崔文寧

（衡水學院 河北 衡水 053000）

梨黑斑病因傳播性強等特征使其成為世界各地都重視的病害之一[1]。梨黑斑病具有發(fā)病部位廣、危害時間長的特點，主要危害梨的葉、芽和果實。尤其是嫩芽及幼嫩葉片易感病，病害擴散影響梨樹長勢[2]。目前，主要用化學方法對梨黑斑病進行干預，然而化學殺菌劑存在很多隱患，并且長期使用單一的殺菌劑可能會導致病原菌變異，使梨黑斑病菌對藥物產(chǎn)生抗性。因此，急需尋找一種更安全的防治梨黑斑病的方法，代替或者輔助化學防治[3]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料。梨黑斑病菌、20種中藥內(nèi)生細菌均由衡水學院園林實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基制作。①PDA培養(yǎng)基：先稱取200 g土豆，洗凈去皮切成小塊，然后加水煮爛，用紗布過濾雜質，加熱，加12 g瓊脂，同時不斷攪拌并加入葡萄糖30 g，待溫度稍冷卻，加入1 000 ml的無菌水，再等量分配到錐形瓶中，高溫滅菌20 min后取出，放于無菌環(huán)境中備用。②NA培養(yǎng)基：將33 g瓊脂粉加入到1 000 ml蒸餾水中，加熱后于121℃高壓滅菌鍋中滅菌15 min。③牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：用適量的熱水將牛肉膏溶解后，依次加入蛋白胨、NaCl。充分溶解后分裝入錐形瓶，再于121℃高壓滅菌鍋中滅菌20 min。

1.2.2 梨黑斑病菌的分離。取梨病健交界處的組織于PDA培養(yǎng)基上，后置于恒溫箱中培養(yǎng)至獲得純的菌株。

1.2.3 中藥內(nèi)生細菌的分離。先取中藥組織進行殺菌處理，再用無菌研缽研磨成均勻漿液，后將研磨液倒于NA培養(yǎng)基上，置于恒溫箱中培養(yǎng)。

1.2.4 梨黑斑病菌菌絲生長的室內(nèi)抑菌效果初篩。在激活的梨黑斑菌邊緣打取菌餅，再用接種鏟將其倒置接種到PDA平板中心。再用無菌接種環(huán)分別在中心病原菌上下2.5cm處畫一條線，每株菌設3個重復并設對照。于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，測量菌落生長，后每隔24h測量1次，直到對照長滿為止，計算抑制率。

1.2.5 梨黑斑病菌菌絲生長的室內(nèi)抑菌效果復篩。用直徑為0.6 cm的打孔器在梨黑斑病菌附近準確取樣，再用接種鏟將其倒置接種到PDA平板的中央，在距離病原菌周圍3 cm的地方放置3個無菌濾紙片，形成個等邊三角形，在濾紙上滴入20μL配置好的OD值為0.600菌液，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后觀察并測量菌落生長情況，之后每隔24 h測量1次，直至對照長滿，并計算抑菌率。抑菌率計算公式：菌絲生長抑制率(%)＝[(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑]×100。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。使用Excel2019繪制和分析數(shù)據(jù)，并使用SPSS22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 梨黑斑病菌拮抗中藥內(nèi)生菌的篩選。梨黑斑病菌菌絲生長的室內(nèi)抑菌效果初篩得到數(shù)據(jù)如表1所示。由表1可知，這20種內(nèi)生菌中，益母草葉6、益母草葉2、益母草葉4、益母草葉1、知母根6和益母草葉8這6種內(nèi)生菌對梨黑斑病菌有較顯著抑制作用，抑制率最高達到92.55%。這6種細菌之間差異不顯著，進行下一步實驗；而益母草根2、益母草根4、知母根5、知母葉2、知母根3、知母葉1、知母根4這7種細菌抑菌效果不明顯，抑菌率低于30%，分別為2.74%、7.84%、7.84%、9.41%、14.15%、17.25%、26.27%，這7種細菌的抑菌效果較差，舍去；其余7種細菌抑菌率在30%～80%，抑菌效果一般，舍去。

表1 中藥內(nèi)生細菌對梨黑斑病菌菌絲生長抑制效果

2.2 中藥內(nèi)生細菌對梨黑斑病菌菌絲生長的拮抗性能比較。根據(jù)初篩結果，選用的6種對病菌抑制效果較好的內(nèi)生菌，以濾紙片法測定對病菌進行了復篩，結果如表2所示。由表2可知，這6種中藥內(nèi)生細菌對梨黑斑病菌都具有抑制作用，其中益母草葉4抑制效果最好，平均抑菌率高達到60.39%，而益母草葉6和益母草葉2抑制效果一般，平均抑菌率分別為42.75%、40.39%。益母草葉4與其他幾種內(nèi)生細菌之間差異顯著。益母草葉1、知母根6和益母草葉6三者之間無顯著差異，但三者與益母草葉8和益母草葉2差異顯著。

表2 初篩得到的內(nèi)生細菌對梨黑斑病菌菌絲生長抑制效果

3 結論與討論

內(nèi)生細菌在防治植物病害和促進植物健康生長方面具有非常巨大的應用潛力[4]。內(nèi)生細菌進一步構成植物內(nèi)部自然的防御體系，可起到全面化、多元化的預防和促進作用[5]。本次試驗中大部分內(nèi)生細菌對梨黑斑病菌有著較好的抑菌效果，其中益母草葉4對抗菌群產(chǎn)生的防御最強，抑菌率達60.39%，能夠達到比其他處理更加穩(wěn)定的效果，而益母草葉1、知母根6、益母草葉6對病原菌抑制效果較好，益母草葉2和益母草葉8對病原菌抑制效果不明顯，還需進一步試驗研究。所以，益母草葉4對梨黑斑病菌能起到抑制作用，這為進一步研究中藥內(nèi)生菌防治梨黑斑病菌奠定了一定基礎。