邵攀峰 孫慶霞 李少麗 朱國(guó)坡 尹忠良

杭州佑本動(dòng)物疫苗有限公司，杭州310018

豬乙型腦炎是一種人畜共患病，是由乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）引起的一種急性、發(fā)熱性傳染病。JEV 在分類(lèi)上屬于黃病毒科（Flaviviridae)黃病毒屬[1-3]，病毒粒子呈球形，20 面體對(duì)稱(chēng)，有囊膜、單股、正鏈RNA。該病在不同的地域季節(jié)性發(fā)病差異顯著，在熱帶地區(qū)沒(méi)有明顯的季節(jié)性，而在溫帶和亞熱帶地區(qū)發(fā)病則有嚴(yán)格的季節(jié)性[4]。因此，該病對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展具有極大的危害性，給我國(guó)乃至全球的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，制約了養(yǎng)豬業(yè)的快速健康發(fā)展。

1 流行病學(xué)調(diào)查

2021年7月，某養(yǎng)豬場(chǎng)先后有6 頭妊娠母豬流產(chǎn)，流產(chǎn)比例明顯超出日常正常情況，發(fā)病母豬表現(xiàn)精神不振，食欲減退，飲水增加，糞便發(fā)干呈球狀，尿液呈深黃色。有2 頭公豬表現(xiàn)一側(cè)睪丸腫脹；個(gè)別小豬有站立不穩(wěn)、轉(zhuǎn)圈運(yùn)動(dòng)、全身抽搐等癥狀，有的突然倒地死亡。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該養(yǎng)殖場(chǎng)屬于家庭農(nóng)場(chǎng)，主要采取自繁自養(yǎng)模式飼養(yǎng)，共養(yǎng)豬200 多頭，其中母豬42 頭，近3年來(lái)未從外面引種。養(yǎng)殖場(chǎng)周?chē)鸁o(wú)養(yǎng)豬場(chǎng)和村莊，但是養(yǎng)殖場(chǎng)大門(mén)口附近有一條公路來(lái)往車(chē)輛較多。該養(yǎng)豬場(chǎng)僅進(jìn)行豬瘟疫苗和豬口蹄疫疫苗的免疫接種，其他疫病疫苗從未接種過(guò)。由于前段時(shí)間本地區(qū)連續(xù)強(qiáng)降雨，造成養(yǎng)殖場(chǎng)周?chē)卸嗵幋笮〔坏确e水坑，近期積水坑和養(yǎng)豬場(chǎng)出現(xiàn)比往常較多的蚊蟲(chóng)。

2 臨床癥狀

本病主要的臨床癥狀是妊娠母豬流產(chǎn)，病豬伴有體溫升高，呈稽留熱型，體溫40～42 ℃，但也有母豬僅表現(xiàn)流產(chǎn)，沒(méi)有其他任何臨床癥狀。流產(chǎn)胎兒多為木乃伊胎或死胎，體表表現(xiàn)水腫或發(fā)紅。臨近預(yù)產(chǎn)期母豬流產(chǎn)胎兒，有些雖然有呼吸，但體質(zhì)很弱，大多經(jīng)1～3 d 死亡；個(gè)別流產(chǎn)胎兒也有表現(xiàn)正常，并且生長(zhǎng)狀況較好。剛出生仔豬發(fā)病后表現(xiàn)為站立不穩(wěn)、走路搖擺、全身抽搐等發(fā)病癥狀，患病仔豬1 周內(nèi)大多死亡。母豬流產(chǎn)后多表現(xiàn)胎衣不下或滯留，易誘發(fā)母豬子宮內(nèi)膜炎。公豬表現(xiàn)為體溫升高、一側(cè)睪丸腫脹。

3 病理變化

妊娠母豬流產(chǎn)胎兒主要表現(xiàn)全身肌肉顏色變淺，如水煮肉樣褪色，淋巴結(jié)點(diǎn)狀出血，腦和脊髓膜充血、出血，胎膜充血并散在點(diǎn)狀出血。發(fā)病仔豬可見(jiàn)腦水腫，漿膜有點(diǎn)狀出血、淋巴結(jié)出血、肝臟和脾有壞死灶等。流產(chǎn)母豬子宮內(nèi)膜表現(xiàn)水腫、充血或者小點(diǎn)狀出血，且有較多黏稠分泌物覆在黏膜上。公豬表現(xiàn)為睪丸腫脹，睪丸切面存在大小不等黃色壞死病灶，且周?chē)橛谐鲅?、充血?/p>

4 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

4.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

采集病死豬的腦、心、肝分別涂片、觸片鏡檢并接種鮮血瓊脂、普通瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯和厭氧肉湯培養(yǎng)基，在恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)48 h 觀察，結(jié)果均為陰性。

4.2 豬布氏桿菌病檢測(cè)

由于豬布氏桿菌病在臨床癥狀和病理變化也會(huì)出現(xiàn)相似癥狀，利用布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)，對(duì)采集的13 份被檢豬血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照血清出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象，陰性對(duì)照血清無(wú)凝集現(xiàn)象成均勻粉紅色，檢測(cè)13 份豬血清樣品結(jié)果均為陰性。

4.3 病原PCR 檢測(cè)

根據(jù)GenBank 收錄的乙型腦炎病毒基因序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)1 對(duì)引物（上游引 物JEV-P1:5′-ATGGATTGTCTGGGAATGGGCA ATCG-3′；下游引物JEV-P2:5′-GCTATGCACATTGGTCGCTAAG-3′）擴(kuò)增乙型腦炎病毒，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，上、下游引物之間預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)463 bp。

將預(yù)先稱(chēng)重的組織樣品剪碎，研磨成糊狀，加入2 倍組織重量的無(wú)菌PBS 溶液，震蕩混勻，-80 ℃反復(fù)凍融3 次，4 ℃、3 500 r/min 離心10 min，取上清備用。按照病毒RNA/DNA 提取試劑盒的方法對(duì)組織上清進(jìn)行總RNA 的提取。

以總RNA 為模板，采用1st Strand cDNA 試劑盒制備cDNA。在反應(yīng)管中配制以下試劑（50 μL）：Random 6 mers 2.5 μL，dNTP Mixture 2.5 μL，RNase Free H2O 10 μL，模板10 μL；65 ℃保5 min后，冰上冷卻；向管中再加入5×PrimeScript ⅡBuffer 10 μL，RNase Inhibitor 1.3 μL，PrimeScriptⅡRTase 2.5 μL，RNase Free H2O 11.2 μL；混勻，30 ℃10 min，45 ℃60 min，70 ℃15 min，冰上冷卻，即為cDNA 模板。

以cDNA 為模板，利用JEV 引物擴(kuò)增。反應(yīng)體系如下（20 μL）：10×Ex Taq buffer 2 μL，dNTP Mix 1.6 μL，JEV-P1 0.8 μL，JEV-P2 0.8 μL，Ex Taq 0.16 μL，ddH2O 12.64 μL，cDNA 2 μL。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃5 min；95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃45 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。

取PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL 檢測(cè)，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外凝膠成像儀下觀察檢測(cè)擴(kuò)增條帶檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果表明，10 份樣品進(jìn)行乙型腦炎病毒RT-PCR 檢測(cè)，有4 份樣品擴(kuò)增出明顯條帶，有3 份樣品擴(kuò)增條帶亮度微弱，擴(kuò)增出目的條帶大小相符（463 bp），而陰性對(duì)照無(wú)條帶（圖1）。

圖1 豬乙型腦炎病毒RT-PCR 結(jié)果

4.4 病毒分離培養(yǎng)

當(dāng)BHK-21 細(xì)胞生長(zhǎng)致密細(xì)胞單層，棄去生長(zhǎng)液，將豬乙型腦炎病毒RT-PCR 檢測(cè)為陽(yáng)性的組織樣品或細(xì)胞培養(yǎng)物按1.5%比例接種病毒液，35 ℃吸附60 min，加入維持液，置35 ℃，5% CO2培養(yǎng)。在顯微鏡下觀察BHK-21 細(xì)胞CPE，培養(yǎng)至72 h或細(xì)胞病變達(dá)80%左右時(shí)將培養(yǎng)物反復(fù)凍融3 次收獲，連續(xù)繼代培養(yǎng)，觀察乙腦病毒對(duì)BHK-21 細(xì)胞的適應(yīng)性。結(jié)果表明，4 份RT-PCR 檢測(cè)豬乙型腦炎病毒陽(yáng)性的病料組織樣品，經(jīng)過(guò)接種BHK-21 細(xì)胞連續(xù)繼代培養(yǎng)，顯微鏡下觀察BHK-21 細(xì)胞病變，3 份病料組織樣品不能引起B(yǎng)HK-21 細(xì)胞病變；有1 份病料組織樣品能引起B(yǎng)HK-21 細(xì)胞明顯而穩(wěn)定的細(xì)胞病變。

4.5 病毒含量測(cè)定

將病毒液用DMEM 液作10 倍系列稀釋?zhuān)?0-1～10-7稀釋度，每個(gè)稀釋度接種6 孔至長(zhǎng)滿(mǎn)BHK-21 細(xì)胞單層的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種量為0.1 mL，同時(shí)設(shè)立DMEM 液陰性對(duì)照孔，置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)至120 h，觀察細(xì)胞病變，按Reed-Muench 法計(jì)算病毒液TCID50。將病毒液系列稀釋?zhuān)臃N至長(zhǎng)滿(mǎn)BHK-21 細(xì)胞致密單層的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)120 h，根據(jù)細(xì)胞病變孔數(shù)量，按Reed-Muench 法計(jì)算病毒液每毫升病毒液中的TCID50，結(jié)果表明，病毒含量可達(dá)到107.3 TCID50/mL。

4.6 病毒中和試驗(yàn)

選已測(cè)出病毒含量的病毒液用含2%新生牛血清的DMEM 培養(yǎng)液稀釋至200 TCID50/0.1 mL，與等量乙型腦炎病毒陽(yáng)性血清混合后，置37 ℃中和60 min，接種6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上已長(zhǎng)成良好單層的BHK-21 細(xì)胞4 孔，0.4 mL/孔；同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照孔4孔，每孔接種同條件處理的病毒與含2%新生牛血清的DMEM 培養(yǎng)液混合液0.4 mL；正常細(xì)胞對(duì)照孔4 孔，每孔加入含2%新生牛血清的DMEM 培養(yǎng)液0.4 mL，置37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)5 d，觀察CPE。結(jié)果表明，JEV 病毒對(duì)照孔4/4 細(xì)胞出現(xiàn)CPE；JEV 與乙型腦炎病毒陽(yáng)性血清中和均未出現(xiàn)CPE 孔；正常細(xì)胞對(duì)照孔4/4 未出現(xiàn)CPE，表明JEV能夠被乙型腦炎病毒陽(yáng)性血清特異性中和。

5 診 斷

結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查、臨床發(fā)病癥狀、病理剖檢變化和實(shí)驗(yàn)室病原PCR 檢測(cè)、病毒分離培養(yǎng)、病毒含量測(cè)定、病毒中和等試驗(yàn)方法進(jìn)行綜合診斷，確診該養(yǎng)豬場(chǎng)發(fā)生的疫病為豬乙型腦炎病。

6 綜合防控

6.1 加強(qiáng)飼養(yǎng)管理

目前該病沒(méi)有特效治療藥物，通過(guò)焚燒或深埋等方式對(duì)母豬流產(chǎn)分泌物、胎衣及流產(chǎn)胎兒及時(shí)做好無(wú)害化處理。健康豬群提供充足清潔飲水，營(yíng)養(yǎng)全面飼料，并在飼料或飲水中添加復(fù)合多維，提高豬群整體抗病能力。對(duì)有發(fā)熱癥狀的病豬，肌肉注射安乃近注射液10～20 mL，2 次/d，直到體溫恢復(fù)正常。同時(shí)，可肌肉注射磺胺嘧啶注射液20 mL，防止繼發(fā)感染，2 次/d，連用3 d。

6.2 疫苗接種

在生產(chǎn)中，豬乙型腦炎病毒的主要傳播途徑是通過(guò)蚊蟲(chóng)叮咬，因此，做好該病的預(yù)防措施，注射疫苗顯得尤為重要[5]。對(duì)豬群進(jìn)行豬乙型腦炎活疫苗（SA14-14-2 株）緊急免疫接種，首免14 d 后再加強(qiáng)免疫1 次，建議以后每年4月和10月各普免1次豬乙型腦炎疫苗。