張 妍，周納納，韓 茹，劉 婧，雷瑗琳

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；2.西安市中醫(yī)醫(yī)院心內(nèi)科，陜西 西安 710021)

近年來，心血管疾病病死率逐年攀升，且多種心血管疾病的發(fā)生都與心肌纖維化密切相關(guān)。心肌纖維化(Myocardial fibrosis,MF)是多種原因?qū)е滦呐K結(jié)構(gòu)和功能改變的代償及修復(fù)結(jié)果，但過度心肌纖維化會導(dǎo)致心功能逐漸減退，是心功能由代償期過度為失代償期的關(guān)鍵[1]。長期血壓升高，心室后負(fù)荷過重是造成心肌纖維化的重要誘因。研究顯示，在高血壓心肌纖維化過程中免疫系統(tǒng)被激活，炎癥反應(yīng)可直接或間接參與高血壓心肌纖維化的病理生理進(jìn)程，造成心肌損傷和結(jié)構(gòu)重塑，促使心力衰竭的發(fā)生發(fā)展[2]。在應(yīng)激反應(yīng)中p38MAPK/NF-κB p65信號通路對機(jī)體有保護(hù)作用，但當(dāng)其被過度激活時會產(chǎn)生促炎因子而加重炎癥反應(yīng)過程，故抑制此通路成員能夠明顯改善心肌纖維化[3]。近年來，西醫(yī)在其治療方面尚存在局限性，如長期用藥易出現(xiàn)耐藥性、不良反應(yīng)等，而中醫(yī)學(xué)能夠多層次、分階段治療，利于應(yīng)對心血管疾病病程長且證候復(fù)雜多變的特點，優(yōu)勢凸顯。益心附葶飲由黑附片、葶藶子、白術(shù)、太子參等藥物組成，具有溫陽化氣利水之功效，是雷瑗琳主任醫(yī)師根據(jù)長期臨床經(jīng)驗總結(jié)而成的治療慢性心力衰竭經(jīng)驗方，對心衰患者療效較好。既往大量動物實驗和臨床研究表明，益心附葶飲不僅能夠強(qiáng)心，還能減少炎癥因子的釋放，具有抑制心室重構(gòu)、延緩心衰進(jìn)程的作用[4-5]。因此，本實驗通過觀察腹主動脈縮窄大鼠心肌組織中膠原纖維比例1型膠原蛋白(Collagen 1)、3型膠原蛋白(Collagen 3)、p38MAPK和NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平，探討益心附葶飲能否通過干預(yù)p38MAPK/NF-κB p65信號通路緩解炎癥反應(yīng)，達(dá)到防治慢性心力衰竭的目的。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：清潔級雌性SD大鼠50只，購自成都達(dá)碩實驗動物有限公司，實驗動物質(zhì)量許可證號SCXK(川)2020-035，平均體重(230±20)g。

1.1.2 實驗試劑：Western、IP細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自上海碧云天生物公司，Immobilon-PSQ PVDF 膜購自美國Sigma-Aldrich公司，甘氨酸、Tris for molecular biology、SDS均購自德國Biofroxx公司，ECL發(fā)光試劑盒、兔源p65抗體、兔源GAPDH抗體均購自美國Affinity Bioscience公司，預(yù)染蛋白Marker、兔源Collagen 1抗體、兔源p38MAPK抗體均購自湖北Abclonal公司，兔源Collagen 3抗體購自美國Proteinteach公司。

1.1.3 實驗儀器：轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)(德國徠卡公司)，JT-12S自動組織脫水機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)，BMJ-A型包埋機(jī)(常州中威電子公司)，RS36型全自動染色機(jī)(常州派斯杰醫(yī)療設(shè)備有限公司)，PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀有限公司)，數(shù)字切片掃描儀Pannoramic 250(濟(jì)南丹吉爾電子有限公司)，Image-Pro Plus 6.0軟件(美國Cybernetics公司)，垂直電泳槽JY-SCZ4+(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)，電泳儀JY200C(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)，水平脫色搖床TY-80A(江蘇科析儀器有限公司)，化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀5200(上海天能科技有限公司)，全功能酶標(biāo)儀MK3(美國ThermoFisher儀器有限公司)，超低溫冰箱DW-86L386(海爾集團(tuán))，高速低溫離心機(jī)H2050R(湖南湘儀集團(tuán))，優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)(成都超純科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 益心附葶飲：黑附片(先煎)20 g，炒葶藶子、茯苓皮、太子參、丹參各30 g，桂枝、川芎、麥冬各12 g，生白術(shù)、生地黃各15 g，醋五味子6 g，炙甘草10 g，以上藥物由西安市中醫(yī)醫(yī)院制劑科提供顆粒劑制備。

1.2.2 建模、分組及給藥：大鼠常規(guī)喂養(yǎng)1周，采用腹主動脈縮窄法制做心衰大鼠模型。用10%水合氯醛麻醉大鼠，開腹后分離出腹主動脈，以鈍性7號針頭4號線結(jié)扎，結(jié)扎后觀察到腎臟缺血變白，迅速抽出針頭，縫合關(guān)腹。連續(xù)3 d腹腔注射青霉素4萬IU/d預(yù)防感染。將造模成功大鼠30只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、中藥組，每組15只，常規(guī)飼養(yǎng)的20只大鼠隨機(jī)取15只作為假手術(shù)組。根據(jù)體表面積計算灌胃大鼠劑量，中藥組每只灌胃3.5 g/(kg·d)益心附葶飲，模型組與假手術(shù)組以等體積蒸餾水灌胃，各組持續(xù)給藥時間為8周。

1.2.3 Masson染色與心肌纖維化檢測：大鼠處死后，解剖并暴露剝離心臟，洗凈血液，分離左室，于左室最大橫徑處橫切開，將左心室分為兩部分。一部分組織甲醛固定、石蠟包埋、Masson染色后切片，每張切片放大100倍，先觀察整體組織，再根據(jù)組織大小及表達(dá)情況分別選取3個區(qū)域，放大400倍采集圖像。每個部位選3個視野，用Image Pro Plus 6.0軟件測量膠原纖維面積與所選視野面積的比值作為心臟膠原容積分?jǐn)?shù)(Collagen Volumetric Fraction，CVF)。

1.2.4 Western blot檢測Collagen 1、Collagen 3、p38MAPK和NF-κB p65蛋白表達(dá)：利用RIPA裂解液和組織破碎儀將心肌組織破碎成組織勻漿液，4 ℃，12 000 r/min，離心10 min，取上清液。電泳：利用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白含量測定，將定量好的蛋白組織勻漿液加入合適體積的loading buffer，上樣前蛋白樣品95 ℃煮15 min，冷卻后置于-80 ℃低溫冰箱貯存。每孔組織蛋白上樣量相等，置于電泳緩沖液中電泳，分離目的蛋白。轉(zhuǎn)膜：采用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。將膜與切好的帶有目的條帶的分離膠切下后放入轉(zhuǎn)膜液轉(zhuǎn)膜1～2 h。封閉：用TBST配制的5%脫脂奶粉將PVDF膜封閉2 h。加一抗、二抗：添加Collagen 1、Collagen 3、p38MAPK、p65、GAPDH一抗，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，5 min/次；將PVDF膜放入二抗，稀釋濃度為1∶5000，室溫孵育2～3 h，TBST洗膜3次，10 min/次。洗膜后加入ECL發(fā)光液，室溫反應(yīng)1 min，凝膠成像儀成像，用天能GIS機(jī)箱控制軟件V 2.0對條帶進(jìn)行曝光掃描，計算目的蛋白相對表達(dá)量。目的蛋白相對表達(dá)量以目的蛋白積分光密度值(IOD)/內(nèi)參積分光密度值比值表示。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化 見表1(圖1)。圖1中綠色箭頭為纖維組織。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠各心肌細(xì)胞間距明顯增寬，心肌纖維排列明顯紊亂，有大量膠原纖維蛋白沉積，心臟纖維組織表達(dá)面積升高；與模型組比較，中藥組各心肌細(xì)胞間隙縮窄，排列較整齊致密，大鼠心肌組織中僅見少量膠原纖維蛋白沉積。與假手術(shù)組比較，模型組心臟纖維組織表達(dá)較大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，中藥組心臟纖維組織表達(dá)面積較小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠心臟纖維組織表達(dá)面積比較

圖1 各組大鼠心肌組織病理學(xué)形態(tài)(Masson染色，×400)

2.2 各組大鼠心肌組織Collagen 1、Collagen 3、p38MAPK和NF-κB p65蛋白表達(dá)比較 各組大鼠在接受藥物等干預(yù)后進(jìn)行Western blot法檢測，從檢測結(jié)果來看，與假手術(shù)組大鼠心肌組織比較，模型組大鼠心臟組織Collagen 1、Collagen 3、p38MAPK、NF-κB p65蛋白表達(dá)較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。與模型組大鼠組織相比，中藥組大鼠心臟中Collagen 1、Collagen 3、NF-κB p65蛋白表達(dá)較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。中藥組大鼠心臟組織p38MAPK蛋白表達(dá)與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2(圖2)。

圖2 各組大鼠心肌組織蛋白電泳圖

表2 各組大鼠心肌組織Collagen 1、Collagen 3、p38MAPK和NF-κB p65蛋白表達(dá)比較

3 討 論

心力衰竭是高血壓病常見的并發(fā)癥之一，長期血壓升高造成心臟后負(fù)荷過重，神經(jīng)內(nèi)分泌因子被過度激活，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變，超過代償范圍后，受損組織內(nèi)部及周圍纖維結(jié)締組織增加，最終發(fā)展為心肌纖維化，心肌纖維化嚴(yán)重?fù)p害心臟功能，治療難度大，且愈后極差，故探索高血壓心肌纖維化的發(fā)生機(jī)制，延緩纖維化進(jìn)程對高血壓患者的治療起到了積極作用[6]。目前普遍認(rèn)為，心肌纖維化作用機(jī)制與細(xì)胞因子、細(xì)胞外機(jī)制動態(tài)平衡、炎癥反應(yīng)等有關(guān)[7]。其中炎癥是高血壓心肌纖維化發(fā)展過程中的重要表現(xiàn)。本研究采用腹主動脈縮窄術(shù)構(gòu)建心衰大鼠模型，通過對比中藥組及模型組心肌細(xì)胞Masson染色結(jié)果及Collagen 1、Collagen 3蛋白表達(dá)水平，證實益心附葶飲對大鼠壓力性負(fù)荷導(dǎo)致的心肌纖維化有抑制作用。進(jìn)一步測定通過炎癥反應(yīng)影響心肌纖維化的p38MAPK/NF-κB p65信號通路發(fā)現(xiàn)，益心附葶飲可抑制該通路相關(guān)蛋白，由此認(rèn)為該方抑制心肌纖維化作用可能與抑制p38MAPK/NF-κB p65信號通路有關(guān)。

在心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中，心肌內(nèi)膠原蛋白發(fā)揮著重要作用。心肌細(xì)胞可合成多種膠原蛋白，主要為1型和3型膠原蛋白，在健康心臟中分別約占80%、10%，兩者合成與降解保持著動態(tài)平衡，其中1型膠原蛋白與心肌收縮和舒張的僵硬度有關(guān)，抗?fàn)坷芰?qiáng)，維持心肌壁的拉伸；3型膠原蛋白主要與心肌彈性相關(guān)，伸展性較大[8]。在機(jī)體正常情況下，心肌細(xì)胞合成1型和3型膠原蛋白的含量較低，而在心肌纖維化時則會被過度激活，表現(xiàn)為膠原蛋白大量沉積、Collagen 1與Collagen 3比例失調(diào)及膠原空間結(jié)構(gòu)排列紊亂等，進(jìn)而心肌僵硬，心室順應(yīng)性減弱，最終導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生。

炎癥是心肌纖維化的重要誘發(fā)因素，當(dāng)心臟出現(xiàn)急慢性損傷時，免疫系統(tǒng)被過度激活，炎癥信號因子即刻增加，激活心肌成纖維細(xì)胞，誘導(dǎo)膠原代謝異常，引起心肌纖維化等病理改變[9]。p38MAPK/NF-κB p65信號通路與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，被認(rèn)為是細(xì)胞信號傳遞的共同通路，在心肌纖維化等疾病發(fā)展過程中扮演著重要角色。p38MAPK絲裂原活化蛋白激酶又稱為細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶，最初由小鼠肝臟細(xì)胞中分離純化提取，是MAPK信號通路的重要蛋白，對促進(jìn)心肌細(xì)胞的增長和發(fā)育起著重要作用，其可在生理性應(yīng)激、紫外線照射、電離輻射等多種細(xì)胞外刺激下由非活化狀態(tài)轉(zhuǎn)為磷酸化，形成p-p38后激活p38信號通路，進(jìn)而調(diào)控體內(nèi)炎癥因子和氧化應(yīng)激損傷，參與細(xì)胞纖維化的病理過程[10-12]。有研究表明，黃葵膠囊能夠通過降低p38MAPK信號通路活性以及致纖維化細(xì)胞因子、炎癥因子蛋白的表達(dá)水平而改善腎纖維化[13]。段云嬌等[14]總結(jié)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)生心肌細(xì)胞損傷，降低p38濃度水平能夠有效控制心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)發(fā)展為心肌重構(gòu)。NF-κB是關(guān)鍵的核轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，最初是由淋巴B細(xì)胞發(fā)現(xiàn)提取，正常情況下以非活化狀態(tài)的二聚體形式存在，研究發(fā)現(xiàn)其具有誘導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)和血管內(nèi)皮損傷的不良作用。NF-κB具有多個亞單位，其中NF-κB p65是NF-κB蛋白家族的明星成員，在不利因素的刺激下，NF-κB從穩(wěn)定的三聚體狀態(tài)降解分離，NF-κB得以活化轉(zhuǎn)核，導(dǎo)致多種炎癥因子和介質(zhì)表達(dá)，在慢性炎癥的調(diào)節(jié)過程起著舉足輕重的作用[15-16]。慢性炎癥可直接或間接地為心肌細(xì)胞壞死凋亡、心肌纖維化創(chuàng)造條件[17]。有大量實驗證明，NF-κB通路與炎癥反應(yīng)及多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。張棟等[18]建立膝骨關(guān)節(jié)炎(Knee osteoarthritis，KOA)大鼠模型研究KOA發(fā)病機(jī)制，結(jié)果表明NF-κB信號通路在KOA滑膜炎癥進(jìn)展過程中被激活，發(fā)揮著重要調(diào)控作用。楊家耀等[19]通過構(gòu)建非酒精性脂肪肝大鼠模型發(fā)現(xiàn)，附子理中湯通過抑制NF-κB p65通路降低炎癥因子的釋放，從而改善肝細(xì)胞纖維化，恢復(fù)肝功能。

中醫(yī)古籍中很早就出現(xiàn)了CHF癥狀、病因病機(jī)等記載，但無CHF病名，根據(jù)其臨床癥狀(胸悶氣短、心慌、乏力、水腫等)可將其歸屬于“胸痹”“心悸”等范疇，對此歷代醫(yī)家還有“心脹”“水腫”“心水”“喘咳”等記載，其病因病機(jī)特點為本虛標(biāo)實，以臟器虧虛為本，痰濁、水飲、血瘀為標(biāo)，益氣溫陽，活血利水為其治療大法[20-22]?！峨s病源流犀燭·怔忡源流》說：“怔忡……或由陽氣內(nèi)虛，或由陰虛內(nèi)耗”,指出心陽(氣)虛是心衰的基本病理改變，貫穿于心衰病程的始終。氣虛日久，血液運(yùn)行無力發(fā)為血瘀；心陽虛衰，失于溫煦，水飲內(nèi)停聚而成痰,瘀血、痰濁形成后,進(jìn)一步損傷陽氣,加重心衰。益心附葶飲是雷瑗琳主任醫(yī)師治療慢性心力衰竭的經(jīng)驗方，此方陰陽并補(bǔ)，活血利水，經(jīng)長期臨床應(yīng)用，療效較好。方中附子、葶藶子為君藥，附子溫腎通陽，葶藶子瀉肺利水平喘；白術(shù)、太子參、桂枝相配益氣健脾，補(bǔ)益心腎，振奮心陽；佐以茯苓皮健脾利濕，川芎、丹參行氣活血化瘀，五味子、生地黃養(yǎng)陰生津；加以甘草調(diào)和諸藥。全方配伍精當(dāng),以補(bǔ)為主,攻補(bǔ)兼施,共奏溫陽化氣利水之功，患者陽氣來復(fù)，氣化正常，水飲瘀血皆可消。

本實驗研究證實，p38MAPK/NF-κB p65炎癥反應(yīng)通路參與了心衰形成病理過程；益心附葶飲能夠降低心肌纖維組織表達(dá)面積，降低心肌組織中Collagen 1、Collagen 3、NF-κB p65蛋白表達(dá)含量，抑制其異常過量沉積，發(fā)揮治療心肌纖維化的作用。p38MAPK蛋白表達(dá)在中藥組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與實驗例數(shù)較少和周期較短等因素有關(guān)，有待增加實驗例數(shù)進(jìn)一步研究。下一步研究將利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對益心附葶飲中的有效中藥進(jìn)行篩選，豐富該方的藥理學(xué)研究證據(jù)。

綜上，益心附葶飲通過下調(diào)Collagen 1、Collagen 3蛋白表達(dá)和抑制NF-κB p65信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，抑制壓力性心力衰竭大鼠心肌纖維化。