劉 江, 劉 剛, 曾益春, 代 潔, 危 玲, 姚永權(quán), 佟萬紅, 唐清霞, 黃蓋群

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所, 四川 南充 637000)

【研究意義】轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factors, TFs)又稱反式作用因子，在植物應(yīng)激調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和信號傳導(dǎo)通路等關(guān)鍵性生理反應(yīng)中扮演著重要作用，是植物中普遍存在的重要調(diào)節(jié)因子之一[1-2]。轉(zhuǎn)錄因子是能與順式作用元件及蛋白發(fā)生特異性結(jié)合的一類蛋白，能對基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行精確調(diào)控[3]。目前，已有60多種轉(zhuǎn)錄因子在植物中被報道[4]，主要包括WRKY[5-6]、Bzip[7]、MYB[8]、MADS-box[9]和GATA[10]等。GATA轉(zhuǎn)錄因子是植物中重要的調(diào)控因子之一，能與DNA序列WGATAR (W為T或者A, R為G或者A) 特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)[11]，從而調(diào)控植物的生長發(fā)育過程，如調(diào)控葉綠素合成、影響花朵發(fā)育、調(diào)控物質(zhì)代謝[12]及調(diào)控抗逆脅迫[13]等。【前人研究進(jìn)展】Reyes等[14]研究發(fā)現(xiàn)，GATA 家族基因的DNA基序參與了光依賴和硝酸鹽依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。此外，真菌GATA轉(zhuǎn)錄因子能調(diào)控氮代謝、光誘導(dǎo)、鐵載體生物合成和配對類型轉(zhuǎn)換[15]。GATA基因家族成員在許多植物中被鑒定及分析，如擬南芥(Arabidopsisthaliana)[16]、水稻(Oryzasativasubsp.japonica)[16]、谷子(Setariaitalica)[17]、煙草(Nicotianatabacum)[18]和玉米(Zeamays)[19]分別鑒定出30、28、33、57、37個基因成員，為探究GATA轉(zhuǎn)錄因子在其他植物中的生物學(xué)功能提供了參考。【本研究切入點(diǎn)】桑樹(Morusnotabilis)是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價值的樹種，主要分布于中國中部和南部[20]。桑樹不僅具有良好的經(jīng)濟(jì)價值，而且在生態(tài)保護(hù)中的重要性日益凸顯。近年來，蠶桑產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)布局逐步向西部地區(qū)轉(zhuǎn)移，大量桑樹將被種植于高寒、干旱、貧瘠的山地。因此，挖掘桑樹抗逆脅迫相關(guān)基因?qū)ε嘤购的屠涞目鼓嫘陨湫缕贩N具有重要的指導(dǎo)意義。目前，桑樹GATA轉(zhuǎn)錄因子的鑒定與分析及逆境脅迫相關(guān)的研究尚未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法，對桑樹全基因組范圍內(nèi)GATA轉(zhuǎn)錄因子家族成員進(jìn)行鑒定，系統(tǒng)地分析桑樹GATA基因蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系等。對掌握桑樹生長機(jī)制、良種選育和抗逆性等方面具有重要的理論和實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

桑樹全基因組數(shù)據(jù)從川桑(M.notabilis)全基因組數(shù)據(jù)庫(https://morus.swu.edu.cn/morusdb/)下載，擬南芥全基因組數(shù)據(jù)從植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫Plant TFDB(http://planttfdb.gao-lab.org/blast.php)下載。

1.2 桑樹GATA基因家族成員鑒定

GATA蛋白結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫模型文件(PF00320)從 Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)下載，作為參考序列[17]。采用HMMER 3.0軟件對川桑全基因組數(shù)據(jù)庫(https://morus.swu.edu.cn/morusdb/)進(jìn)行檢索，E值設(shè)置為1E-10，獲得候選序列。此外，通過在線軟件SMART和NCBI-CDD (https://www.ncbi.nlm.nih. gov/cdd/)檢測候選序列保守域的完整性，篩選出具有完整GATA結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。

1.3 桑樹GATA基因家族成員蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

利用在線軟件ExPASy中的ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)[21]分析桑樹GATA基因家族候選蛋白的分子量、氨基酸數(shù)、等電子量等理化性質(zhì)。采用在線軟件WoLF PSORT (https://wolfpsort.hgc.jp/)預(yù)測亞細(xì)胞定位[19]。

1.4 桑樹GATA基因家族成員系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

通過Clustal W軟件多重序列比對功能，對桑樹和擬南芥的GATA基因家族成員氨基酸序列進(jìn)行比對[22]，隨后利用MEGA 7軟件采用鄰接法(Neighbor joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap值設(shè)置為1000。

1.5 桑樹GATA家族基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析

利用TBtools(https://github.com/CJ-Chen/TBtools)和GSDS (http://gsds.gao-lab.org/)對桑樹GATA基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析并繪制基因結(jié)構(gòu)可視圖[23]。運(yùn)用在線工具M(jìn)EME (http://meme-suite.org/tools/meme)對桑樹GATA基因家族成員的蛋白保守基序進(jìn)行分析，設(shè)置motif數(shù)量為6。

1.6 桑樹GATA家族基因蛋白三級結(jié)構(gòu)和蛋白互作關(guān)聯(lián)分析

利用在線工具SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/interactive/)對鑒定出來的GATA蛋白序列進(jìn)行蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。通過在線網(wǎng)站STRING (https://cn.string-db.org/)對桑樹GATA蛋白成員進(jìn)行理論互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)分析。

1.7 桑樹GATA基因家族表達(dá)分析

通過川桑數(shù)據(jù)庫獲得GATA基因家族成員在各組織中的表達(dá)情況，包括根、表皮、葉片、冬芽和花5個組織。選擇FPKM值表示基因相對表達(dá)水平，利用TBtools繪制熱圖[24]。

1.8 桑樹GATA基因家族成員啟動子順式作用元件分析

通過工具BEDTools[25]獲得GATA基因上游2000 bp序列，利用數(shù)據(jù)庫PlantCARE (http://bioinformatics. psb.ugent.be/)[26]預(yù)測啟動子區(qū)域內(nèi)與脅迫相關(guān)的順式作用元件。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑樹GATA基因家族成員鑒定及序列分析

在桑樹全基因組中，共鑒定出23個GATA基因家族成員，基于基因組中基因編號大小對桑樹GATA基因家族成員進(jìn)行排序命名(表1)。桑樹GATA基因家族成員蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析顯示，23個MnGATAs蛋白的氨基酸長度為146 (MnGATA6)～820 aa (MnGATA7)，蛋白質(zhì)分子量為15.89 (MnGATA6)～93.06 kD (MnGATA7)，蛋白質(zhì)等電子量大小差異較大，為4.32 (MnGATA1)～10.53 (MnGATA5)。結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，桑樹GATA基因家族成員均僅含1個GATA結(jié)構(gòu)域。蛋白平均疏水指數(shù)均為負(fù)值，表明桑樹GATA轉(zhuǎn)錄因子均為親水性蛋白質(zhì)。23個MnGATAs蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示均位于細(xì)胞核，說明該家族基因主要在細(xì)胞核中發(fā)揮功能。

表1 桑樹GATA家族基因基本信息

2.2 桑樹GATA基因家族蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

構(gòu)建桑樹和擬南芥GATA基因家族成員蛋白質(zhì)的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1)。參考擬南芥GATA家族分類法加以改動，23個MnGATAs基因家族成員大致分成4個亞族，其中Class I中共存在8個基因(MnGATA2、MnGATA7、MnGATA8、MnGATA9、MnGATA18、MnGATA20、MnGATA21及MnGATA2)約占總基因成員的34.78%，Class II、Class III和Class IV分別包含4、6和5個家族成員。桑樹與擬南芥GATA基因家族成員在4個亞家族中的分布類似。從進(jìn)化樹分支上看，桑樹與擬南芥的GATA基因家族成員在各亞家族上的分布數(shù)占各自物種GATA基因總數(shù)比例不同，說明GATA基因家族在不同植物亞家族中聚類存在差異。

Mn. 桑樹； At. 擬南芥Mn. M.notabilis; At. Arabidopsis thaliana圖1 桑樹GATA轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of mulberry GATA transcription factor

2.3 桑樹GATA基因家族蛋白保守基序分析

GATA基因家族蛋白保守基序結(jié)果(圖2)顯示，同一亞族中的MnGATAs成員具有相似的保守基序，motif 1含有CX2CX18CX2C鋅指結(jié)構(gòu)域，所有桑樹GATA成員蛋白序列都包含motif 1。第I亞族成員共8個，motif 2和motif 5是該亞族所特有的保守基序。第Ⅱ亞族成員共4個，其保守基序數(shù)量在2～3個，4個成員都包含motif 1和motif 3。第III亞族的MnGATA6、MnGATA16、MnGATA17和MnGATA23蛋白僅含一個保守基序。第IV亞族是保守基序種類最豐富的亞族，具有4種保守基序，其中 motif 4是第Ⅳ亞族特有保守基序。

A. 保守基序分布; B. Motif結(jié)構(gòu)分析A. Conserved motif distribution; B. Motif structure analysis圖2 MnGATAs家族蛋白保守基序分布及Motif結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Distribution and motif structure analysis of conserved motifs in MnGATAs family proteins

2.4 桑樹GATA家族成員基因結(jié)構(gòu)分布

由GATA基因內(nèi)含子-CDS結(jié)構(gòu)模型(圖3)可知：MnGATAs家族成員均含有CDS，且同一亞族上的基因結(jié)構(gòu)除Class I外，Class II、Class III及Class IV基因結(jié)構(gòu)類似，各亞族之間存在明顯的差異。Class I亞族中MnGATA7含有的CDS數(shù)最多且具有較長的UTR結(jié)構(gòu)，Class II中的基因均包含UTR結(jié)構(gòu)，Class III上的基因CDS數(shù)量為2～5個，基因長度相對較短。同一亞族的桑樹GATA基因具有相似的CDS及內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，如Class II、Class III亞族上，基因的CDS及內(nèi)含子都極其相似。然而，并非所有同亞族的基因結(jié)構(gòu)都是相似的，如MnGATA7、MnGATA18、MnGATA20與同亞族的其他基因差異較大，同樣的情況在其他物種中也存在，如煙草[18]、高粱[27]等。

圖3 MnGATAs基因結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Analysis of MnGATAs gene structure

2.5 桑樹GATA蛋白三級結(jié)構(gòu)及蛋白互作關(guān)聯(lián)預(yù)測分析

桑樹GATA蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測如圖4所示，桑樹GATA蛋白包含α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲等空間構(gòu)象。此外，對比發(fā)現(xiàn)，整體蛋白三級結(jié)構(gòu)相似度不高，除MnGATA7結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜外，其他蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度一般，但同組進(jìn)化序列基因的結(jié)構(gòu)相似度較高。例如，CIass II中，MnGATA10、MnGATA11、MnGATA12和MnGATA13，CIass III中MnGATA5、MnGATA6、MnGATA23和MnGATA3、MnGATA16、MnGATA17都具有高度相似的蛋白結(jié)構(gòu)，表明蛋白結(jié)構(gòu)與物種進(jìn)化同源性有一定關(guān)聯(lián)。

圖4 MnGATA家族蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Prediction of tertiary structure of MnGATA family proteins

對桑樹GATA蛋白互作關(guān)聯(lián)預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，MnGATA2、MnGATA6、MnGATA8、MnGATA9、MnGATA12、MnGATA16、MnGATA17、MnGATA18、MnGATA19、MnGATA21、MnGATA22和MnGATA23 有網(wǎng)絡(luò)交叉聯(lián)系(圖5)，說明他們之間可能具有相似功能，對植物某些生理和生長發(fā)育等一系列過程可能具有協(xié)同調(diào)控作用。此外，并不是所有的桑樹GATA蛋白都有關(guān)聯(lián)，如MnGATA1、MnGATA3、MnGATA5、MnGATA7、MnGATA10和MnGATA113，暗示可能蛋白功能差異較大，說明同一家族成員在功能上存在一定差異。

圖5 桑樹GATA蛋白功能聯(lián)系網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Functional connection network of MnGATA protein

2.6 桑樹GATA基因家族成員表達(dá)模式分析

為闡明桑樹GATA基因在器官發(fā)育中的潛在作用，對其在桑樹5個組織器官(根、表皮、葉片、冬芽和花)中的表達(dá)譜進(jìn)行研究(圖6)。結(jié)果顯示，不同組織器官中桑樹GATA基因的組織表達(dá)模式存在顯著差異。MnGATA1、MnGATA4、MnGATA14和MnGATA15在桑樹5個組織中均有較高表達(dá)；MnGATA3、MnGATA5、MnGATA9、MnGATA16、MnGATA17、MnGATA21和MnGATA23在根部表達(dá)最高，在表皮次之；MnGATA2、MnGATA8、MnGATA10、MnGATA11、MnGATA12、MnGATA13和MnGATA22在各組織中幾乎不表達(dá)；MnGATA6、MnGATA7、MnGATA18和MnGATA19在各組織中存在少量表達(dá)。大部分桑樹GATA基因在根部具有較高的表達(dá)模式，表明桑樹GATA基因可能與桑樹根部發(fā)育和抗旱性密切相關(guān)。

圖6 桑樹GATA基因組織特異性表達(dá)分析Fig.6 The tissue expression of M.notabilis GATA genes

2.7 桑樹GATA家族基因啟動子區(qū)域中與脅迫相關(guān)順式元件分析

脅迫響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是植物響應(yīng)生物/非生物脅迫的一個重要方面，在啟動子區(qū)域內(nèi)的順式作用序列與轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合可以調(diào)控下游基因的表達(dá)情況[28]。本研究鑒定了MnGATAs啟動子區(qū)域可能響應(yīng)生物/非生物脅迫反應(yīng)的順式作用元件。

23個MnGATAs啟動子區(qū)域內(nèi)均含有應(yīng)激響應(yīng)相關(guān)順式作用元件(圖7)，如低溫響應(yīng)元件(LTR)、參與防御和應(yīng)激響應(yīng)的順式作用元件(DSR)，以及參與干旱誘導(dǎo)響應(yīng)元件(MDI)的MYB結(jié)合位點(diǎn)。此外，部分植物激素調(diào)節(jié)元件同樣被發(fā)現(xiàn)，如MeJA響應(yīng)元件(MeJARE)、生長素響應(yīng)元件(AUXRE)、脫落酸響應(yīng)元件(ABRE)、水楊酸響應(yīng)元件(SARE)及赤霉素響應(yīng)元件(GARE)。本研究中生物/非生物脅迫響應(yīng)元件的存在，表明MnGATAs可能受到各種脅迫的調(diào)控。前人研究表明，串聯(lián)重復(fù)在植物適應(yīng)快速變化的環(huán)境方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[29]。值得注意的是，9個MnGATAs(MnGATA3、MnGATA6、MnGATA9、MnGATA11、MnGATA15、MnGATA16、MnGATA17、MnGATA19和MnGATA23)含有DSR元素，表明它們可能在生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

在翻譯起始密碼子(ATG)上游2000 bp區(qū)域內(nèi), 不同順式作用元件的位置用顏色編碼形狀表示; MeJARE: 參與MeJA響應(yīng)性的順式作用調(diào)節(jié)元件; GARE: 赤霉素反應(yīng)元件; LTRE: 參與低溫反應(yīng)性的順式作用元件; ABRE: 參與脫落酸反應(yīng)性的順式作用元件; AURRE: 參與生長素反應(yīng)性的順式調(diào)節(jié)元件; SARE: 參與水楊酸反應(yīng)的順式作用元件; MDI: 參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn); DSRE: 參與防御和應(yīng)激反應(yīng)的順式作用元件Positions of different cis-acting elements within a 2000 bp region upstream from the translation start codon (ATG) are indicated by color-coded shapes; MeJARE: A cis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsiveness; GARE: A gibberellin-responsive element; LTRE: A cis-acting element involved in low-temperature responsiveness; ABRE: A cis-acting element involved in the abscisic acid responsiveness; AUXRE: A cis-acting regulatory element involved in auxin responsiveness; SARE: A cis-acting element involved in salicylic acid responsiveness; MDI: A MYB binding site involved in drought-inducibility; DSRE: A cis-acting element involved in defense and stress responsiveness圖7 MnGATAs應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的順式作用元件Fig.7 The stress response-related cis-acting elements of MnGATAs

3 討 論

本研究運(yùn)用生物信息學(xué)對桑樹全基因組進(jìn)行鑒定，獲得23個MnGATAs家族成員，并對23個成員進(jìn)行理化性質(zhì)分析。結(jié)果表明，成員之間存在顯著差異，可能是植物在長期進(jìn)化過程中為適應(yīng)環(huán)境變化及各成員在發(fā)育過程中功能各異所導(dǎo)致，但蛋白序列相對穩(wěn)定且具有親水性。值得注意的，23個MnGATAs亞細(xì)胞定位均定位在細(xì)胞核內(nèi)，說明桑樹GATA主要在細(xì)胞核中發(fā)揮作用，與以往研究存在一定的差異，如在高粱中的亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示80.65%的GATA家族成員定位在細(xì)胞核上，部分成員定位在線粒體和葉綠體上[27]。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，桑樹GATA家族成員可分為4類，這與棗GATA家族成員的分類相一致[30]；同時，結(jié)合MnGATAs成員蛋白保守基序及基因結(jié)構(gòu)分布發(fā)現(xiàn)，同一亞族上的成員具有類似的蛋白保守基序分布及基因結(jié)構(gòu)，表明同一亞族具有更高的保守性，可能具有相似功能，這與棗和高粱的結(jié)果一致[27, 30]。桑樹GATA蛋白三級結(jié)構(gòu)和互作關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測分析顯示，GATA蛋白整體結(jié)構(gòu)相似度存在差異，但同一亞家族的序列基因結(jié)構(gòu)具有較高相似度，表明同組家族成員在進(jìn)化過程中結(jié)構(gòu)上具有很大的同源性。蛋白功能聯(lián)系網(wǎng)絡(luò)分析也說明家族成員的功能相似，對植物某些生長發(fā)育過程具有協(xié)同調(diào)控功能。

桑樹GATAs基因在各組織中的表達(dá)水平存在明顯差異，在根、表皮及花中的表達(dá)明顯較高，相同基因在不同組織中的表達(dá)同樣存在差異，如MnGATA18、MnGATA20和MnGATA23等，表明該家族基因在桑樹各組織中的表達(dá)具有較強(qiáng)的特異性。MnGATAs的功能具有多元化，且在桑樹根、表皮的發(fā)育及功能等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，如楊樹(Populus)GATA13和GATA19通過調(diào)控氣孔的大小或關(guān)閉，提高植株的水分利用效率，進(jìn)一步提高抗旱性[31]。桑樹GATA啟動子區(qū)域與脅迫相關(guān)的順式調(diào)控元件分析結(jié)果顯示，MnGATAs不僅參與桑樹在生物/非生物脅迫下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，還參與部分植物激素信號傳導(dǎo)調(diào)控，如MeJA、Auxin、ABA、SA和GA等。同時，本研究發(fā)現(xiàn)桑樹GATA基因家族蛋白序列均具有保守性良好的鋅指結(jié)構(gòu)域，與已報道的擬南芥(Arabidopsisthaliana)、谷子(Setariaitalica)、煙草(Nicotianatabacum)、水稻(Oryzasativasubsp.japonica)及玉米(Zeamays)等植物的研究結(jié)果相符[16-19]。部分特異性的鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域與環(huán)境相關(guān)，能調(diào)控植物的抗逆性功能[13,32-33]。GATA13和GATA19在楊樹中具有抗旱和抗低氮脅迫的功能[31]，在水稻研究發(fā)現(xiàn)GATA16具有抗低溫脅迫的功能[34]，GATA25參與苜蓿生長與耐寒性的調(diào)控[35]。環(huán)境脅迫相關(guān)研究是蠶桑產(chǎn)業(yè)合理布局的關(guān)鍵，是桑樹基礎(chǔ)研究的重要領(lǐng)域。然而，GATA基因在桑樹中的具體功能還未明確，需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究對桑樹GATA轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行鑒定，共獲得了23個MnGATAs成員，并對其基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化、理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)域組成、蛋白三級結(jié)構(gòu)和功能互作關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)、組織表達(dá)及啟動子區(qū)域順式作用元件等進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，MnGATAs的理化性質(zhì)存在明顯差異，基因結(jié)構(gòu)及蛋白保守基序具有較好的保守性，MnGATAs在桑樹各組織中的表達(dá)模式存在明顯差異，MnGATAs不僅參與桑樹在生物/非生物脅迫下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，還參與部分植物激素信號傳導(dǎo)調(diào)控。本研究對桑樹GATA基因家族功能的研究奠定了一定基礎(chǔ)，為其他植物轉(zhuǎn)錄因子的研究提供了參考，對低溫、干旱等非生物脅迫分子機(jī)制和影響桑樹生長相關(guān)基因的研究提供了理論基礎(chǔ)和研究依據(jù)。