張容超，吳 濤，劉 奇，李 娜，郭奎奎，杜 旭，王瑞輝

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046)

顱腦損傷(Traumatic brain injury,TBI)是一種常見(jiàn)的神經(jīng)外科疾病，屬中醫(yī)學(xué)“跌仆”“腦傷”范疇[1]。TBI主要是由暴力直接或間接作用于頭部，破壞正常腦實(shí)質(zhì)而發(fā)病，?？梢饡簳r(shí)或永久性的認(rèn)知、心理及生理功能的喪失，其發(fā)病率居全身創(chuàng)傷性疾病之首，患者群體主要是青壯年男性[2]。不管是在貧窮戰(zhàn)亂地區(qū)，還是發(fā)達(dá)和平的國(guó)家TBI的發(fā)病率都非常高，本病引起的學(xué)習(xí)、工作等日常生活能力的障礙及巨額的醫(yī)療費(fèi)用，給患者及社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)，近年來(lái)隨著工礦、交通等基建行業(yè)的發(fā)展，其發(fā)病率不斷上升。研究發(fā)現(xiàn)，針灸治療可減輕TBI的繼發(fā)性損害，改善患者預(yù)后，具有獨(dú)特的療效。前期研究發(fā)現(xiàn)電針對(duì)TBI大鼠的療效較佳，且常選腧穴為百會(huì)、水溝、曲池、內(nèi)關(guān)、足三里、涌泉[3-4]，本研究以TBI模型大鼠為研究對(duì)象，以電針為干預(yù)手段，通過(guò)檢測(cè)TBI大鼠損傷腦組織PI3K/AKT通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)量，探討電針對(duì)TBI大鼠的治療效應(yīng)及作用機(jī)制，為針灸治療TBI的科研和臨床研究提供一些參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選用SPF級(jí)雄性SD大鼠160只，購(gòu)自四川成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[批號(hào)SCXK(川)2015-030]，平均體重(200±20)g。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》[5]。飼養(yǎng)環(huán)境12 h明暗交替、恒溫恒濕，自由飲水、普通飲食常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器：戊巴比妥鈉(批號(hào)096956-001)，Anti-PI3K p85α mouse IgG antibody(批號(hào)sc-374534)，Anti-AKT1/2/3 rabbit IgG antibody(批號(hào)BM4400)，HRP-Goat anti-rabbit IgG(H+L)(批號(hào)HS101-01)，HRP-Goat anti-mouse IgG(H+L)(批號(hào)HS201-01)，抗熒光衰減封片劑(批號(hào)P0126)，腦立體定位儀(ST-3ND型)，4 ℃低溫離心機(jī)(5804型)，恒溫水浴鍋(HH420型)，生物組織全自動(dòng)脫水機(jī)(YD-12P2型)，華佗牌無(wú)菌針灸針(0.32 mm×15 mm)，DM6000電動(dòng)多功能直立熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建模及分組：將160只大鼠隨機(jī)分為空白組、假手術(shù)組、模型組、電針組、電針加阻斷組、阻斷劑組，除空白組外，其余每組30只。大鼠禁食禁水6 h后造模，腹腔注射80 mg/kg的1%戊巴比妥鈉麻醉，將大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀上，剃毛、消毒、切開(kāi)皮膚、剝離骨膜，暴露左側(cè)頂骨，用微型磨鉆在冠狀縫后3 mm、失狀縫左側(cè)旁約2.5 mm處鉆一骨窗(r≈2 mm)，用改良Feeney自由落體撞擊法創(chuàng)傷腦實(shí)質(zhì)[6]，腦創(chuàng)傷后止血，創(chuàng)口處滴注硫酸慶大霉素注射液5滴預(yù)防感染，縫合頭皮，回籠[7]。模型組、電針組按以上方法造模，空白組不做處理，假手術(shù)組大鼠僅顱骨鉆孔，不損傷腦實(shí)質(zhì)，阻斷劑組、電針加阻斷組通過(guò)藥物進(jìn)行PI3K/AKT通路阻斷，參照張慧、Endo等[8-9]研究方法，在造模過(guò)程開(kāi)顱形成骨窗后，用微量注射器自腦組織表面垂直進(jìn)針，進(jìn)針深度約2.5 mm，緩慢注入10 μl阻斷劑(DMSO溶液稀釋的LY294002溶液，濃度為10 μmol/L)，注射時(shí)間約5 min，緩慢退針，阻斷劑注射完成3 min后，再行自由落體撞擊法制造TBI大鼠模型；電針組、模型組同法注入等量DMSO溶液；其余各組不做處理；阻斷劑組及電針加阻斷組大鼠在每次電針前尾靜脈注射LY294002稀釋液10 μl[10-12]。造模后以改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分[13]評(píng)定大鼠即刻神經(jīng)功能，7～12分為模型制備成功。

1.2.2 干預(yù)方法：空白組、假手術(shù)組、模型組正常飼養(yǎng)，不予電針干預(yù)。電針組、電針加阻斷組于造模后24 h予電針，參照中國(guó)針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)分會(huì)制定的《常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位定位圖譜》及《大鼠穴位圖譜的研制》[14]定位，取大鼠百會(huì)、水溝及右側(cè)足三里、涌泉、內(nèi)關(guān)、曲池穴針刺，常規(guī)消毒后，用一次性針灸針(規(guī)格0.32 mm×15 mm)向后平刺百會(huì)約3 mm、向上平刺水溝3 mm，曲池、內(nèi)關(guān)、足三里、涌泉均直刺約3 mm，各穴進(jìn)針后均勻捻轉(zhuǎn)行針3～5次，接電針儀(華佗牌SDZ-Ⅱ型)，曲池、內(nèi)關(guān)穴接一組電極，足三里、涌泉穴接另一組電極，斷續(xù)波，頻率2 Hz，強(qiáng)度1 mA，時(shí)間15 min，1次/d，共14 d。

1.2.3 免疫熒光法檢測(cè)大鼠腦組織PI3K、AKT蛋白表達(dá)：除空白組外，各組大鼠電針后3、7、14 d取材并采用免疫熒光法檢測(cè)TBI大鼠損傷腦組織中PI3K、AKT蛋白的表達(dá)，空白組在造模后14 d取材檢測(cè)。取材：麻醉成功后常規(guī)左心室冰0.9%氯化鈉溶液灌注、斷頭并于冰上取損傷腦組織，常規(guī)4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋及切片備用。免疫熒光檢測(cè)：由檸檬酸三鈉3 g加檸檬酸0.4 g加雙純水1000 ml配制抗原修復(fù)液，常規(guī)烤片、脫蠟、抗原修復(fù)，PBS溶液以1∶10比例稀釋濃縮型血清封閉液封閉，37 ℃孵育，孵一抗，4 ℃過(guò)夜，復(fù)溫后，PBST溶液洗滌10 min，2次，PBS溶液洗滌5 min，4次，孵二抗，37 ℃溫育，PBST溶液洗滌5 min，2次，PBS溶液洗滌5 min，4次，滴加PBS稀釋的SABC-FITC溶液(1∶100)，37 ℃溫育，PBST溶液洗滌5 min，2次，PBS溶液洗滌5 min，4次，避光，用DAPI染色液對(duì)細(xì)胞核輕度復(fù)染，37 ℃溫育，PBST溶液洗滌5 min，2次，PBS溶液洗滌5 min，4次，抗熒光衰減封片劑封片，最后在熒光顯微鏡下觀察并攝片，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)免疫熒光(IF)圖像進(jìn)行處理，統(tǒng)計(jì)目標(biāo)蛋白的表達(dá)量，PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平以熒光圖像中陽(yáng)性反應(yīng)著色點(diǎn)的IF-OD值表示。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腦組織PI3K相對(duì)表達(dá)量比較 見(jiàn)表1。電針后3、7、14 d，假手術(shù)組與空白組PI3K表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。模型組PI3K表達(dá)低于假手術(shù)組，高于阻斷劑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。電針后3 d，電針組PI3K表達(dá)與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。電針后7、14 d，電針組PI3K表達(dá)均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。電針后3、7、14 d，電針組PI3K表達(dá)均高于電針加阻斷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。阻斷劑組PI3K表達(dá)與電針加阻斷組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠腦組織PI3K相對(duì)表達(dá)量比較

2.2 各組大鼠腦組織AKT相對(duì)表達(dá)量比較 見(jiàn)表2。電針后14 d，假手術(shù)組與空白組AKT表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組各時(shí)間點(diǎn)AKT表達(dá)低于假手術(shù)組，高于阻斷劑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。電針后3 d，電針組AKT表達(dá)與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；電針后7、14 d，電針組AKT表達(dá)均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。電針后3、7、14 d，電針組AKT表達(dá)均高于電針加阻斷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。阻斷劑組AKT表達(dá)與電針加阻斷組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

表2 各組大鼠腦組織AKT相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

《內(nèi)經(jīng)》中關(guān)于腦損傷的相關(guān)記載：“有所擊墮，惡血留內(nèi)”，TBI后，因跌仆損傷導(dǎo)致氣血逆亂及氣血瘀阻，進(jìn)而蒙蔽清陽(yáng)、升降失司、痰濕內(nèi)生，瘀血與痰濕阻滯經(jīng)絡(luò)。腦為“髓?！薄霸裰薄爸T陽(yáng)之會(huì)”，若瘀血阻滯腦絡(luò)，則可引起升降失調(diào)，五臟六腑之精氣不得上升，髓海失養(yǎng)而空虛，出現(xiàn)頭暈、面色蒼白、煩躁不安、神昏等癥。TBI后的治療在急性期以急救、最大限度地保住患者生命為主，而康復(fù)期的治療重點(diǎn)是對(duì)TBI引起的神經(jīng)、認(rèn)知、肢體運(yùn)動(dòng)功能障礙等后遺癥的治療[15-16]。腦損傷與氣滯、氣虛、血瘀阻滯腦絡(luò)導(dǎo)致髓海失養(yǎng)、氣機(jī)逆亂關(guān)系密切?！皻狻焙汀把笔窍嗷ヒ来妗⑾嗷プ躺?，顱腦受外傷后必然引起腦部出血，甚至全身多部位出血，那么就會(huì)出現(xiàn)“氣隨血脫”之“脈微欲絕，大汗淋漓，面色蒼白”等重癥，此時(shí)TBI的救治主要以補(bǔ)血益氣固脫為主。隨著病程的推進(jìn)，顱腦損傷的康復(fù)期患者會(huì)出現(xiàn)氣虛血瘀或氣滯血瘀之“頭痛、頭暈、惡心、神志不清、言語(yǔ)不清、偏癱”等癥，此時(shí)的治療以疏通經(jīng)絡(luò)，益氣活血，化瘀止痛為主。TBI后會(huì)引起腦組織出血、水腫、腦血管痙攣，進(jìn)而出現(xiàn)腦循環(huán)障礙，然而TBI后腦神經(jīng)細(xì)胞的生理病理變化較為復(fù)雜，包括神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、氧自由基的產(chǎn)生、鈣調(diào)節(jié)機(jī)制的損傷、線粒體功能的障礙、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞壞死凋亡等。隨著外科急救水平的更新和提高，TBI的病死率大幅下降，但是患者的致殘率卻在逐漸增加，TBI患者康復(fù)期出現(xiàn)的精神障礙、肢體運(yùn)動(dòng)功能障礙、自主神經(jīng)功能紊亂等各種并發(fā)癥非常棘手，為探索本病的優(yōu)勢(shì)治療方案意義重大。

針灸療法“簡(jiǎn)、便、廉、驗(yàn)”，尤其是刺激量可控的電針，可疏通經(jīng)絡(luò)、活血化瘀、調(diào)整陰陽(yáng)、醒神開(kāi)竅，在治療TBI等神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面優(yōu)勢(shì)明顯。研究發(fā)現(xiàn)，電針可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的自噬及凋亡從而減輕腦組織缺血再灌注損傷，刺激與神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)的生長(zhǎng)因子EGF、bFGF的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化并縮小顱腦損傷的面積[17-20]。此外，在TBI早期介入針灸可以抑制炎癥反應(yīng)，減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)TBI大鼠腦神經(jīng)功能的康復(fù)[21-22]。研究表明，成年大鼠腦組織AKT微量表達(dá)，TBI后1 h內(nèi)p-AKT表達(dá)開(kāi)始增加，在損傷皮質(zhì)邊緣區(qū)其免疫反應(yīng)性增強(qiáng)，全腦組織中p-AKT區(qū)域表達(dá)的差異可能導(dǎo)致細(xì)胞損傷程度的不同，PI3K/AKT信號(hào)通路參與調(diào)控TBI的病理過(guò)程，p-AKT的表達(dá)量與腦損傷程度有關(guān)[23]。本研究選用治療TBI的優(yōu)選腧穴百會(huì)、水溝、曲池、內(nèi)關(guān)、足三里、涌泉，百會(huì)、水溝屬督脈醒腦開(kāi)竅、回陽(yáng)救逆，曲池、內(nèi)關(guān)可疏調(diào)經(jīng)絡(luò)、活血通脈，足三里、涌泉補(bǔ)益氣血、溝通陰陽(yáng)，諸穴共奏通經(jīng)活絡(luò)、調(diào)和陰陽(yáng)、醒腦開(kāi)竅之功，促進(jìn)腦損傷的康復(fù)[24]。本研究結(jié)果顯示，電針治療后7、14 d電針組PI3K、AKT表達(dá)量高于模型組、阻斷劑組，提示電針可促進(jìn)TBI大鼠損傷腦組織中PI3K、AKT蛋白表達(dá)。PI3K/AKT信號(hào)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活中起至關(guān)重要的作用，蛋白激酶B磷酸化后可以激活Bad和Forkhead等一系列下游靶蛋白抑制細(xì)胞凋亡，上調(diào)細(xì)胞存活率[25]。本研究從PI3K/AKT通路關(guān)鍵蛋白PI3K、AKT角度對(duì)電針治療TBI模型大鼠的效應(yīng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，探索了電針治療TBI大鼠的效應(yīng)機(jī)制，為T(mén)BI的實(shí)驗(yàn)研究提供思路。然而，本研究?jī)H探索了通路的關(guān)鍵蛋白，下一步將以本實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)深入研究，探索針灸治療腦損傷的效應(yīng)機(jī)制。