姚春馨，梁明泰，馬淵浩，劉家迅，張紹松，陳 霞，田果廷

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，昆明 650205；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所，昆明 650205)

【研究意義】白肉靈芝(Ganodermaleucocontextum)[1]在全國的栽培起步較晚，2012年成功實現(xiàn)人工栽培[2]，2014年才開始有栽培報道[3]。段木埋土栽培是白肉靈芝一種重要的栽培模式，段木為靈芝的生長提供豐富的營養(yǎng)成分，覆土能穩(wěn)定料中的濕度，維持良好的通氣性。但3～5年連年栽培后容易引發(fā)嚴(yán)重病害、子實體畸形以及產(chǎn)量品質(zhì)下降等類似“單一連作障礙”的現(xiàn)象[4]，謝榮等[5]研究發(fā)現(xiàn)，連作障礙甚至影響白肉靈芝總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)的下降。近年來，云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物所在云南昆明阿子營基地開展白肉靈芝-云白靈芝品種推廣示范，采用“大棚內(nèi)段木菌種埋入并覆土多年多茬采芝”的栽培模式，該模式不僅低污染、易控制、產(chǎn)量高，還能節(jié)省物料和人工成本，其子實體多糖、總?cè)坪枯^高，經(jīng)濟效益顯著。針對其連作障礙出現(xiàn)的病原性和生理性病害，目前采用換新土的方式，連作障礙嚴(yán)重造成土地資源浪費和成本增加，同時也制約了云南白肉靈芝產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】連作障礙主要因素包括土壤生物、物理和化學(xué)因子的改變，土壤微生物種群特性的變化，作物根部產(chǎn)物的自毒作用，以及某些致病菌的增殖[6-7]。馬紅梅等[8]采用選擇性培養(yǎng)基計數(shù)三大主要微生物類群，證實連作使靈芝土壤微生物區(qū)系的結(jié)構(gòu)和數(shù)量發(fā)生了改變。靈芝連作的主要病原菌有青霉、綠霉、曲霉、毛霉、鏈孢霉等[9]。黃鑫偉等[10]確定了引起靈芝綠霉病的病原菌為側(cè)耳木霉。靈芝黃腐病是導(dǎo)致靈芝減產(chǎn)的主要病害，子實體不形成或僅有少量形成，芝蓋畸形[7]，該病原菌通過栽培土壤傳播危害巨大[11-13]，靈芝腐敗木生紅曲霉菌也是其中之一[14]?！颈狙芯壳腥朦c】當(dāng)前相關(guān)靈芝屬連作障礙的研究報道主要集中在低海拔沿海地區(qū)適宜高溫高濕環(huán)境條件的赤芝(G.lingzhi)這一物種。本項目以自主育成的極具高原特色的中低溫型靈芝品種-白肉靈芝(G.leucocontextum)為材料，以段木埋土栽培的連作障礙為科學(xué)問題，試圖通過原位篩選優(yōu)勢菌開展土傳病原菌的分離?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究分析不同栽培年限土壤三大微生物類群的變化，以土壤稀釋培養(yǎng)法分離白肉靈芝連作土優(yōu)勢微生物，并采用平板對峙試驗篩選白肉靈芝潛在的土傳病原菌，對探究段木埋土栽培白肉靈芝的病害防控具有重要的實踐和理論意義，還能為解決靈芝生產(chǎn)的連作障礙提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 土樣 2021年9月白肉靈芝子實體采收結(jié)束后采集土壤樣本，以基地內(nèi)未栽靈芝的大棚內(nèi)土壤作為對照[處理T0(CK)]，選取段木埋土栽培模式下的不同年限：連栽1年(處理T1)、3年(處理T3)、5年(處理T5)，共4組覆土層土壤。每組隨機選5個采樣點，除去表土，采集深度3 cm、直徑5 cm范圍內(nèi)的土壤，組成混合土樣200 g。全部樣本均4 ℃低溫保藏，24 h之內(nèi)進(jìn)行后續(xù)處理。

1.1.2 培養(yǎng)基 細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，真菌采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基，放線菌采用高氏一號培養(yǎng)基。

1.2 試驗方法

1.2.1 微生物分離 稱取1 g土樣用無菌水梯度稀釋，取10-3、10-4、10-5稀釋液0.1 mL，設(shè)3個重復(fù)涂布于培養(yǎng)基表面，倒置放入37 ℃(細(xì)菌)和28 ℃(真菌、放線菌)恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)菌培養(yǎng)24 h，長出單菌落；真菌培養(yǎng)3～5 d；放線菌培養(yǎng)5～7 d。記錄各平板的菌落總數(shù)，計算不同土壤樣品每克的菌落數(shù)。選取來源于處理T3、處理T5連作土的土樣培養(yǎng)平板，挑單菌落劃線純培養(yǎng)，做優(yōu)勢菌的分離。

1.2.2 優(yōu)勢微生物的鑒定 菌株純化后，觀察優(yōu)勢微生物的微宏觀表型特征，包括細(xì)菌、放線菌和真菌的菌落和菌體形態(tài)。細(xì)菌采用革蘭氏染色，顯微觀察菌體個體形態(tài)并分類。各菌種經(jīng)純化，用TSINGKE植物DNA通用型試劑盒提取基因組DNA并保存。采用細(xì)菌通用引物16s 27F/1492R、真菌通用引物 ITS1/ITS4 對供試菌株分別擴增。PCR 引物合成和擴增產(chǎn)物測序由擎科生物(昆明)完成，序列經(jīng)雙向測通并拼接處理，在NCBI上進(jìn)行比對，并選擇最大相似序列用來建樹。利用Clustalx進(jìn)行多序列比對，結(jié)果導(dǎo)入MEGA 6.0軟件進(jìn)行聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹圖。結(jié)合形態(tài)學(xué)及生理學(xué)特征，確定菌株物種。

1.2.3 可培養(yǎng)土傳病原菌的拮抗性篩選 以白肉靈芝YGL6菌株為指示菌，將分離的細(xì)菌、放線菌、真菌各菌株采用平板對峙培養(yǎng)法進(jìn)行拮抗性試驗，開展白肉靈芝土壤潛在致病菌的篩選。用直徑為6 mm的打孔器取生長良好的YGL6菌株，接入PDA平板一側(cè)，于24 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。取培養(yǎng)后生長良好的靈芝平板，處理組在距靈芝菌塊邊緣3 cm處劃線接入活化24 h的病原菌，不接病原菌的作為對照組，3次重復(fù)。24 ℃恒溫繼續(xù)培養(yǎng)，第5天開始采用十字交叉劃線法測量菌落直徑，連續(xù)測量10 d，獲得菌絲的日均長速(mm/d)，按下式計算抑菌率以測定病原菌對靈芝菌絲生長影響。

抑菌率(%)=[(對照菌落長速-處理菌落長速) / 對照菌落長速]×100

1.2.4 統(tǒng)計方法 采用統(tǒng)計軟件SPSS Statistics 19.0 對數(shù)據(jù)作顯著性檢驗，WPS進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同栽培年限白肉靈芝土壤三大微生物類群差異

白肉靈芝覆土層土壤可培養(yǎng)微生物計數(shù)結(jié)果顯示，不同栽培年限的覆土層土壤可培養(yǎng)的細(xì)菌、放線菌、真菌的數(shù)量和占比差異顯著。處理T1的微生物數(shù)量最多，且細(xì)菌、放線菌、真菌數(shù)量均較多，與處理T0(CK)相比，總數(shù)增長近2.6倍。處理T3、處理T5的微生物數(shù)量則小于處理T0(CK)，隨著連作栽培年限的延長，主要微生物數(shù)量有下降趨勢，特別是放線菌，處理T3降幅達(dá)77.11%，處理T5未檢出；細(xì)菌下降30.37%～51.90%；真菌降幅不明顯。

如圖1所示，處理T1與處理T3三大微生物類群占比無明顯差異，細(xì)菌與放線菌接近1∶1，與處理T0(CK)相比，放線菌占比下降近26%。隨著連作栽培年限的增加，三大微生物類群占比以放線菌優(yōu)勢趨于細(xì)菌優(yōu)勢，細(xì)菌占比逐年增加，放線菌占比逐年下降，真菌占比最少但逐年增加。

圖1 白肉靈芝土壤可培養(yǎng)微生物三大類群占比Fig.1 The proportion of three groups of culturable microorganisms in G. leucocontextum soil

2.2 白肉靈芝覆土層土壤優(yōu)勢微生物種群分析

2.2.1 各菌株形態(tài)與生理特征 連作土中分離到14個優(yōu)勢菌落做純培養(yǎng)，進(jìn)行微宏觀形態(tài)觀察。

N2在PDA平板上菌落黏質(zhì)生長，形態(tài)不規(guī)則，邊緣不整齊，中間呈溝壑狀凸起，氣生菌絲，分支有隔。N3在PDA平板上菌落平坦，中央呈橙黃色，外圍呈白色，生長過程出現(xiàn)同心圓，質(zhì)氈狀，分枝狀氣生菌絲，內(nèi)有隔。N4在PDA平板上菌落較大，圓形，中間青灰色，邊緣白色；氣生菌絲，菌絲偏細(xì)，呈帚狀分枝，卵型孢子。N5在PDA平板上菌落正面平展，毛氈狀，邊緣較稀疏，菌落反面呈淡黃色，有向心褶皺及半透明螺紋，菌絲呈半透明狀，具少量小而光滑孢子囊。N7在PDA平板上菌落呈絨毛狀，雙輪生，中后期呈四層，由內(nèi)到外為青橙黃白。菌絲分支，有膈，呈典型帚枝狀，頂端孢子放射式生長。

圖2-b 中9個優(yōu)勢細(xì)菌菌株：N1在牛肉膏蛋白胨平板上菌落呈毛氈狀、絮狀或繩索狀，菌落初生白色，后變?yōu)榛疑?，分生孢子梗分支。N6菌落呈同心圓生長，菌體灰白色，中間褶皺，呈放射狀向外生長，外緣整齊，菌絲偏細(xì)，帚狀分枝。N8菌落圓形生長，質(zhì)地粘稠，邊緣光滑，中心淡黃色，邊緣乳白色，革蘭氏陰性，桿狀，菌體較小。N9菌落呈短絨狀生長，質(zhì)地干燥，白色，邊緣有淡黃色物質(zhì)溢出，氣生菌絲，稍短，菌絲枝狀，未見隔。N10菌落呈圓形，邊緣呈花邊狀，中間隆起，質(zhì)地干燥，菌絲白色，后期轉(zhuǎn)灰褐色，放射狀氣生菌絲。N11在平板上不規(guī)則生長，菌落乳白色，光滑不透明，邊緣有小凸起，基生菌絲，菌絲有分支。N12菌落扁平，灰白色，表面無光澤，略微干燥，邊緣不規(guī)則，四周皺褶隆起，革蘭氏陽性，菌體短桿狀，呈圓形或橢圓形。N13在平板上不規(guī)則生長，菌落呈褶皺狀，不透明，邊緣不光滑，革蘭氏陽性，短桿狀，內(nèi)生芽孢。N14在平板上不規(guī)則生長，菌落呈褶皺狀，不透明，邊緣不光滑，革蘭氏陽性，桿狀，芽孢內(nèi)生。

a.5個優(yōu)勢真菌；b.9個優(yōu)勢細(xì)菌a.Five dominant fungal species; b.Nine dominant bacterial species圖2 優(yōu)勢菌菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of the dominant microorganisms

部分真菌菌株的菌絲結(jié)構(gòu)如圖3所示；細(xì)菌則進(jìn)一步進(jìn)行革蘭氏染色等生理生化鑒定，部分菌株的染色結(jié)果如圖4所示。

圖3 優(yōu)勢真菌顯微結(jié)構(gòu)Fig.3 Microscopic structure of dominant fungal species

圖4 細(xì)菌芽孢Fig.4 Some bacterial spores

2.2.2 各菌株的分類鑒定 各菌株DNA擴增子測序經(jīng)GenBank序列比對，基于最大相似法進(jìn)行聚類分析，MEGA構(gòu)建14個菌株與近似物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹圖(圖5)。各菌株與最相似模式物種遺傳距離極近，表明測試菌株與模式菌株對應(yīng)序列具有極大的相似度，物種鑒定可信度高；步長檢驗顯示，14個菌株間遺傳距離較遠(yuǎn)，在較低的相似度水平所有菌株分成細(xì)菌與真菌2個組，組間遺傳距離較遠(yuǎn)，說明具有較大的遺傳差異。

圖5 14個菌株及近似種的NJ聚類Fig.5 Dendrogram of 14 strains and related species

根據(jù)分子生物學(xué)鑒定結(jié)論，結(jié)合供試菌株的微宏觀表型特征、生理生化試驗等形態(tài)分類結(jié)果，得出優(yōu)勢菌株的物種鑒定。從表1可見，9個細(xì)菌菌株中有4株鏈霉菌屬、3株芽孢桿菌屬Bacillussp.、1株貪銅菌屬和1株紅球菌屬；5個真菌菌株則分屬不同屬。

表1 菌株測序克隆序列與其 GenBank 最相似序列的比對

2.3 白肉靈芝土傳病原菌的篩選

采用對峙試驗法，將白肉靈芝YGL6與14個優(yōu)勢菌在 PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，與對照組比較，部分處理組白肉靈芝菌落直徑差異明顯(圖6)。

圖6 部分土壤微生物與白肉靈芝菌絲間的對峙實驗Fig.6 Experiment of confrontation between some soil microorganisms and G. leucocontextum mycelia

覆土微生物中分離到N7、N11、N9、N12、N13、N14共6個菌株，對照組與處理組差異顯著(P<0.05)，抑菌率高達(dá)80%以上(表2)。綜合菌株鑒定結(jié)果，覆土微生物種群中的芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、籃狀菌屬(Talaromycessp.)、紅球菌屬(Rhodococcussp.)和部分鏈霉菌屬(Streptomycessp.)可能是白肉靈芝連作中的土傳病原菌。其中，N7菌株[籃狀菌屬(Talaromycessp.)]是真菌，其他幾個抑制菌為細(xì)菌。

表2 土壤微生物對白肉靈芝菌絲生長的影響

3 討 論

3.1 白肉靈芝連作栽培對土壤三大微生物數(shù)量的影響

目前食用菌連作障礙的研究主要集中在栽培土壤方面，土壤環(huán)境或培養(yǎng)基質(zhì)中微生物顯著影響食用菌的生長發(fā)育[15-17]，土壤微生物是生長發(fā)育過程中的重要參與者，是土壤生態(tài)系統(tǒng)中關(guān)鍵的構(gòu)成要素。土壤微生物區(qū)系變化及其數(shù)量的增減通常是評價土壤質(zhì)量的一個指標(biāo)[18]。土壤微生物區(qū)系的失衡與連作障礙聯(lián)系密切。連作改變了土壤細(xì)菌、真菌和放線菌群落結(jié)構(gòu)，與土壤的生物、物理、化學(xué)特性的變化一同形成了特殊的環(huán)境，因此解析連作覆土中微生物群落的變化對防治連作障礙具有重要指導(dǎo)意義。余世金等[19]研究表明，茯苓栽培前后土壤微生物總數(shù)下降，其中細(xì)菌數(shù)量增加2.3%，放線菌和真菌則分別降低52.6%、66.8%。目前，還有許多研究發(fā)現(xiàn)，在竹蓀[20]、靈芝[21]等食用菌連作栽培后，土壤菌群逐漸由“細(xì)菌型”向“真菌型”變化。本研究中白肉靈芝段木埋土栽培后，隨著連作年限的增加，土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量和種群發(fā)生變化，除了連作1年土壤中細(xì)菌、放線菌、真菌數(shù)量增長之外，連作3年、5年后細(xì)菌、放線菌的數(shù)量下降趨勢明顯，真菌數(shù)量逐年增加，表明靈芝連作栽培使土壤中由細(xì)菌參與的營養(yǎng)分解與轉(zhuǎn)換等代謝減少，由真菌引起的次生代謝物等病源物增加，這與大多數(shù)作物生產(chǎn)連作障礙的“營養(yǎng)減少、病蟲害增加”的癥狀表現(xiàn)一致。三大主要微生物類群中，細(xì)菌占比與真菌占比逐年增加，放線菌逐年下降，表明白肉靈芝段木埋土的連作栽培影響了區(qū)域內(nèi)土壤的微生態(tài)，導(dǎo)致土壤理化失衡，有效營養(yǎng)降低。針對白肉靈芝連作土壤微生物區(qū)系的物種結(jié)構(gòu)、多樣性分析等，則需要借助擴增子測序等技術(shù)開展深入研究。

3.2 對白肉靈芝菌絲生長具抑制作用的土傳病原菌

Kang等[22]基于形態(tài)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，發(fā)現(xiàn)木霉屬與靈芝連作的黃腐病有關(guān)；馬紅梅等[6]發(fā)現(xiàn)大田優(yōu)勢菌群[如梭菌屬(Clostridium)、產(chǎn)堿菌屬(Alkaligenes)、芽孢桿菌屬(Bacillus)等]對連作障礙靈芝菌絲體有較強的化感作用；袁源等[23]通過Illumina MiSeq平臺分析靈芝連作覆土中真菌和細(xì)菌群落的變化，認(rèn)為青霉屬可能是引發(fā)靈芝連作障礙的重要菌群，而覆土中鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、厭氧粘細(xì)菌(Anaeromyxobacter)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、脫氯菌屬(Dehalococcoides)等有益細(xì)菌相對豐度下降與靈芝連作障礙有關(guān)?？梢?，靈芝連作障礙與土壤基質(zhì)中微生物的變化具有明顯的相關(guān)性。采用實驗室可培養(yǎng)方式在白肉靈芝覆土層土壤中分離的優(yōu)勢微生物中，能抑制白肉靈芝菌絲生長的多個菌株為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、籃狀菌屬(Talaromycessp.)、紅球菌屬(Rhodococcussp.)和部分鏈霉菌屬(Streptomycessp.)。

本研究分離到的這一抑菌型真菌菌株N7，籃狀菌屬(Talaromycessp.)廣泛應(yīng)用于工業(yè)、醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)，作為生物防治的微生物能幫助植物對抗病原菌，產(chǎn)幾丁質(zhì)酶，從而抑制黃萎病菌、核盤菌和立枯病菌的細(xì)胞壁生成，并且還能抑制鏈格孢菌、鐮刀菌和稻瘟病菌的孢子萌發(fā)和菌絲伸長，其次級代謝產(chǎn)物及抑菌活性研究相繼開展[24-25]。平板上與白肉靈芝菌絲的對峙試驗也證實了該菌株的抑菌性。

芽孢桿菌(Bacillussp.)為產(chǎn)孢桿菌，屬于好氧性細(xì)菌，對土壤的肥力有影響，解磷解鉀功效顯著，常被用來生產(chǎn)生物有機肥[20]。其中，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)抗逆性強，其耗氧、產(chǎn)枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短桿菌肽等活性物質(zhì)；解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)在生長過程中也產(chǎn)生一系列能抑制真菌和細(xì)菌活性的代謝物；貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)是芽孢桿菌屬的一個新種，亦具有廣譜抗菌活性。芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)主要有抗生素、抗菌蛋白等，抑菌機理主要包括拮抗、競爭、溶菌、誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性等方式[20]。芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有促進(jìn)植物生長和抵御病原微生物作用，成為動植物生產(chǎn)中的一類益生菌。在食用菌的栽培中，張月珠等人研究發(fā)現(xiàn)，巨大芽孢桿菌對竹蓀菌絲生長具有明顯抑制作用[26]，本研究中芽孢桿菌屬的多個菌株在靈芝栽培上也表現(xiàn)抑制生長的特性，這可能與其生長過程中分泌的幾丁質(zhì)酶等抑菌物質(zhì)抑制了大型真菌菌絲體的生長有關(guān)。另外，芽孢桿菌作為生防菌的一類，其中的短小芽孢桿菌對靈芝哈茨木霉病害又有較好的抑制作用[27]，因此，要確認(rèn)芽孢桿菌屬不同物種對白肉靈芝是否有抑制作用，在栽培生產(chǎn)上是否成為病原菌則需要進(jìn)一步深入研究，多方面綜合研判。

本研究中紅球菌屬(Rhodococcussp.)菌株和部分鏈霉菌屬(Streptomycessp.)菌株對白肉靈芝菌絲體的生長顯示為抑制，這與大部分放線菌對于真菌的抑菌作用結(jié)果一致[28]。邱孜博等[29]研究認(rèn)為，紅平紅球菌(R.erythropolis)含有獨特的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、大型基因組與環(huán)狀質(zhì)粒，可分泌大量活性酶，因其脫硫作用而被應(yīng)用于環(huán)境污染物的降解。在與靈芝菌絲體的對峙培養(yǎng)中表現(xiàn)抑菌作用，可能與該菌合成或轉(zhuǎn)化形成的化合物影響了靈芝生長有關(guān)。纖維黃鏈霉菌(S.celluloflavus)則是纖維素酶與幾丁質(zhì)酶的高產(chǎn)菌株，直接影響了白肉靈芝的正常生長[30]。

值得注意的是，白肉靈芝本身作為大型真菌的一種，參與了有機質(zhì)的分解與合成，在土壤碳代謝和氮循環(huán)中起著重要作用。雖然放線菌大多產(chǎn)抗生素類物質(zhì)，作為生防菌廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生物防控；芽胞桿菌能提高土壤肥力并有效抑制病原菌生長，成為廣譜益生菌。但是在靈芝栽培中，土壤中的微生物與靈芝爭奪營養(yǎng)，次生產(chǎn)物抑制菌絲生長從而影響靈芝的產(chǎn)量和品質(zhì)，提示靈芝等食用菌的生產(chǎn)過程中不能盲目施用益生菌、生防菌等生物藥肥。針對主要病害與防治還需進(jìn)一步分離和鑒定致病菌，通過毒力測試等手段篩選殺菌劑和重點防控措施[31-32]。

4 結(jié) 論

白肉靈芝連作顯著影響了覆土微生物區(qū)系，不同栽培年限的土壤三大微生物種群差異顯著，可培養(yǎng)微生物數(shù)量和種群發(fā)生變化，隨著栽培年限的增長，連作土壤中細(xì)菌、放線菌數(shù)量下降趨勢明顯，真菌數(shù)量逐年增加。三大主要微生物類群中，細(xì)菌占比與真菌占比逐年增加，放線菌則反之。

白肉靈芝連作土分離的優(yōu)勢微生物中，篩選到能抑制靈芝菌絲生長的多個菌株，認(rèn)為微生物種群中的芽孢桿菌屬(Bacillus)、籃狀菌屬(Talaromyces)、紅球菌屬(Rhodococcus)和部分鏈霉菌屬(Streptomyces)菌株可能是白肉靈芝段木埋土栽培連作障礙中潛在的土傳病原菌。不過，進(jìn)一步確定靈芝連作障礙的土傳病原微生物，還需結(jié)合不同的菌株特性，經(jīng)化感試驗、生產(chǎn)驗證等深入研究作出綜合評估。