邱 恒 張旭瑩 王飔婷 侯 楊 張 浩

北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京102442

大腸桿菌病是禽類常見病，致病率和致死率都較高，一直困擾著我國禽類養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，但隨著我國禽類養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，抗生素的應(yīng)用同樣也越來越多、越來越廣泛，對雞大腸細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性的抗生素種類也越來越多，同時雞大腸桿菌產(chǎn)生的耐藥性問題也變得日趨嚴(yán)重。目前青霉素G 類對雞大腸桿菌（青霉素G 的非耐菌率僅為0.85%）、大環(huán)內(nèi)酯類（紅霉素堿對雞大腸桿菌非耐菌率僅為20.28%）、氨基糖苷類（鏈霉素對雞大腸桿菌目前非耐菌率僅為51.12%、而慶大霉素對雞大腸桿菌的非耐菌率為58.22%）、喹諾酮類（氧洛沙星對雞大腸桿菌的非耐菌率為62.24%）非耐藥性均較低。大腸桿菌的耐藥性如若處理不當(dāng)，將對禽類養(yǎng)殖業(yè)的治療帶來非常大的困難。所以要尋找新出路，拓寬治療大腸桿菌病的治療出路，而我國當(dāng)前許多中草藥，對雞大腸桿菌具有比較好的抗菌和抑菌的重要作用。

本研究通過對大腸桿菌藥敏試驗，從中篩選出廉價且耐藥性較低的中草藥，同時對比抗生素類藥物對大腸桿菌的抗菌效果，以研究中草藥對大腸桿菌的抗菌性的可行性，為治療對抗生素產(chǎn)生耐藥性的大腸桿菌而引起的相關(guān)疾病找出路，并在一定程度上減少抗生素在一般禽類養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)活動中的使用，避免耐藥性大腸桿菌及其他耐藥性致病菌的產(chǎn)生[1]。

常用抗菌中草藥有：忍冬花、黃柏、蒲公英、板藍(lán)根、黃連等，目前市場上多數(shù)為復(fù)方制劑，為選擇效果明顯的抗菌中草藥，通過調(diào)查蛋雞養(yǎng)殖戶、獸藥經(jīng)營者和臨床獸醫(yī)，選擇了5 種大家普遍認(rèn)可的中草藥處方制劑產(chǎn)品，進(jìn)行了體外抑菌試驗，從中選出抗菌效果比較好的中草藥。

1 材料與方法

1.1 材 料

1）菌株及中草藥。大腸桿菌（自備）、單味中草藥5 種（板藍(lán)根、黃柏、忍冬、蒲公英、黃連）、復(fù)方中草藥制劑（板青敗毒口服液，其有忍冬花、蒲公英、大青葉、白英、板藍(lán)根。每100 mL 相當(dāng)于原生藥100 g。購于北京一家正規(guī)中藥店），硫酸慶大霉素注射液，規(guī)格2 mL∶80 mg。購置華中藥業(yè)股份有限公司。

2）培養(yǎng)基粉。麥康凱、普通營養(yǎng)瓊脂、伊紅美藍(lán)和肉湯培養(yǎng)基均購于北京天壇生物制品股份有限公司。培養(yǎng)基的配制按標(biāo)簽說明完成。

3）試驗設(shè)備。立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器（LXB35L，合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司）、生物安全柜（BSC-1360IIA2，北京東聯(lián)哈爾濱制造有限公司）、恒溫鼓風(fēng)干燥箱（2XFD-B5140，上海智聯(lián)分析儀器制造有限公司）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（2XDP-2160，上海智聯(lián)分析儀器制造有限公司）、一次性使用培養(yǎng)皿（90 mm，泰州市順飛醫(yī)療器械有限公司）、光學(xué)顯微鏡、加熱器、無極式煮藥壺、分析天平、涂布器、牛津杯、游標(biāo)卡尺、大燒杯、試管、錐形瓶、酒精燈、孔徑23 μm濾網(wǎng)、載玻片、革蘭氏染液、接種環(huán)和移液器等。

1.2 方 法

本試驗首先采取調(diào)查研究的方法，通過調(diào)查蛋雞養(yǎng)殖戶、獸藥經(jīng)營者和臨床一線獸醫(yī)選擇了5 種大家普遍認(rèn)可的單味中草藥和一味復(fù)方中草藥制劑，然后進(jìn)行實驗室研究，利用培養(yǎng)基做藥敏抗菌對比試驗，選擇出效果比較好中草藥，最后進(jìn)行驗證試驗，將選出的中草藥應(yīng)用在大腸桿菌的雞群中，觀察療效。在此主要闡述實驗室研究方法。

1）培養(yǎng)基的制備：用分析天平按著培養(yǎng)基說明書配比量，稱取0.5 L 量的培養(yǎng)基所需的培養(yǎng)基粉，放入燒杯中，加純化水，用玻璃棒攪拌至充分溶解。（普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)加入瓊脂）然后在加熱器上加熱，同時用玻璃棒攪拌，加熱至有小氣泡冒出時停止。測試pH 值，調(diào)節(jié)pH 值后，分裝在錐形瓶內(nèi)，加蓋棉塞，放置自動壓力高溫滅菌鍋內(nèi)121 ℃高壓滅菌15 min，滅菌冷卻后，在超凈工作臺內(nèi)分裝到培養(yǎng)皿內(nèi)，肉湯培養(yǎng)基分裝到試管內(nèi)，加蓋棉塞，放入4 ℃冰箱冷藏備用[2]。

2）制備菌液：取正?；\養(yǎng)蛋母雞，采用不出血方式處死，進(jìn)行無菌解剖，打開腸道，用接種環(huán)在酒精燈火焰高溫滅菌后，在雞大腸上輕刮，然后再采用劃線分離法在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上接種，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，選取單個合適大腸桿菌菌落，用接種環(huán)刮取半個菌落（可多選取幾個備用，但要標(biāo)記清楚），在滅菌后的載玻片上，用革蘭氏染色法進(jìn)行染色，晾干成片后，顯微鏡下進(jìn)行鏡檢，確定為純大腸桿菌菌落后（如若不純，則需要進(jìn)行純培養(yǎng)，直至完全為純大腸桿菌菌落為止），在超凈工作臺無菌環(huán)境中，把顯微鏡鏡檢確認(rèn)為純大腸桿菌的剩下半個菌落，在自制營養(yǎng)肉湯中用滅菌接種環(huán)接種，放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。然后對雞大腸桿菌，用平板菌落計數(shù)的方法進(jìn)行計數(shù)，調(diào)整好雞大腸桿菌菌液的最終濃度為1×108cfu/L 備用[3]。

3）單味中草藥藥液的制備與萃?。河脗鹘y(tǒng)水提法萃取有效的成分。辦法為：各取50 g 放入大燒杯中，加入1 000～2 000 mL 的純化水中浸泡2 h，浸泡的水不慮出，放入藥壺中，大火煮開后文火煮0.5 h，用孔徑約0.32 mm 的濾網(wǎng)過濾藥湯，將藥湯過濾在燒杯中，另加1 000 mL 的純化水在藥壺中，用同樣方法將藥渣再煮一遍，后用孔徑約0.32 mm的濾網(wǎng)過濾，合并2 次過濾后的藥湯，放入燒杯中，并加入沸石進(jìn)行蒸發(fā)濃縮，藥湯濃縮最終濃度為1 g/mL，即50 mL 藥湯，然后分裝放入離心管中，離心沉淀提純后，測試藥湯的pH 值，調(diào)整pH 值為7.2 ～7.3，將調(diào)整好pH 值的藥湯，放在錐形瓶中，用紗布封口，在自動試壓力蒸汽器內(nèi)，121 ℃高壓滅菌15 min，然后取出，將5 種單味中草藥藥湯各取10 mL，混勻后放入4 ℃冰箱冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

4）抗生素藥敏紙片制備：取滅菌后的燒杯，注入硫酸慶大霉素注射液，再放入無菌生理鹽水稀釋。將剪裁好滅菌的定性濾紙（直徑6 mm）放入稀釋過的硫酸慶大霉素注射液中，充分浸泡，然后無菌晾干，備用。

5）復(fù)方中草藥制劑藥液的制備：將復(fù)方中草藥制劑放在燒杯中加入純水，按一定比例稀釋，使每一種復(fù)方制劑達(dá)到1 mL 藥液相當(dāng)于原生藥1 g，測試藥液的pH 值，調(diào)整pH 值為7.2 ～7.3，將調(diào)整好pH 值的板青敗毒口服液，分裝在錐形瓶中，用紗布封口，在自動試壓力蒸汽器內(nèi)，121 ℃高壓滅菌15 min，再從混合后的5 種單味中草藥混合液中取25 mL 與25 mL 復(fù)方中草藥藥液混勻，后放入4 ℃冰箱冷藏保存?zhèn)溆肹4]。

6）抑菌圈的直徑測量辦法：用牛津杯法來分別測定，取濃度為1×106cfu/mL 雞大腸桿菌液0.1 mL，在超凈工作臺無菌的環(huán)境下，將涂布器在酒精燈上滅菌，用涂布器蘸取雞大腸桿菌菌液，輕輕均勻涂布在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，并在一級超凈工作臺等待吸收，取出無菌的牛津杯，在無菌的環(huán)境中，放在普通培養(yǎng)基平板上，加滿提純后的中草藥萃取藥液，調(diào)好牛津杯工作狀態(tài)，將牛津杯和涂布大腸桿菌的普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板，靜置30 min后，置放在恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)12 h，每種單味中草藥純化萃取藥湯、復(fù)方板青敗毒口服液及其混合液，都需要重復(fù)試驗3 次，以減少實驗誤差，后用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的直徑，如同種中草藥實驗數(shù)據(jù)差值過大，則需再加做2 次，以保證實驗數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。取中草藥滅菌抑菌圈的直徑的平均值。硫酸慶大霉素注射液藥敏紙片放置在涂布大腸桿菌的普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，凈置30 min 后，放置恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)0.5 h，然后用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的直徑，抑菌效果衡量的標(biāo)準(zhǔn)為：抑菌直徑≥20 mm 表示為極度敏感級，15 mm≤抑菌直徑＜20 mm表示為高度敏感級，10 mm≤抑菌直徑＜15 mm 表示為中度敏感級，抑菌直徑＜10 mm 表示為低度敏感級[5]。

2 結(jié)果與分析

由表1 培養(yǎng)基擴(kuò)散法中草藥抗菌藥敏試驗結(jié)果可知，通過培養(yǎng)基擴(kuò)散法測得，板藍(lán)根、忍冬花、蒲公英、黃連、黃柏、硫酸慶大霉素注射液、板青敗毒口服液、5 種單味中草藥混合以及5 種中草藥與復(fù)方制劑混合液的抑菌直徑分別為21 mm、15 mm、16 mm、20 mm、14 mm、9 mm、28 mm、26 mm 和30 mm。根據(jù)抑菌效果衡量的判定標(biāo)準(zhǔn)得出結(jié)論，板藍(lán)根、黃連、板青敗毒口服液、5 種單味中草藥混合液和5 種中草藥與板青敗毒口服液混合后對大腸桿菌為極度敏感，忍冬花和蒲公英為高度敏感，黃柏為中度敏感。培養(yǎng)基擴(kuò)散法得5 種單味中草藥、復(fù)方中草藥制劑和抗生素對大腸桿菌抑菌效果，由強(qiáng)到弱依次為5 種草藥與板青敗毒口服液混合液＞板青敗毒口服液＞5 種單味中草藥混合液＞板藍(lán)根＞黃連＞蒲公英＞忍冬花＞黃柏＞硫酸慶大霉素注射液[6]。

表1 培養(yǎng)基擴(kuò)散法中草藥抗菌藥敏試驗結(jié)果

3 討 論

1）通過試驗對比5 種單味中草藥和復(fù)方中草藥的抑菌圈直徑得知，5 種單味中草藥抑菌效果最好的為板藍(lán)根，其中板藍(lán)根和黃連的抑菌效果都達(dá)到了極度敏感效果，具有一定的臨床實用價值，蒲公英、黃柏和忍冬花都屬于低敏感度效果，硫酸慶大霉素與中草藥抑菌實驗效果相比較，板藍(lán)根、忍冬花、蒲公英、黃柏、黃連和板青敗毒口服液的抑菌實驗效果均好于硫酸慶大霉素注射液，也具有一定的臨床實用價值[7]。

2）復(fù)方中草藥制劑板青敗毒口服液、板藍(lán)根和黃連抗大腸桿菌藥敏實驗結(jié)果都為極度敏感，適用于大腸桿菌的抗菌使用。復(fù)方中草藥抑菌效果好于試驗中其他5 味單味中草藥。并且通過實驗發(fā)現(xiàn)，5種中草藥混合使用抑菌效果好于單種中草藥抑菌效果。并且有混合種類越多，抑菌效果越好的特點，5 種單味中草藥混合液與板青敗毒口服液的聯(lián)合使用的抑菌實驗效果最好，故在臨床用中草藥治療大腸桿菌應(yīng)該優(yōu)先考慮板青敗毒口服液和其他中草藥聯(lián)合使用[8]。

3）根據(jù)走訪相關(guān)禽類養(yǎng)殖戶及查閱資料可知，部分中草藥如單味中草藥板藍(lán)根和黃連，復(fù)方中草藥板青敗毒口服液對細(xì)菌有一定的抑制作用，并且具有殘留極小、毒性較低、耐藥性發(fā)生率低等特殊優(yōu)勢，被禽業(yè)養(yǎng)殖戶和基層獸醫(yī)較為廣泛地應(yīng)用于治療大腸桿菌疾病。