馬玉蘭，曹 萍,2,3，馬志杰,3*，陳生梅,2,3，李瑞哲,2,3，劉書(shū)杰，郭東風(fēng)

(1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧 810016；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部青藏高原畜禽遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016；3.青海省高原家畜遺傳資源保護(hù)與創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016；4.青海省格爾木市唐古拉山鎮(zhèn)獸醫(yī)站，青海 格爾木 816099)

牦牛(Bosgrunniens)是青藏高原及其毗鄰高地的特有牛種，為當(dāng)?shù)啬撩裉峁┤?、奶、毛、絨、皮和燃料等生活必需品，對(duì)青藏高原多元民族文化的發(fā)展起著至關(guān)重要的作用[1]。唐古拉山鎮(zhèn)位于青海省西南部，其西、南與西藏那曲藏族自治州毗鄰，東、北隔馬蘭馬拉山與當(dāng)曲和玉樹(shù)藏族自治州的治多、雜多兩縣接壤，該地區(qū)地勢(shì)高峻,海拔4 500 m以上,屬三江源自然保護(hù)區(qū)，年均氣溫-2.8 ℃[2]。據(jù)研究報(bào)道[3]，唐古拉山牦牛群體中含野血牦牛的比例高達(dá)25%以上，因此，唐古拉山牦牛具有抗逆性強(qiáng)、生長(zhǎng)發(fā)育速度快、產(chǎn)肉量高等特點(diǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示[4]，唐古拉山鎮(zhèn)共有草場(chǎng)721.13 hm2，牦牛2萬(wàn)多頭，其中能繁母畜占50%以上，擁有豐富的牦牛遺傳資源。

線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、突變率高和不容易發(fā)生重組等特點(diǎn)，因此被廣泛運(yùn)用于哺乳動(dòng)物母系遺傳多樣性、起源進(jìn)化、群體結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育等研究[5]。當(dāng)前，基于mtDNA D-loop區(qū)、Cyt b和16S rRNA等基因以及mtDNA全序列核苷酸變異對(duì)野牦牛及部分家牦牛品種(群體)的母系遺傳多樣性、群體結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系等前人已做了大量的研究。賴(lài)松家等[6]、郭松長(zhǎng)等[7]、宋喬喬等[8]、Yue X P等[9]、Li G Z等[10]、李靜等[11]基于mtDNA D-loop序列變異對(duì)我國(guó)多個(gè)家、野牦牛品種(群體)分析表明，大多數(shù)牦牛品種(群體)都存在2個(gè)高度分化的母系支系且具有豐富的母系遺傳多樣性，提示牦牛存在2個(gè)母系起源。與此同時(shí)，Wang Z F等[12]、Wang X D等[13]、Ma Z J等[14]和李廣禎等[15]對(duì)我國(guó)部分牦牛品種(群體)mtDNA全序列遺傳變異的分析表明，家、野牦牛品種(群體)具有豐富的母系遺傳多樣性，但系統(tǒng)發(fā)育分析確定了3個(gè)大的母系支系，提示牦牛有3個(gè)母系起源。然而,當(dāng)前尚未見(jiàn)對(duì)青海省唐古拉山牦牛群體母系遺傳方面的研究報(bào)道。本研究對(duì)唐古拉山牦牛群體mtDNA D-loop區(qū)序列變異進(jìn)行母系遺傳多樣性分析，以揭示其群體遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育分析，明確唐古拉山牦牛品種分子遺傳多樣性、遺傳關(guān)系及分化狀況，為開(kāi)展牦牛分子遺傳資源的評(píng)估、保護(hù)與利用以及牦牛的品種培育和改良提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 采樣與基因組DNA提取

本實(shí)驗(yàn)采集了來(lái)自青海省海西蒙古族藏族自治州格爾木市唐古拉山鎮(zhèn)52頭牦牛的頸靜脈血，ACD抗凝后帶回實(shí)驗(yàn)室。采樣采取隨機(jī)抽樣法，樣本采集前詢問(wèn)牧戶、查閱牦牛群體的系譜記錄，確保樣品具有代表性。使用基因組DNA試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)提取基因組DNA后，雙重檢測(cè)DNA濃度和純度后-20 ℃保存?zhèn)溆??！?/p>

1.2 引物合成、PCR擴(kuò)增與測(cè)序

參照先前在野牦牛[14]中的研究報(bào)道，合成一對(duì)引物用以擴(kuò)增唐古拉山牦牛的mtDNA D-loop區(qū)序列，引物由上海生工生物工程有限公司合成，其中包括上游引物(PF)：5′-CTACAGTCTCACCGTCAACC-3′和下游引物(PR)為5′-GGGGTGTAGATGCTTGC-3′。

PCR擴(kuò)增體系(25 μL)：超純水9.5 μL，2xPremix 12.5 μL，基因組DNA和上、下游引物各1 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，31個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，后送PCR純化產(chǎn)物在北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用BioEdit 7.2.5[16]和DnaSP 5.10.01[17]軟件進(jìn)行核苷酸多序列比對(duì)分析，后確定唐古拉山牦牛群體的核苷酸序列多態(tài)位點(diǎn)。Arlequin 3.5.2.2[18]軟件用來(lái)計(jì)算其單倍型多樣度和核苷酸多樣度大小，以揭示群體的母系遺傳多樣性水平。使用MEGA 5.05[19]軟件基于鄰接法(neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)以探究唐古拉山牦牛單倍型(組)間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，用以揭示其母系遺傳背景。

2 結(jié)果與分析

2.1 唐古拉牦牛mtDNA D-loop區(qū)序列變異分析

52頭唐古拉山牦牛619 bp mtDNA D-loop區(qū)序列分析顯示，其A+T含量為58.57%，G+C含量為41.43%，存在明顯的核苷酸組成偏倚性。序列比對(duì)分析排除2處插入(缺失)位點(diǎn)后，共檢測(cè)到31處多態(tài)位點(diǎn)；在31處多態(tài)位點(diǎn)中，包括5處單一多態(tài)位點(diǎn)(即85、174、254、255和445位點(diǎn))和26處簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)(即21、60、67、99、114、120、175、182、183、193、202、219、222、224、235、236、237、243、252、260、282、317、318、324、427和465位點(diǎn))(圖1)。研究確定了13種單倍型，其中20個(gè)個(gè)體共享H1單倍型，其為優(yōu)勢(shì)單倍型。6個(gè)個(gè)體共享H7和H9單倍型，4個(gè)個(gè)體共享H2和H10單倍型，3個(gè)個(gè)體共享H3和H11單倍型，其余單倍型均由1個(gè)個(gè)體共享。

注：N表示共享同一種單倍型的個(gè)體數(shù)；“.”表示與H1單倍型序列中的核苷酸相同；Hg表示單倍型組類(lèi)型。

2.2 唐古拉山牦牛的母系遺傳多樣性分析

多序列比對(duì)分析計(jì)算結(jié)果表明，唐古拉山牦牛群體mtDNA D-loop區(qū)核苷酸多樣度和單倍型多樣度分別為0.007±0.004和0.821±0.043。與已報(bào)道的野牦牛及我國(guó)其他18家牦牛品種相應(yīng)遺傳多樣性指數(shù)值相比(表1)，唐古拉山牦牛群體的遺傳多樣性指數(shù)值均較低，表明其母系遺傳多樣性水平較低。

表1 唐古拉山牦牛與我國(guó)其他19個(gè)家、野牦牛品種(群體)母系遺傳多樣性指數(shù)值比較

2.3 唐古拉山牦牛的系統(tǒng)發(fā)育分析

以先前報(bào)道中代表牦牛3個(gè)母系支系的D-loop區(qū)序列(即支系I(GenBank No.：FJ548844)、支系II(GenBank No.：FJ548843)和支系III(GenBank No.：DQ139202))作為參考序列[14]，并將美洲野牛(Bison bison)的D-loop序列(GenBank No：EU177871)作為外群，NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果顯示：唐古拉山牦牛的13種單倍型序列和支系I、支系II的2條參考序列分別聚在一起，形成2個(gè)大的母系遺傳分支(圖2)，其中支系Ⅰ包括單倍型H1、H2、H6、H7、H8、H11、H12、H13、H10、H4、H5和H9，占92.3%；而支系Ⅱ包括單倍型H3，占7.6%。13種單倍型屬于4種單倍型組，分別為A、B、D和E(圖2)，且分別占69.2%、15.3%、7.6%和7.7%；其中A單倍型組包括9種單倍型(即H1、H2、H6、H7、H8、H11、H12、H13和H10單倍型)，B單倍型組只有2種單倍型(即H5和H9單倍型)，而D和E單倍型組分別包括單倍型H3和H4。

圖2 唐古拉山牦牛系統(tǒng)發(fā)育分析

3 討 論

遺傳多樣性能夠有效反映動(dòng)物群體遺傳變異的豐富程度，單倍型多樣度和核苷酸多樣度是衡量動(dòng)物分子遺傳多樣性水平的重要指標(biāo)[28]。先前的研究表明，野牦牛及我國(guó)多數(shù)家牦牛品種都具有豐富的母系遺傳多樣性，其中野牦牛群體的單倍型多樣度在0.957～0.967之間[9,12,14,27]，而家牦牛品種的單倍型多樣度在0.621～1.000[6-8,10-11,13,19-26]之間。在本研究中，唐古拉山牦牛群體的核苷酸多樣度值和單倍型多樣度分別為0.007±0.004和0.821±0.043。與我國(guó)其他家牦牛品種(群體)(即天祝、甘南、九龍、類(lèi)烏齊、帕里、斯布、昌臺(tái)、金川、麥洼、木里、中甸、巴州、青海高原、環(huán)湖、大通、雪多、玉樹(shù)、帕米爾)和野牦牛相比[6-14,19-27]，唐古拉山牦牛的群體核苷酸多樣度和單倍型多樣度值均較低，表明唐古拉山牦牛群體具有較貧乏的母系遺傳變異，遺傳多樣性水平較低。究其原因，可能與該群體所處的生存環(huán)境、選育歷史及選擇程度、遺傳漂變等因素相關(guān)，究其原因有待今后作進(jìn)一步深入探究。

牦牛的系統(tǒng)發(fā)育研究可以明確其進(jìn)化歷史和遺傳背景，有利于牦牛遺傳資源的保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用[14]。先前多數(shù)針對(duì)我國(guó)野牦牛及家牦牛品種(群體)的系統(tǒng)發(fā)育研究顯示：牦牛擁有2個(gè)母系支系，推測(cè)可能有2個(gè)母系起源[6-8,10-11,13,19-26]。然而，近年來(lái)部分研究者如Wang Z F等[12]、Wang X D等[13]和Ma Z J等[14]基于線粒體基因組對(duì)我國(guó)家、野牦牛的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，牦牛擁有3個(gè)母系支系，其中共享第Ⅰ、Ⅱ支系的家、野牦牛個(gè)體較多，而第Ⅲ支系中僅有少量野牦牛和雪多、格爾木牦牛個(gè)體的存在，推測(cè)牦牛有3個(gè)母系起源。在本研究中，唐古拉山牦牛的13種單倍型分布在A、B、D和E 4種單倍型組中，所占比例依次為69.2%、15.3%、7.6%和7.6%，說(shuō)明A單倍型組是其優(yōu)勢(shì)單倍型組。同時(shí)，這13種單倍型聚為2個(gè)大的母系支系，故推測(cè)唐古拉山牦牛有2個(gè)母系起源，這與野牦牛及多數(shù)家牦牛品種(群體)的研究結(jié)果基本一致。

4 結(jié) 論

唐古拉山牦牛群體核苷酸多樣度為0.007±0.004，單倍型多樣度為0.821±0.043，其母系遺傳多樣性水平較低，其中單倍型H2為優(yōu)勢(shì)單倍型，A單倍型組是其優(yōu)勢(shì)單倍型組，由2個(gè)母系支系組成，推測(cè)其可能有2個(gè)母系起源。