張宇豪，陳楊菲，陳友鈴，吳文珊

(福建師范大學生命科學學院，福建省發(fā)育與神經(jīng)生物學重點實驗室，福建 福州 350117)

榕屬植物是亞熱帶森林生態(tài)系統(tǒng)的重要組成成分，共有750多種.榕樹的花序是閉合的隱頭花序，需要傳粉榕小蜂為其授粉，兩者在長期的協(xié)同進化中形成了適應性結構[1-4].榕小蜂特殊的頭部構造能頂開榕花序外苞片，通過苞口通道進入花序，產(chǎn)卵于雌花子房，并為大量雌花授粉，榕小蜂子代在雌花的胚珠中生長，在花序成熟時榕小蜂也發(fā)育至成蟲期，離開花序前榕小蜂已在花序內(nèi)完成了交配并取得了大量花粉，用于為新的花序傳粉，這種互利共生的關系已被人們熟知.在日常采樣中發(fā)現(xiàn)，細葉榕(FicusmicrocarpaLinn.f.)雄花期榕果數(shù)量極高，但其中大量榕果出飛的傳粉榕小蜂(Eupristinaverticillata)寥寥無幾，榕果內(nèi)的種子數(shù)量也極少.已有研究結果表明：建群蜂進入雌花期花序的時間越遲，形成的種子數(shù)量和子代數(shù)量越少[5-8]；但Ding等[9]在鈍葉榕(F.curtipes)雌花期不同時機為花序引入傳粉榕小蜂，研究結果表明建群蜂進入雌花期花序的時間越遲種子數(shù)量越少，但子代數(shù)量呈現(xiàn)為先增加后減少的趨勢；而Anstett[10]在對榕樹(F.pertusaL.)的研究中認為，雌花期初期花序對榕小蜂的吸引力最強，但進蜂花序的子代數(shù)和種子數(shù)最少.本實驗在細葉榕雌花期不同發(fā)育階段，利用人工放蜂實驗引入細葉榕傳粉榕小蜂，觀測花序生長過程中子代榕小蜂的發(fā)育狀態(tài)，探究建群蜂進入花序的時機不同對榕-蜂繁殖效益的影響.

1 研究方法

實驗樣地位于福建省福州市閩侯縣上街鎮(zhèn)(119°20′31E,26°03′12N).2020年9月15日，在樣地內(nèi)選擇1株株內(nèi)發(fā)育較為同步的細葉榕，其花序(直徑約1 mm，去掉太大或太小的)尚處于總苞片包裹中，用120目的尼龍網(wǎng)袋進行套袋，阻隔傳粉榕小蜂進入花序傳粉或產(chǎn)卵，阻隔非傳粉榕小蜂產(chǎn)卵，排除昆蟲、鳥類等其它因素對花序發(fā)育的影響.每10個花序一袋，共計套袋1 200個花序，將花序分為6組(組1-6)，每組200個花序.

每日觀測并拍照記錄苞片和雌花的發(fā)育狀態(tài)，將花序突破總苞時設定為實驗第1天，在花序突破總苞后的第3天，取下組1花序的套袋尼龍網(wǎng)，換上裝有當日收集的榕小蜂的尼龍網(wǎng)(在樣地內(nèi)采集雄花期的細葉榕花序，置于120目的尼龍網(wǎng)中，待榕小蜂自然出飛后，剔除非傳粉榕小蜂和體型太大或者太小的傳粉榕小蜂，每個尼龍網(wǎng)儲藏100頭榕小蜂)，按花序數(shù)∶榕小蜂=1∶10的比例引入傳粉榕小蜂；此后在第5、7、9、11、13天，依次為組2、3、4、5、6的花序引入傳粉榕小蜂，在花序發(fā)育第13天，直至榕小蜂不再進入花序，停止放蜂.每組放蜂的花序，在引入傳粉榕小蜂的24 h后取回花序解剖觀察，花序腔內(nèi)有傳粉榕小蜂記為已進蜂(排除死于苞口或苞片層，未進入花序腔的榕小蜂)，統(tǒng)計進蜂率=進蜂花序數(shù)/花序總數(shù)×100%.

1.1 5齡幼蟲期和成蟲期榕小蜂死亡率統(tǒng)計

每日鏡檢已進蜂榕果內(nèi)榕小蜂幼蟲發(fā)育狀態(tài)，在花序突破總苞的第28-34天幼蟲發(fā)育至5齡，記錄單果存活幼蟲數(shù)，空癭數(shù)(幼蟲在幼蟲期已死亡)；花序突破總苞第40-46天，建群蜂子代出飛，鏡檢蟲癭，將已出飛榕小蜂或已化蛹的榕小蜂記為存活，僅?？瞻`、蟲癭內(nèi)存在榕小蜂干枯的外骨骼或腐爛的尸體記為成蟲期子代死亡.

(1)記錄5齡幼蟲期榕小蜂幼蟲死亡率=5齡期死亡幼蟲/(5齡期死亡幼蟲+5齡期存活幼蟲數(shù))×100%；

(2)記錄成蟲期榕小蜂死亡率=成蟲期榕小蜂死亡數(shù)/(成蟲期榕小蜂死亡數(shù)+存活榕小蜂數(shù))×100%.

1.2 雄花期花序內(nèi)榕小蜂、種子、敗育花的取樣與統(tǒng)計

每日檢查能夠進蜂的花序組內(nèi)榕小蜂幼蟲發(fā)育狀態(tài)，花序突破總苞第40天發(fā)育至雄花期，此時花序變大變軟，部分花序變紅，花序內(nèi)雄花成熟伸展至花序腔中心.在傳粉榕小蜂已發(fā)育成熟且未出飛前采回花序，置于解剖鏡下解剖花序，統(tǒng)計傳粉榕小蜂雌、雄蜂子代數(shù)，空癭數(shù)，種子數(shù)，敗育花數(shù)，并計算：

(1)蟲癭總數(shù)=雌蜂數(shù)+雄蜂數(shù)+空癭數(shù)；

(2)雌花總數(shù)=敗育花+蟲癭總數(shù)+種子數(shù)；

(3)存活子代數(shù)=雌蜂數(shù)+雄蜂數(shù)；

(4)子代性比=雄蜂/(雌蜂+雄蜂)；

(5)雌花利用率=(蟲癭數(shù)+種子數(shù))/(蟲癭數(shù)+種子數(shù)+敗育花數(shù))×100%；

(6)造癭率=蟲癭總數(shù)/雌花總數(shù)×100%；

(7)結實率=種子數(shù)/雌花總數(shù)×100%.

1.3 自然出飛的子代榕小蜂體型測量

在花序突破總苞第40 d進入雄花期，傳粉榕小蜂已發(fā)育成熟且未出飛前，取回花序，在實驗室內(nèi)收集幾個組自然出飛的榕小蜂子代雌蜂，放至低溫下凍死后取出置于載玻片上攤開側放，使用生物顯微鏡(Olympus BX51)、顯微成像系統(tǒng)(SteREOlumar V12)對榕小蜂子代拍攝，使用測量軟件(Image-Pro Plus)測量榕小蜂子代體長.

利用Excel2016和SPSS21軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析和作圖.

2 結果

2.1 不同時機放蜂的花序狀態(tài)和進蜂情況

花序在發(fā)育過程中，雌花和苞片形態(tài)不斷發(fā)生變化.6個實驗組引入榕小蜂時的雌花狀態(tài)、苞片形態(tài)和進蜂情況如下：組1花序尚處于雌前期，雌花花柱和柱頭直挺，柱頭表面光滑(圖1，A)，外苞片將苞口完全封閉，中間苞片間隙大，內(nèi)苞片在花序腔疏松排列(圖1，B)，此時榕小蜂無法進入花序；組2花序已處于雌花期初期，花柱和柱頭出現(xiàn)小角度彎折，柱頭表面出現(xiàn)乳狀突起(圖1，C)，外苞片開裂，裂口平整，螺旋狀排列層疊緊密，中間苞片間隙小，四周的內(nèi)苞片向中間靠攏(圖1，D)，此時進蜂率22%，進蜂果的單果進蜂量均為1頭；組3花序處于雌花期中期，雌花花柱和柱頭大角度彎折，柱頭表面遍布乳狀突起(圖1，E)，外苞片輕微上翹，中間苞片層疊疏松，內(nèi)苞片在花序腔相互交疊(圖1，F(xiàn))，此時進蜂率100%，平均單果進蜂量1.6頭，單個花序最多有3頭榕小蜂進入.組4花序同樣處于雌花期中期，柱頭伸長盤繞，柱頭表面遍布的乳狀突起伸長(圖1，G)，外苞片變?yōu)槠秸?，中間苞片保持疏松層疊，內(nèi)苞片相互交織(圖1，H)，此時進蜂率100%，平均單果進蜂量1.4頭；組5花序處于雌花期末期，柱頭上伸長的突起出現(xiàn)輕微粘連的現(xiàn)象(圖1，I)，外苞片平整，中間苞片層疊密集，內(nèi)苞片分離，不再呈交疊狀(圖1，J)，此時進蜂率44%，平均單果進蜂量1頭；組6花序處于末花期，柱頭失水，雌花期伸長的突起變?yōu)檎尺B狀(圖1，K)，外苞片封閉，中間苞片間隙大，內(nèi)苞片分離(圖1，L)，此時榕小蜂無法進入花序.依據(jù)雌花、苞片形態(tài)和花序進蜂情況，表明細葉榕雌花期時長為7 d.

A: 組1雌花；B: 組1苞片；C: 組2雌花；D: 組2苞片；E: 組3雌花；F: 組3苞片；G: 組4雌花；H: 組4苞片；I: 組5雌花；J: 組5苞片；K: 組6雌花；L: 組6苞片(ob: 外苞片outer bract；mb: 中間苞片middle bract；ib: 內(nèi)苞片inside bract)

2.2 建群蜂進入花序的時機不同對造癭數(shù)和子代榕小蜂存活率的影響

從表1可以看出，建群蜂在雌花期中期進入花序，其造癭數(shù)較高，但其子代的死亡率也較高.子代5齡幼蟲期死亡率較高(15%～17%)，可能是幼蟲期發(fā)育需要攝入大量營養(yǎng)，在資源利用的爭奪中，獲取營養(yǎng)能力差的子代大量死亡.

表1 建群蜂造癭數(shù)及子代榕小蜂的存活情況

而從5齡幼蟲發(fā)育至羽化出飛時死亡率僅為7.8%～9.0%，且鏡檢表明均為空蟲癭殼，未發(fā)現(xiàn)子代的尸體或幾丁質外殼殘留，即5齡幼蟲期發(fā)育至成蟲期過程中死亡的子代，都集中在化蛹階段，化蛹過程中蟲體會發(fā)生劇烈的生理變化，因而導致大量集中死亡，成功進入蛹期的榕小蜂至羽化出飛前不再發(fā)生較大的形態(tài)變化亦不再需要進食，因此幾乎不發(fā)生死亡.

2.3 建群蜂進入花序的時機不同對雌花利用率和榕果產(chǎn)出的影響

由表2可以看出，建群蜂在雌花期中期進入花序時，造癭率和結實率均達到最高；雌花期中期的兩個組，較早進入花序的組3，造癭率、結實率要高于組4；雌花期初期造癭率小于雌花期中期，結實率與雌花期中期的組4不存在顯著性差異；雌花期末期造癭率與結實率極顯著小于雌花期中期.

表2 建群蜂進入花序的時機不同對雌花利用率和榕果產(chǎn)出的影響

建群蜂在雌花期中期進入花序時，雌花利用率最高；在雌花期末期進蜂時結實率較低，導致雌花利用率極顯著低于雌花期初期；建群蜂在任何時機進入花序，形成的蟲癭數(shù)均多于種子數(shù).

2.4 建群蜂進入花序的時機不同對榕小蜂子代的影響

由表3可以看出，當建群蜂在雌花期中期進入花序產(chǎn)卵時，其子代數(shù)量高，體長較長；當建群蜂在雌花期初、末期進入花序產(chǎn)卵時，兩者之間的子代數(shù)量無顯著差異，但顯著低于雌花期中期，其中子代雄蜂數(shù)差異不顯著，子代數(shù)量的變化主要表現(xiàn)在雌蜂數(shù)量的極顯著減少，這也直接導致了雌花期中期產(chǎn)卵的性比低于雌花期初期和雌花期末期；當建群蜂在雌花期初、末期進入花序產(chǎn)卵時，兩者之間的子代體長無顯著差異，但極顯著低于雌花期中期.

表3 進蜂時機對子代發(fā)育的影響(單果)

3 討論

本研究通過人工控制傳粉榕小蜂進入花序時機，確定了細葉榕雌花期時長為7 d.從不同時機花序結構、進蜂率可以看出，外苞片開裂是傳粉榕小蜂進入花序的前提，在花序發(fā)育過程中苞片依次從封閉、開裂、松散后又回復緊閉狀態(tài)，直接影響榕-蜂繁殖成功的概率.花序發(fā)育不同階段產(chǎn)生不同組成和濃度的揮發(fā)物，是傳粉榕小蜂對花序趨避行為的主要影響因子[5]，結合榕-蜂繁殖效率表明，雌花期中期為最佳進蜂時機.雌花期初期和末期進蜂，均導致進蜂率、造癭數(shù)(雌蜂數(shù))、子代體長的極顯著下降，而雌花期末期進蜂的榕果的結實率較初期極顯著下降.

3.1 雌花期初、末期進蜂對榕-蜂繁殖效益的影響

雌花期初期的花序苞口未完全開放、雌花未全部成熟，而雌花期末期的花序苞口開始閉合、雌花開始萎蔫，均造成建群蜂進入花序的難度加大，花序釋放的揮發(fā)物對榕小蜂的吸引力減小，建群蜂進入花序內(nèi)需耗費更多時間和體力[6,11-12]，因此進入雌花期初期、末期花序的榕小蜂在花序內(nèi)用于產(chǎn)卵和授粉的壽命減少[13]，從而導致造癭數(shù)和結實率極顯著下降.雌花期初期的花序腔狹小，可能限制了復雜的產(chǎn)卵行為[14]，而對相對簡單的主動傳粉行為沒有顯著的影響[15]；雌花期末期的花序腔雖然增大，但衰老的雌花柱頭出現(xiàn)失水粘連現(xiàn)象，阻礙了榕小蜂產(chǎn)卵[16]，失水的柱頭即使被授粉，花粉粒也難以萌發(fā)，極易敗育，實驗結果表明柱頭失水粘連對授粉的影響顯著大于造癭.

3.2 影響子代榕小蜂發(fā)育的因素

進蜂1-3頭的細葉榕榕果，其榕小蜂在幼蟲期或化蛹期的死亡率并沒有顯著差異，表明榕果提供的營養(yǎng)物質是榕小蜂存活的限制因子，因此在雌花期中期單果進蜂數(shù)更多的榕果的榕小蜂死亡率更高；由于建群蜂進入花序后先產(chǎn)雄性后代[17]，子代雄蜂優(yōu)先獲得營養(yǎng)資源，且雄蜂發(fā)育周期比雌蜂短[18]，因此不同進蜂時機的子代雄蜂死亡率變異小，而子代雌蜂的死亡率波動大.

榕小蜂體長受遺傳和營養(yǎng)攝入影響[19-21]，雌花期初、末期的外苞片層疊緊密，阻礙了個體較大的榕小蜂鉆入，所以，被苞口篩選后的“小型”建群蜂的子代體長較?。婚判》涞纳L發(fā)育依賴子房組織提供營養(yǎng)，雌花期初期尚未完全生長的胚珠，以及雌花期末期開始敗育的胚珠，均不利于榕小蜂獲取養(yǎng)分.