT-29、HT-29/5-FU細(xì)胞克隆形成的影響

2.2 紫草素對(duì)HT-29/5-FU、HT-29細(xì)胞增殖的影響 MTT結(jié)果(圖2)顯示，紫草素處理后HT-29/5-FU和HT-29細(xì)胞的存活率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。0.05～1 μmol/L紫草素對(duì)HT-29/5-FU和HT-29細(xì)胞存活率的影響與溶劑對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；5 μmol/L紫草素組、10 μmol/L紫草素組均可降低兩種細(xì)胞的存活率，與溶劑對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。為排除紫草素對(duì)細(xì)胞增殖的影響，采用0.1、0.5、1 μmol/L紫草素進(jìn)行后續(xù)研究。

注：與溶劑對(duì)照組比較，*P<0.01

2.3 紫草素對(duì)HT-29/5-FU細(xì)胞5-FU耐藥的影響 MTT結(jié)果(圖3)顯示，5-FU對(duì)溶劑對(duì)照組、0.1 μmol/L紫草素組、0.5 μmol/L紫草素組、1 μmol/L紫草素組HT-29/5-FU細(xì)胞的IC50分別為(112.8±12.3)、(91.4±10.6)、(51.2±5.5)、(26.6±3.1)μmol/L。與溶劑對(duì)照組比較，0.5 μmol/L紫草素組和1 μmol/L紫草素組的IC50水平均低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。提示紫草素能緩解HT-29/5-FU細(xì)胞對(duì)5-FU耐藥。

注：與溶劑對(duì)照組比較，*P<0.01

2.4 各組HT-29/5-FU細(xì)胞Src和FAK磷酸化蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表2(圖4)。蛋白印跡結(jié)果顯示，與溶劑對(duì)照組比較，0.5 μmol/L紫草素組、1 μmol/L紫草素組的HT-29/5-FU細(xì)胞p-Src和p-FAK蛋白表達(dá)均低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表2 各組HT-29/5-FU細(xì)胞Src和FAK磷酸化蛋白表達(dá)比較(%)

圖4 各組HT-29/5-FU細(xì)胞Src和FAK磷酸化蛋白表達(dá)電泳圖

2.5 各組HT-29/5-FU細(xì)胞Fibronectin和E-cadherin蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表3(圖5)。蛋白印跡結(jié)果顯示，與溶劑對(duì)照組比較，0.5 μmol/L紫草素組、1 μmol/L紫草素組HT-29/5-FU細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)均高，F(xiàn)ibronectin蛋白表達(dá)均低，組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表3 各組HT-29/5-FU細(xì)胞Fibronectin和E-cadherin蛋白表達(dá)比較(%)

圖5 各組HT-29/5-FU細(xì)胞Fibronectin和E-cadherin蛋白表達(dá)電泳圖

3 討 論

中藥是中醫(yī)體系的重要組成部分[10]。相對(duì)于西藥，中藥的化合物組成成分多樣，難以解釋其具體作用機(jī)制[11]。從中藥中提取的單體化合物具有明確的化學(xué)結(jié)構(gòu)式，較易研究單體化合物發(fā)揮藥效的潛在作用機(jī)制。因此，深入研究中藥單體化合物的作用機(jī)制，有利于豐富中藥的理論體系，為中醫(yī)治療提供相關(guān)理論基礎(chǔ)。大量研究顯示，一些中藥單體化合物在抵抗腫瘤對(duì)化療藥物耐藥方面具有積極作用。中藥三七的活性成分三七總皂苷具有活血祛瘀，通脈活絡(luò)的功效。馮曉異等[12]研究發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷在逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞對(duì)阿霉素耐藥方面發(fā)揮一定作用，其可通過(guò)抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路介導(dǎo)多藥耐藥基因1表達(dá)下調(diào),進(jìn)而提高阿霉素在耐藥細(xì)胞中累積。欖香烯是從重要莪術(shù)中提取分離的倍半萜烯類化合物。研究顯示，欖香烯參與肺癌細(xì)胞順鉑耐藥，其可誘導(dǎo)順鉑耐藥的SPC-A-1細(xì)胞自噬，從而介導(dǎo)耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性增強(qiáng)[13]。槲皮素作為廣泛分布于多種中草藥中的黃酮醇類化合物，被證實(shí)在抑制膀胱癌順鉑耐藥中發(fā)揮重要作用。翁旭東等[14]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能上調(diào)順鉑耐藥膀胱癌細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bim的表達(dá)水平，Bim通過(guò)與Bax蛋白結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞色素C釋放，從而觸發(fā)胱天蛋白酶介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，最終增強(qiáng)順鉑對(duì)膀胱癌細(xì)胞的殺傷作用。這些研究表明，研究中藥提取物在惡性腫瘤化療藥物耐藥中的作用，對(duì)于中西醫(yī)臨床治療具有重要理論價(jià)值和指導(dǎo)意義。

中藥紫草具有涼血、活血、解毒、清熱、透疹的作用，常應(yīng)用于濕熱斑疹、黃疸、熱結(jié)便秘、丹毒、瘡瘍、淋病等疾病。歷代古籍對(duì)紫草功用的記載各有側(cè)重，《本經(jīng)》：“主心腹邪氣，五疸，補(bǔ)中益氣，利九竅，通水道?！薄秳e錄》：“療腹腫脹滿痛，以合膏，療小兒瘡及面齄?！薄侗静輬D經(jīng)》：“治傷寒時(shí)疾，發(fā)瘡疹不出者，以此作藥，使其發(fā)出?！薄侗静菥V目》：“紫草，其功長(zhǎng)于涼血活血，利大小腸。故痘疹欲出未出，血熱毒盛，大便閉澀者宜用之，已出而紫黑便閉者亦可用。若已出而紅活，及大陷大便利者，切宜忌之?！薄侗静萁?jīng)疏》：“紫草為涼血之要藥，故主心腹邪熱之氣。五疸者，濕熱在脾胃所成，去濕除熱利竅，其疸自愈。邪熱在內(nèi)，能損中氣，邪熱散即能補(bǔ)中益氣矣?？嗪曰?，故利九竅而通水道也。腹腫脹滿痛者，濕熱解而小便出，則前癥自除也。合膏藥療小兒痘瘡及面齄，皆涼血之效也?！弊喜菟厥菑闹兴幾喜葜刑崛〉妮刘苌?，具有廣泛的藥理作用。研究顯示，紫草素可通過(guò)靶向Cdc25s蛋白誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞周期阻滯，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖[15]。另有研究顯示，紫草素通過(guò)AKT/mTOR和ROS/ERK1/2通路降低基質(zhì)金屬蛋白酶-2和基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達(dá)，從而抑制前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[16]。最近研究報(bào)道顯示，紫草素可通過(guò)同時(shí)抑制ADAM17和IL-6/STAT3信號(hào)通路，協(xié)同抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)[17]。以上均提示，紫草素能通過(guò)多種信號(hào)機(jī)制發(fā)揮抗癌作用。但紫草素是否在結(jié)腸癌細(xì)胞化療耐藥中發(fā)揮作用尚不清楚。為觀察紫草素在結(jié)腸癌細(xì)胞5-FU耐藥中的作用，本研究采用直接增加5-FU藥物濃度，梯度誘導(dǎo)的方法構(gòu)建5-FU耐藥結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29/5-FU，耐藥指數(shù)為6.5。克隆形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，5-FU處理后HT-29/5-FU細(xì)胞克隆形成能力明顯增強(qiáng)，提示HT-29/5-FU構(gòu)建成功。本研究首先觀察紫草素對(duì)HT-29和HT-29/5-FU細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.05～1 μmol/L紫草素對(duì)HT-29/5-FU和HT-29細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響，而1～10 μmol/L紫草素顯著抑制兩種細(xì)胞增殖。為排除紫草素對(duì)細(xì)胞增殖的影響，采用0.1、0.5、1 μmol/L紫草素進(jìn)行后續(xù)研究。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，5-FU對(duì)0.5、1 μmol/L紫草素處理的HT-29/5-FU細(xì)胞IC50顯著降低，提示紫草素可增強(qiáng)HT-29/5-FU細(xì)胞對(duì)5-FU的抵抗作用。分子研究發(fā)現(xiàn)，0.5、1 μmol/L紫草素可抑制HT-29/5-FU細(xì)胞Src和FAK磷酸化蛋白表達(dá)。FAK-Src信號(hào)通路在惡性腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用。研究顯示，Ⅳ型膠原α1鏈通過(guò)激活FAK-Src信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[18]。Zhang等[19]研究發(fā)現(xiàn)FAK-Src信號(hào)通路可介導(dǎo)lncRNA KCNQ1OT1誘導(dǎo)的舌癌細(xì)胞增殖和順鉑耐藥。研究顯示，ASPP2蛋白通過(guò)抑制肝癌細(xì)胞Src/FAK/Snail信號(hào)軸抑制干細(xì)胞樣特征和化療藥物抗性[20]。以上提示，紫草素可能通過(guò)抑制Src-FAK信號(hào)通路抑制HT-29/5-FU細(xì)胞對(duì)5-FU耐藥。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮細(xì)胞通過(guò)特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程[21-22]。在腫瘤細(xì)胞中，EMT的發(fā)生往往導(dǎo)致細(xì)胞惡性生物學(xué)行為增強(qiáng)[22]。為了探討EMT是否參與紫草素抵抗結(jié)腸癌細(xì)胞5-FU耐藥，觀察了紫草素對(duì)HT-29/5-FU細(xì)胞EMT標(biāo)志物的影響。E-cadherin和Fibronectin蛋白分別為公認(rèn)的上皮細(xì)胞標(biāo)志物和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)和Fibronectin蛋白表達(dá)上調(diào)通常提示細(xì)胞發(fā)生EMT[23]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.5、1 μmol/L紫草素可誘導(dǎo)HT-29/5-FU細(xì)胞上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)上調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Fibronectin蛋白表達(dá)下調(diào)，提示紫草素能抑制HT-29/5-FU細(xì)胞EMT狀態(tài)。研究顯示，Src-FAK信號(hào)通路參與膀胱癌細(xì)胞EMT，BSA結(jié)合對(duì)甲酚硫酸鹽通過(guò)ROS/Src/FAK信號(hào)通路觸發(fā)膀胱癌細(xì)胞遷移和EMT[24]。Src-FAK信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞EMT從而維持細(xì)胞耐藥。研究報(bào)道，Src-FAK信號(hào)通路可介導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌EMT相關(guān)的厄洛替尼耐藥[25]。

綜上，紫草素可能通過(guò)抑制Src-FAK通路抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化緩解結(jié)腸癌細(xì)胞5-FU耐藥，但紫草素抑制Src-FAK信號(hào)通路的具體作用機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。值得注意的是腫瘤具有異質(zhì)性，紫草素是否在其他惡性腫瘤中能夠發(fā)揮類似作用還不清楚。總之，本研究發(fā)現(xiàn)了紫草素抵抗結(jié)腸癌細(xì)胞5-FU化療耐藥的潛在作用和機(jī)制，為臨床治療結(jié)腸癌化療耐藥提供了一定的實(shí)驗(yàn)支持。