古炳明，黃惠琳

1 梅州市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)所，廣東 梅州 514011；2 嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，廣東 梅州 514011

喉痛靈顆粒由野菊花、板藍(lán)根、荊芥穗和水牛角濃縮粉組成，有清熱解毒、消炎利咽等功效，常用于治療慢性咽喉炎、急性化膿性扁桃體炎、感冒咽喉發(fā)熱、上呼吸道炎、疔瘡等。目前該藥的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》第五冊(cè)，僅有性狀與三個(gè)理化鑒別，無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)目［1］。曾小平等曾以薄層色譜法對(duì)板藍(lán)根和荊芥穗進(jìn)行定性鑒別，用高效液相色譜法測(cè)定野菊花中蒙花苷的含量［2］。胡恩建立高效液相色譜法測(cè)定喉痛靈顆粒中腺苷的含量［3］，但上述研究均為單指標(biāo)含量分析，單一指標(biāo)難以真實(shí)反映中藥的質(zhì)量情況。野菊花、荊芥穗為方中投料量較大的藥物，野菊花中含有綠原酸、蒙花苷、木犀草苷等活性成分，荊芥穗中則含迷迭香酸、木犀草苷等成分［4-6］。研究證實(shí)綠原酸、蒙花苷、木犀草苷、迷迭香酸均有一定的抗炎、抗氧化等作用［7-10］，對(duì)上述指標(biāo)進(jìn)行含量測(cè)定以反映方中野菊花及荊芥穗的投料情況；因此本研究旨在通過建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定綠原酸、木犀草苷、迷迭香酸及蒙花苷四種活性成分的含量，以期加強(qiáng)對(duì)喉痛靈顆粒的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AB204-N 型萬(wàn)分之一電子分析天平（梅特勒-托利多公司）；Sartorius BP 211D 十萬(wàn)分之一電子分析天平（賽托利斯公司）；LC-20AT 型液相色譜儀（日本島津公司）；ULUP-I-10T 型純水/超純水機(jī)（西安優(yōu)普儀器設(shè)備有限公司）；KQ-250DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品綠原酸（批號(hào)：110753-201817，含量以96.8%計(jì)）；木犀草苷（批號(hào)：111720-201810，含量以93.5%計(jì)）；迷迭香酸（批號(hào)：111871-201706，含量以90.5%計(jì)）；蒙花苷（批號(hào)：111528-201710，含量以96.6%計(jì)）；均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。喉痛靈顆粒：廣西A 公司（批號(hào)：181001、190302、190204、190504），廣州B 公司（批號(hào)：8341A04），河北C 公司（批號(hào)：04A181103）。色譜級(jí)甲醇（天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司，批號(hào)：633379-05653），磷酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20180520）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：CAPCELL PAK C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～30 min，7%～45% A；30～45 min，45%～80% A；45～55 min，7% A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：334 nm；流速：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備

分別精密稱取綠原酸對(duì)照品6.45 mg，木犀草苷對(duì)照品11.53 mg，迷迭香酸對(duì)照品11.44 mg，蒙花苷對(duì)照品4.96 mg，置20 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 混合對(duì)照品溶液的制備

分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液各1 mL，置同一10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備

取喉痛靈顆粒研細(xì)，取2.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放至室溫，再次稱重，以甲醇補(bǔ)充減失質(zhì)量，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.5 陰性樣品的制備

按喉痛靈顆粒處方，稱取缺野菊花和荊芥穗的藥材適量按其生產(chǎn)工藝，制成不含上述藥材的陰性樣品。按“2.4”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制成陰性樣品溶液。

2.6 專屬性試驗(yàn)

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果：供試品色譜圖中綠原酸、木犀草苷、迷迭香酸和蒙花苷的色譜峰分離度良好，與對(duì)照品溶液色譜峰保留時(shí)間一致，理論塔板數(shù)均大于1×105，且陰性樣品無(wú)干擾，見圖1。

圖1 混合對(duì)照品（A）、喉痛靈顆粒供試品（B）、缺野菊花和荊芥穗陰性樣品（C）的HPLC圖

2.7 線性關(guān)系考察

取“2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣1、2、5、10、15、20 μL，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，測(cè)出其峰面積。以對(duì)照品進(jìn)樣質(zhì)量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程及線性范圍。結(jié)果見表1。

表1 4種成分的回歸方程和線性范圍（n=6）

2.8 精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 針，記錄各自的峰面積，根據(jù)峰面積計(jì)算得綠原酸、木犀草苷、迷迭香酸和蒙花苷峰面積的RSD 值分別為0.29%、0.32%、0.31%、0.24%。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取批號(hào)181001 喉痛靈顆粒樣品6 份，制備供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定峰面積，計(jì)算得綠原酸、木犀草苷、迷迭香酸和蒙花苷含量的RSD 值分別為1.30%、1.14%、0.70%、0.98%。

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取批號(hào)181001 喉痛靈顆粒樣品6 份，制備供試品溶液，在0、2、4、8、24 h 分別進(jìn)樣，記錄各自的峰面積，計(jì)算得綠原酸、木犀草苷、迷迭香酸和蒙花苷峰面積RSD 值分別為1.00%、1.11%、1.01%、1.44%。

2.11 加樣回收試驗(yàn)

取批號(hào)181001 喉痛靈顆粒樣品6 份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入混合對(duì)照品溶液（含綠原酸156.09 μg/mL，木犀草苷269.51 μg/mL，迷迭香酸254.27 μg/mL，蒙花苷119.78 μg/mL）1.0 mL，按“2.4”項(xiàng)下制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算綠原酸、木犀草苷、迷迭香酸和蒙花苷平均回收率分別為99.02%、100.12%、99.83%、98.95%，RSD 值分別為0.50%、0.32%、0.29%、1.34%，見表2。

表2 加樣回收結(jié)果

2.12 樣品測(cè)定

取6 批喉痛靈顆粒，分別制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算各成分的含量，結(jié)果見表3。由表中數(shù)據(jù)可知，不同廠家間、同一個(gè)廠家不同批次產(chǎn)品中綠原酸、木犀草苷、迷迭香酸和蒙花苷的含量差異較大。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 洗脫條件的建立

本研究曾參照梁健麗等［11］采用HPLC 法同時(shí)測(cè)定野菊花配方顆粒中綠原酸、咖啡酸和蒙花苷的方法，發(fā)現(xiàn)待測(cè)物對(duì)于洗脫溶液的梯度變化較敏感，經(jīng)多次微調(diào)后最終確定了“2.1”項(xiàng)下的洗脫方式，但流速為1.0 mL/min 時(shí)木犀草苷與雜質(zhì)峰分離度不足1.5，后將流速降低至0.8 mL/min 后分離度在1.5以上且各目標(biāo)峰的峰形良好。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取對(duì)照品溶液，在200～400 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行DAD 全波長(zhǎng)掃描分析，綠原酸在326 nm 處有最大吸收，木犀草苷在350 nm 處有最大吸收，迷迭香酸在329 nm 處有最大吸收，蒙花苷在334 nm 處有最大吸收，各目標(biāo)物最大吸收波長(zhǎng)相近且在334 nm處均有較大吸收，色譜峰尖銳且塔板數(shù)均在1×105以上，最終選定檢測(cè)波長(zhǎng)為334 nm。

3.3 含量結(jié)果分析

本研究測(cè)定了3 個(gè)廠家的6 個(gè)批次的喉痛靈顆粒，由表3 可知，3 個(gè)廠家的6 個(gè)批次樣品均能測(cè)出綠原酸、木犀草苷、迷迭香酸、蒙花苷，且含量存在一定的差異。通過對(duì)比由廣西A 公司生產(chǎn)的4個(gè)不同批次的喉痛靈顆粒，其中批號(hào)190204 中綠原酸、迷迭香酸、蒙花苷的含量較其他3 個(gè)批次的高，且蒙花苷的含量是批號(hào)190504 的近2 倍，說明喉痛靈顆粒不同廠家間、同一個(gè)廠家不同批次間綠原酸、迷迭香酸、蒙花苷含量差異較大，有必要通過制定標(biāo)準(zhǔn)以加強(qiáng)其質(zhì)量控制。

4 結(jié)論

本研究建立的HPLC 同時(shí)測(cè)定喉痛靈顆粒中綠原酸、木犀草苷、迷迭香酸、蒙花苷含量的方法，各色譜峰可有效分離、重現(xiàn)性良好且方便快捷，可為進(jìn)一步提升喉痛靈顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法提供參考依據(jù)。