高飛, 姚淑芳, 陶有亮

三門峽市中心醫(yī)院 1藥學部， 2神經(jīng)內(nèi)科(河南三門峽 472000)； 3三門峽職業(yè)技術(shù)學院醫(yī)護學院(河南三門峽 472000)

急性腦梗死(acute cerebral infarction，ACI)是臨床上常見的一種腦血管疾病，是由于患者腦供血突然中斷而導致的腦組織軟化和壞死，具有較高的致殘率和病死率，嚴重影響患者生命健康[1-2]。奧扎格雷作為一種高選擇性的TXA2合成酶抑制劑，可有效促進前列環(huán)素的生成，進而抑制各種炎性因子的分泌，可擴張患者的腦血管，增加腦梗死區(qū)域的血流量，加快患者受損腦組織恢復進程[3]。環(huán)磷酸鳥苷-蛋白激酶G(cGMP)是細胞內(nèi)普遍存在的第二信使，主要作用于三磷酸鳥苷，在腦卒中患者中激活的cGMP可促進蛋白激酶G(PKG)活性的增強，進而對梗死組織起到一定的保護作用[4-5]。蛋白激酶A(PKA)在神經(jīng)元突觸及生長中起著重要的作用[6]。鑒于此，本研究于2020年1月至2021年3月選取32只清潔及健康的雄性昆明大鼠，研究基于cGMP-PKG/PKA信號通路探究奧扎格雷對ACI模型大鼠認知功能的干預機制。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1 材料與方法

1.1 材料 選取32只清潔及健康的雄性昆明大鼠，鼠齡為2～3個月，平均(2.63±0.22)個月，體重為200～300 g，平均(237.50±47.50)g，大鼠均購自中科院上海實驗動物中心，許可批號：SCXK(滬)2003-0002。大鼠的飼養(yǎng)環(huán)境為：溫度27℃，濕度70%，自由飲食飲水。

1.2 方法

1.2.1 ACI模型大鼠的建立 從清潔及健康的32只大鼠中隨機選取24只建立ACI模型，腹腔注射40 mg/100 g水合氯醛，麻醉后沿大鼠頸部中線切開皮膚，暴露大鼠的右側(cè)頸總動脈，然后夾閉頸內(nèi)動脈，在頸總動脈處剪一個小切口，切口處插入線栓，然后將線栓經(jīng)大鼠頸內(nèi)動脈處伸入大腦前動脈，直至出現(xiàn)阻力。建模大鼠神經(jīng)行為學分級達到Ⅰ級以上說明模型建立成功[7]。

1.2.2 分組 建模的24只大鼠分為模型組、低劑量奧扎格雷組、高劑量奧扎格雷組，各8只，未建模的8只為正常組，模型組注射生理鹽水，低劑量奧扎格雷組注射4 mg/(kg·d)的奧扎格雷，高劑量奧扎格雷組注射8 mg/kg的奧扎格雷，所有大鼠連續(xù)干預2周。

1.2.3 認知功能檢測 采用Morris水迷宮實驗檢測各組大鼠逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)、平臺停留時間，定位航行實驗觀察大鼠從4個象限入水后找到平臺的潛伏期，第6天開始空間探索實驗，撤去平臺，然后將大鼠從同一入水點放入水中，記錄大鼠穿越平臺次數(shù)及平臺停留時間。

1.2.4 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)生長因子(NGF)水平檢測 在大鼠隱靜脈處進行采血，待大鼠固定后，將后腿外側(cè)區(qū)域剃毛后暴露采血點，將采血針刺入采血點，采集1 mL的血液，分離上層血清，用酶聯(lián)免疫法檢測BDNF、NGF水平，先將BDNF、NGF稀釋，設(shè)置空白孔和待測樣品孔，將40 μL 各因子稀釋液加入酶標包被板上的待測樣品孔中，用封板膜進行封板，在37℃下溫育30 min，撕掉封膜板，棄去液體，甩干，每個孔中加滿洗滌液，靜置1 min，重復3次，每個孔中加入50 μL的酶標試劑，溫育、洗滌，加入顯色劑，混勻，37℃下避光顯色30 min，加入50 μL Na2HPO4終止反應，在波長450 nm酶標儀上讀取各孔的吸光度，并準確記錄BDNF、NGF水平。

1.2.5 大鼠梗死面積檢測、神經(jīng)功能評分評估 采用線栓法評估大鼠神經(jīng)功能缺損，0分為無神經(jīng)功能缺損，不能伸展對側(cè)前爪為1分，大鼠身體向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈為2分，向手術(shù)對側(cè)傾倒為3分，不能自動行走、意識喪失為4分。大鼠麻醉后迅速斷頭取腦，將前腦冠狀切成2 mm厚的腦片，在0.5%氯化三苯基四氮唑溶液中染色10 min，然后使用10%甲醛溶液固定，染色結(jié)束后正常組織呈白色，梗死組織呈紅色，使用軟件分析梗死范圍。

1.2.6 病理學觀察 將大鼠的腦組織放置在冰盒上，在-25℃下速凍20 min，然后用刀片去除大鼠腦組織的嗅球和小腦部分，從腦前極開始進行冠狀切片，片厚2 mm，使用10%甲醛溶液固定，在氯化三苯基四氮唑溶液中染色處理，在37℃的烘箱中避光孵育25 min，10 min后將腦片翻面，顯微鏡下觀察病理學。

1.2.7 cGMP、PKG、PKA蛋白檢測 Western blot法檢測cGMP、PKG、PKA蛋白，將取出的腦組織超聲粉碎，加入1 mL的RIPA裂解液和10 μL的PMSF，取上清液加入蛋白上樣緩沖液，在100℃下變性15 min，然后將樣品進行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，每個孔中加入40 μg的總蛋白，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜時間為60 min，5%脫脂奶粉封閉60 min，然后加入cGMP、PKG、PKA的一抗抗體，在4℃下過夜，第2天取出后在37℃下放置60 min，TBST洗膜3次，15 min/次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，在37℃下孵育1 h，TBST洗膜3次，15 min/次，然后加入ECL暗室曝光，利用Image J軟件掃描條帶灰度值，計算cGMP、PKG、PKA的量，以GAPDH為內(nèi)參蛋白。

2 結(jié)果

2.1 奧扎格雷對ACI模型大鼠認知功能的影響 與正常組大鼠相比，模型組、低劑量奧扎格雷組、高劑量奧扎格雷組逃避潛伏期較多，穿越平臺次數(shù)、平臺停留時間少(P<0.05)；與模型組大鼠相比，低劑量奧扎格雷組、高劑量奧扎格雷組大鼠逃避潛伏期較少，穿越平臺次數(shù)、平臺停留時間較多(P<0.05)。見表1。

表1 奧扎格雷對ACI模型大鼠認知功能的影響

2.2 奧扎格雷對ACI模型大鼠梗死面積、神經(jīng)功能評分的影響 與正常組大鼠相比，模型組、低劑量奧扎格雷組、高劑量奧扎格雷組大鼠梗死面積、神經(jīng)功能評分較高(P<0.05)；與模型組大鼠相比，低劑量奧扎格雷組、高劑量奧扎格雷組大鼠梗死面積、神經(jīng)功能評分較低(P<0.05)。見表2。

表2 奧扎格雷對ACI模型大鼠梗死面積、神經(jīng)功能評分的影響

2.3 奧扎格雷對ACI模型大鼠BDNF、NGF水平的影響 與正常組大鼠相比，模型組、低劑量奧扎格雷組、高劑量奧扎格雷組大鼠BDNF、NGF水平較低(P<0.05)；與模型組大鼠相比，低劑量奧扎格雷組、高劑量奧扎格雷組大鼠BDNF、NGF水平較高(P<0.05)。見表3。

表3 奧扎格雷對ACI模型大鼠BDNF、NGF水平的影響

2.4 各組大鼠病理學觀察 正常組大鼠腦組織腦細胞排列整齊，無水腫現(xiàn)象；模型組大鼠腦組織水腫、腦細胞排列紊亂、細胞核仁模糊、小膠質(zhì)細胞數(shù)量增多；低劑量奧扎格雷組大鼠腦組織水腫減小，小膠質(zhì)細胞數(shù)量增多；高劑量奧扎格雷組腦細胞排列基本整齊，與正常組大鼠基本相似。見圖1。

注:A:正常組;B:模型組;C:低劑量奧扎格雷組;D:高劑量奧扎格雷組

2.5 奧扎格雷對ACI模型大鼠cGMP、PKG、PKA蛋白的影響 與正常組大鼠相比，模型組、低劑量奧扎格雷組、高劑量奧扎格雷組大鼠cGMP、PKG水平較高，PKA水平較低(P<0.05)；與模型組大鼠相比，低劑量奧扎格雷組、高劑量奧扎格雷組大鼠cGMP、PKG水平較低，PKA水平較高(P<0.05)。見表4和圖2。

圖2 cGMP、PKG、PKA蛋白Western blot檢測

表4 奧扎格雷對ACI模型大鼠cGMP、PKG、PKA蛋白的影響

3 討論

ACI是臨床上常見的一種腦血管疾病，常發(fā)生于中老年人群中，該病與患者腦動脈狹窄、血液流動力學改變、血液成分異常、微栓子脫落、血管內(nèi)皮損傷等因素有關(guān)[8]，ACI患者由于腦部供血不足再加上嚴重缺氧，會嚴重損傷患者的神經(jīng)元細胞進而出現(xiàn)認知功能障礙的現(xiàn)象[9]。

本研究通過觀察大鼠的逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)、平臺停留時間，得出奧扎格雷可有效改善大鼠的認知功能。奧扎格雷對患者神經(jīng)元具有一定的保護作用，可有效改善患者神經(jīng)功能缺損和認知功能，降低梗死面積，增加患者腦部缺血區(qū)域的血流量，使患者受損腦組織快速恢復[10-11]。研究指出[12]，奧扎格雷在改善患者腦能量代謝與缺血腦區(qū)域血流量的過程中，抑制神經(jīng)元細胞的凋亡和血栓的形成，在抗血小板聚集中起到重要作用。ACI患者認知功能障礙的發(fā)生與患者腦部血管病變、腦組織缺血、缺氧密切相關(guān)，可對患者的神經(jīng)組織和腦部認知記憶造成嚴重的損傷[13-14]。

神經(jīng)功能缺損評分和梗死面積是評估ACI的兩項重要內(nèi)容，其中大腦中動脈閉塞可導致神經(jīng)功能嚴重受損[15-16]。本研究顯示，奧扎格雷可明顯降低ACI模型大鼠的梗死面積，改善神經(jīng)功能評分，促進大鼠康復，高劑量奧扎格雷效果更為明顯。

BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員之一，可促進神經(jīng)元的存活和生長，調(diào)節(jié)突觸的可塑性。研究指出[17]，BDNF在維持ACI患者神經(jīng)元功能、防止神經(jīng)元退行性病變等過程中發(fā)揮重要作用，同時還參與大腦的學習和記憶過程，提示BDNF可反映出大鼠認知功能受損程度。NGF作為一種神經(jīng)生長因子，可拮抗神經(jīng)細胞的凋，促進膽堿能神經(jīng)元功能，誘導軸突末端的生長，保護基底前腦膽堿能神經(jīng)元，改善記憶能力[18-19]。國外研究指出[20]，BDNF、NGF水平的降低與大鼠認知功能障礙關(guān)系極為密切。ACI患者腦部缺血、缺氧、梗死周圍去極化、興奮性氨基酸毒性等一系列問題發(fā)生后會影響神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞功能，損傷患者的神經(jīng)元，進而影響患者認知功能。本研究顯示，奧扎格雷可通過提高大鼠體內(nèi)BDNF、NGF水平改善大鼠的認知功能。

本研究顯示奧扎格雷通過調(diào)控cGMP、PKG、PKA蛋白水平來改善大鼠的認知功能。cGMP、PKG是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導通路，參與腦部缺血再灌注損傷過程，當腦部周圍神經(jīng)受損時cGMP、PKG含量會急劇增加，參與ACI發(fā)病過程。研究指出[21]，與正常大鼠相比，ACI模型大鼠體內(nèi)含量較低，推測PKA蛋白的激活是低于腦損傷的重要神經(jīng)保護機制，在神經(jīng)元生長、突觸的可塑性中起著正向調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，高劑量奧扎格雷可通過調(diào)控cGMP、PKG、PKA蛋白水平減少逃避潛伏期，增加穿越平臺次數(shù)及平臺停留時間，進而改善大鼠認知功能，減少大鼠梗死面積和神經(jīng)功能評分，提高BDNF、NGF水平，為臨床上治療ACI提供新的方向。

利益相關(guān)聲明：所有作者均聲明不存在任何利益沖突。

作者貢獻說明：高飛負責實驗設(shè)計、實施和論文撰寫；姚淑芳和陶有亮負責實驗、數(shù)據(jù)分析和指導。