梁建文，王晉平，謝榮鑫，劉宗鑫，歐陽(yáng)燕玲

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院(廣西 南寧 530000)

2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病科(廣西 南寧 530000)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種以進(jìn)行性認(rèn)知障礙為特征的中樞系統(tǒng)退行性疾病，占總癡呆患者的50%～75%[1]，其特征是大腦中積累淀粉樣蛋白(Aβ)斑塊和神經(jīng)纖維纏結(jié)。據(jù)預(yù)測(cè)，2030、2040、2050年中國(guó)60歲以上老年患病人數(shù)分別可達(dá)到2 075萬(wàn)、2 687萬(wàn)、3 003萬(wàn)[2]。AD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，既與膽堿能缺乏、氧化應(yīng)激、炎性損傷等有關(guān)，也與環(huán)境因素、教育程度等有關(guān)[3-4]。淫羊藿是臨床常用中藥，具有補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨的功效，用于腎陽(yáng)虧虛所致善忘癡呆、陽(yáng)痿遺精等。其主要成分為黃酮類、淫羊藿苷等，具有抑制破骨細(xì)胞、增強(qiáng)免疫功能、抗衰老等藥理作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是對(duì)生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)分析，通過選取特定節(jié)點(diǎn)進(jìn)行多靶點(diǎn)藥物分子設(shè)計(jì)[5]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)強(qiáng)調(diào)對(duì)信號(hào)通路的多途徑調(diào)節(jié)，提高藥物的治療效果，降低毒副作用，從而提高新藥臨床試驗(yàn)的成功率，降低藥物的研發(fā)費(fèi)用。目前已被廣泛應(yīng)用于中藥研究。分子對(duì)接是分子與分子間的空間和能量識(shí)別[6]?？臻g匹配說明分子間存在相互作用可能性，而能量匹配說明分子間具有保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的可能性。通過分子對(duì)接技術(shù)，可預(yù)測(cè)配體和受體是否存在相互作用。因此，分子對(duì)接的方法是現(xiàn)代信息技術(shù)用于藥物研究的一項(xiàng)重要技術(shù)。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從有效成分和靶點(diǎn)、靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)、基因本體(GO)和京都基因與基因組(KEGG)分析、分子對(duì)接等方面探討淫羊藿治療AD潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1篩選淫羊藿中有效成分和靶點(diǎn)通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)[7](TCMSP)(表1)，以“淫羊藿”檢索全部活性成分，以口服生物利用度(OB≥30%)、藥物類藥性(DL≥0.18)、血腦屏障(BBB≥-0.3)為篩選條件[7]，篩選淫羊藿有效成分和相關(guān)靶點(diǎn)。

表1 本研究所使用的數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件

1.2篩選淫羊藿治療AD的直接調(diào)節(jié)靶點(diǎn)通過UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)檢索出靶點(diǎn)的基因名并注釋(排除物種為非人類的基因)；以關(guān)鍵詞“Alzheimer’s disease”檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)，得到AD疾病總靶點(diǎn)基因；通過R語(yǔ)言將AD疾病相關(guān)靶點(diǎn)基因與淫羊藿靶點(diǎn)基因取交集，得到淫羊藿和AD疾病共同靶點(diǎn)基因，即淫羊藿治療AD的直接調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。

1.3構(gòu)建中藥-疾病靶點(diǎn)PPI互作網(wǎng)絡(luò)和中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)①將有效成分與淫羊藿-AD靶點(diǎn)基因?qū)隒ytoscape 3.82版軟件[8]，構(gòu)建中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。②將淫羊藿-AD靶點(diǎn)基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)互作圖。

1.4篩選核心靶點(diǎn)運(yùn)用CytoNCA插件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)溆?jì)算，通過取點(diǎn)度中心性(Degree)、接近中心性(Closeness)、中介中心性(Betweeness)中位數(shù)(即Degree>10.5，Closeness>0.442，Betweeness>31.5)篩選淫羊藿-AD核心靶點(diǎn)。

1.5GO功能分析和KEGG通路分析運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO和KEGG富集分析，利用R語(yǔ)言軟件將數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化，得到GO功能分析條形圖和KEGG通路富集分析氣泡圖。

1.6分子對(duì)接根據(jù)自由度大小，選取有效成分與核心靶點(diǎn)，通過Chem3D、Pymol、AutoDock和Vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接，得到其結(jié)合能大小和氫鍵數(shù)目。

2 結(jié)果

2.1淫羊藿中有效成分的篩選和靶點(diǎn)結(jié)果TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中得到總活性成分130個(gè)，根據(jù)OB(≥30%)、DL(≥0.18)和BBB(≥-0.3)(保留小數(shù)點(diǎn)后兩位)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)淫羊藿的總活性成分進(jìn)行篩選，結(jié)果得到有效成分11種(表2)，與有效成分的相關(guān)靶點(diǎn)共149個(gè)，去重后得到74種。

表2 淫羊藿中的有效成分

2.2中藥-疾病靶點(diǎn)構(gòu)建的結(jié)果利用R語(yǔ)言軟件將AD總靶點(diǎn)與淫羊藿有效成分相關(guān)靶點(diǎn)取交集，得到中藥-疾病共同靶點(diǎn)的韋恩圖(圖1)。AD總靶點(diǎn)11 032種，淫羊藿有效成分相關(guān)靶點(diǎn)74種，交集結(jié)果得到中藥-疾病共同靶點(diǎn)62種。

藥物：74種淫羊藿有效成分相關(guān)靶點(diǎn)；疾?。?1 032種阿爾茨海默病總靶點(diǎn)；棕色：62種淫羊藿-AD共同靶點(diǎn)。

2.3構(gòu)建中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的結(jié)果中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖(見圖2)，矩形大小與自由度呈正相關(guān)，提示自由度前3名分別為2,7-二氫高刺桐春、去水淫羊藿和8-(3-甲基丁-2-烯基)-2-苯基色酮，說明這3種成分含蛋白靶點(diǎn)數(shù)量較其它成分多。橙色矩形部分為淫羊藿有效成分與AD共同靶點(diǎn)，共有62種，其顏色深淺與自由度呈正相關(guān)，提示自由度前3名為PTGS2、PTGS1和ESR1，說明這3種靶點(diǎn)存在于多種成分中。

綠色：淫羊藿；紫色：淫羊藿有效成分；橙色：淫羊藿有效成分與AD共同靶點(diǎn)；灰色：淫羊藿靶點(diǎn)與AD靶點(diǎn)無(wú)交集基因部分，藍(lán)色：阿爾茨海默病。

2.4構(gòu)建中藥-疾病共同靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)與篩選核心靶點(diǎn)的結(jié)果構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)互作圖(圖3)，剔除2個(gè)沒有網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)后，圖中包含60個(gè)節(jié)點(diǎn)，313條邊，涉及生物過程710種，分子功能130種，細(xì)胞成分53種，KEGG通路67條。每個(gè)節(jié)點(diǎn)的平均自由度為10.3。篩選核心靶點(diǎn)的結(jié)果(圖4)所示，顏色深淺表示自由度大小，節(jié)點(diǎn)的形狀大小表示接近中心性的大小，節(jié)點(diǎn)標(biāo)簽文字的大小表示中介中心性的大小。中藥-疾病核心基因篩選出20個(gè)，Degree值排名前3的靶點(diǎn)依次為ACHE，SLC6A4，HTR3A，見表3。

表3 淫羊藿-AD核心靶點(diǎn)

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)互作圖

注：顏色深淺與自由度呈正相關(guān)，節(jié)點(diǎn)形狀大小與closeness值呈正相關(guān)，節(jié)點(diǎn)標(biāo)簽文字大小與betweenness值呈正相關(guān)。

2.5GO富集分析結(jié)果將20種核心靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)[9]，得到GO分析結(jié)果。根據(jù)GO結(jié)果

上富集數(shù)量值的大小排列，從生物過程(BP)、細(xì)胞組成(CC)和分子功能(MF)中篩選前10位進(jìn)行可視化分析(表4、圖5)。淫羊藿治療AD的生物過程主要涉及化學(xué)性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、突觸傳遞、藥物反應(yīng)、細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞增殖的正調(diào)控、G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路、腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素能受體信號(hào)通路、ERK1和ERK2級(jí)聯(lián)的正調(diào)節(jié)、平滑肌收縮調(diào)節(jié)等方面；分子功能主要涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚化活性、藥物結(jié)合、血清素結(jié)合、腎上腺素結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、G蛋白偶聯(lián)5-羥色胺受體活性、蛋白質(zhì)異二聚活性、α2腎上腺素能受體活性等方面；細(xì)胞組成主要涉及質(zhì)膜、突觸后膜、神經(jīng)元細(xì)胞體、神經(jīng)元投射等方面。

表4 GO分析結(jié)果

圖5 GO富集分析

2.6KEGG通路富集分析核心靶點(diǎn)涉及的KEGG通路有9條(表5，圖6)，淫羊藿-AD核心靶點(diǎn)基因的KEGG通路主要涉及神經(jīng)活性配體-受體互作通路、鈣信號(hào)通路、5-羥色胺能突觸通路、cGMP-PKG信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、膽堿能突觸通路、縫隙連接通路、PI3K-Akt信號(hào)通路。

圖6 KEGG通路分析氣泡圖

表5 KEGG富集分析結(jié)果

2.7分子對(duì)接選取核心靶點(diǎn)中Degree值前2者(ACHE，SLC6A4)與淫羊藿有效成分中Degree值前2者，通過Chem3D、Pymol、AutoDock和Vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，結(jié)果提示2,7-二氫高刺桐春與ACHE中的HIS-381、GLN-527以氫鍵連接(圖7a)，與SLC6A4中的ARG-390、GLN-567以氫鍵連接(圖7b)；去水淫羊藿與ACHE中的ASN-233以氫鍵連接(圖7c)，與SLC6A4中的GLU-493以氫鍵連接(圖7d)。結(jié)合能是幾個(gè)粒子從自由狀態(tài)結(jié)合成為一個(gè)復(fù)合粒子時(shí)所釋放的能量。結(jié)合能數(shù)值越小，分子結(jié)構(gòu)就越穩(wěn)定。結(jié)合能<-5 kJ/moL認(rèn)為對(duì)接結(jié)果比較穩(wěn)定，越低則越穩(wěn)定，結(jié)果顯示配體與受體兩兩對(duì)接，其結(jié)合能均低于-5 kJ/moL，且均有氫鍵相連，見表6。

表6 配體-受體對(duì)接結(jié)合能表

3 討論

經(jīng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，本研究獲得3條淫羊藿-AD的顯著通路，分別是神經(jīng)活性配體-受體互作通路、鈣信號(hào)通路和5-羥色胺能突觸通路。神經(jīng)活性配體-受體互作通路是調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)多種生理生化過程的重要通路，與神經(jīng)功能直接相關(guān)。神經(jīng)活性配體通過與細(xì)胞內(nèi)受體結(jié)合來影響神經(jīng)元功能，細(xì)胞內(nèi)受體具有結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)節(jié)基因表達(dá)的能力。因此,破壞參與神經(jīng)活性配體-受體相互作用的基因會(huì)導(dǎo)致記憶功能下降[10]。淫羊藿靶點(diǎn)富集在神經(jīng)活性配體-受體互作通路多達(dá)13種,包括CHRM2,GRIA2,CHRM1,HTR1A,HTR2C,ADRB2,HTR2A,OPRM1,F2,ADRA1A,ADRA2B,ADRA2A,DRD2。淫羊藿可通過調(diào)節(jié)該通路改善記憶功能。

鈣離子(Ca2+)是包括植物在內(nèi)的所有真核生物中普遍存在的第二信使[11]。細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)平衡在神經(jīng)元中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，包括生長(zhǎng)分化，動(dòng)作電位，突觸重塑和學(xué)習(xí)記憶等。證據(jù)表明[12]神經(jīng)元的鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)可能與AD的發(fā)病有關(guān)，鈣中斷可誘導(dǎo)突觸缺陷，促進(jìn)Aβ斑塊和神經(jīng)纖維纏結(jié)的積累,導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病。淫羊藿通過調(diào)節(jié)鈣通道中的CHRM2,CHRM1,NOS3,HTR2C,ADRB2,HTR2A,ADRA1A靶點(diǎn),減少神經(jīng)元的損傷,從而改善AD的癥狀。

5-羥色胺能系統(tǒng)與膽堿能系統(tǒng)、多巴胺能系統(tǒng)、γ-氨基丁酸(GABA)能系統(tǒng)和谷氨酰胺能系統(tǒng)相互作用，在記憶保持和學(xué)習(xí)中起著關(guān)鍵作用[13]。5-羥色胺能突觸通路是重要的神經(jīng)通路。臨床上,常用的西酞普蘭、氟西汀、帕羅西汀等可作用于該通路,增加突觸5-羥色胺的濃度,減輕AD后期的抑郁癥狀。淫羊藿成分具有調(diào)控5-羥色胺能突觸通路的作用,繼而改善AD的癥狀。

綜上所述,淫羊藿具有多靶點(diǎn)、多通路治療AD的作用,其主要通路涉及神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、鈣信號(hào)通路、5-羥色胺能突觸通路、縫隙連接通路、cGMP-PKG信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、膽堿能突觸通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等。本研究也為進(jìn)一步相關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供思路以及理論依據(jù)。