王豐園 金海炎 丁凌飛 魯云風(fēng)*

（1南陽師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 河南 南陽 473061；2車用生物燃料技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河南 南陽 473000）

為解決日益加重的能源枯竭問題，近年來各個(gè)國家為尋找新型清潔可再生能源開展了大量研究。纖維素是葡萄糖以β-1，4-糖苷鍵聚合而成，是地球上最豐富的可再生生物質(zhì)，但是目前對纖維素的利用主要體現(xiàn)在直接燃燒，不僅利用率低，而且還造成大氣污染，因此對纖維素的有效利用成為人們關(guān)注的核心問題。纖維素酶是纖維素有效利用的關(guān)鍵因素，目前纖維素酶主要應(yīng)用于食品業(yè)、畜牧業(yè)、醫(yī)藥業(yè)、紡織業(yè)和生物質(zhì)能源等產(chǎn)業(yè)[1]，但是這些產(chǎn)業(yè)都要求纖維素酶產(chǎn)量大且活性高。因此，如何快速提高纖維素酶活性和纖維素酶的產(chǎn)量，降低纖維素工業(yè)化生產(chǎn)成本，是纖維素酶快速應(yīng)用于工業(yè)的關(guān)鍵性技術(shù)問題。本文從纖維素酶的來源、纖維素酶活性的影響因素以及提高纖維素酶活性的主要方法等幾個(gè)方面進(jìn)行闡述，以期為纖維素酶產(chǎn)業(yè)發(fā)展和纖維素有效利用提供理論依據(jù)。

1 木質(zhì)纖維素

木質(zhì)纖維素被譽(yù)為地球上最豐富的可再生生物質(zhì)，是植物和藻類等綠色植物利用光合作用固定二氧化碳的產(chǎn)物，也是地球上含量最多、分布最廣的碳水化合物之一；自然界的木質(zhì)纖維素材料主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素有機(jī)結(jié)合組成[2]。

半纖維素和木質(zhì)素通過一種特殊的結(jié)合方式，緊緊的環(huán)繞在纖維素的外面，有效地保護(hù)了纖維素內(nèi)部的結(jié)構(gòu)，使得木質(zhì)纖維素的二次利用非常困難，因此，木質(zhì)纖維素開發(fā)的關(guān)鍵在于如何安全有效的破壞掉纖維素外面的“保護(hù)層”。目前主要采用酸處理、堿處理及微生物酶解處理等方法，破壞木質(zhì)纖維素的基本結(jié)構(gòu)，增大底物和酶的接觸面積，從而有效提高木質(zhì)纖維素的綜合利用率[3～4]。

天然的纖維素分子結(jié)構(gòu)是由結(jié)晶區(qū)纖維素和非結(jié)晶區(qū)纖維素相互交錯(cuò)排列形成的(圖1)。結(jié)晶區(qū)纖維素比非結(jié)晶區(qū)部分更難被酶攻擊，晶態(tài)纖維素含量較高，這意味著纖維素的降解率會較低[5]。纖維素酶主要降解纖維素的非結(jié)晶區(qū)，當(dāng)作用于晶體纖維素時(shí)會嚴(yán)重受阻，極大地降低纖維素酶與底物的結(jié)合率，因此會降低生物質(zhì)的酶解效率。通過在不同生物質(zhì)中的研究表明：生物質(zhì)經(jīng)過復(fù)雜的預(yù)處理后，纖維素結(jié)晶度是酶解效率的重要負(fù)影響因子之一[6]。

圖1 纖維素結(jié)晶區(qū)與非結(jié)晶區(qū)展示圖[7]

2 纖維素酶

纖維素酶是可降解纖維素的一類復(fù)雜酶系的總稱，目前公認(rèn)的主要功能酶有內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶(EGs，EC 3.2.1.4)、外切β-1，4-葡聚糖酶(CBHs，EC 3.2.1.91)和β-1，4-葡萄糖苷酶(BGs，EC 3.2.1.21)3類[8]；關(guān)于纖維素降解機(jī)理，研究人員普遍接受和認(rèn)同的理論是協(xié)同降解理論(圖2)，其基本原理和特點(diǎn)是內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶首先發(fā)揮作用，它可以識別并切斷長鏈纖維素分子內(nèi)部的β-1，4-糖苷鍵，產(chǎn)生大量的短鏈纖維素，為外切β-1，4-葡聚糖酶發(fā)揮作用奠定了基礎(chǔ)。外切β-1，4-葡聚糖酶可以識別并切斷纖維素分子末端的β-1，4-糖苷鍵，識別位置在末端2號位或4號位，形成許多纖維二糖和纖維四糖，纖維四糖繼續(xù)被該酶水解為纖維二糖。最后β-葡萄糖苷酶能夠?qū)⒆R別并酶解纖維二糖β-1，4-糖苷鍵，生成葡萄糖[9]，該酶在整個(gè)纖維素降解體系中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，可以消除前2種酶的產(chǎn)物抑制效應(yīng)，是纖維素降解酶系中的限速酶。

圖2 纖維素酶協(xié)同降解纖維素[10]

3 纖維素酶來源

自然界為纖維素酶的來源提供了廣闊的途徑，在細(xì)菌、真菌、放線菌中都有大量的分布。

3.1 細(xì)菌。目前產(chǎn)纖維素酶的主要細(xì)菌類型及相應(yīng)研究較多的菌屬有厭氧發(fā)酵菌熱解纖維素菌屬(Caldicellulosiruptor)、梭菌屬(Clostridium)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、纖維桿菌屬(Fibrobacter)、醋酸弧菌屬(Acetivibrio)、丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)；好氧發(fā)酵菌熱桿菌屬(Caldibacillus)、熱酸菌屬(Acidothermus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、小雙孢菌屬(Microbispora)、高溫單胞菌屬(Thermomonospora)、嗜纖維菌屬(Cytophaga)、生孢嗜纖維菌屬(Sporocytophaga)等。有研究表明，細(xì)菌降解纖維素的能力較弱，是因?yàn)槠渲荒芊置谄暇厶莾?nèi)切酶，大部分都沒有降解纖維素晶體的作用，并且細(xì)菌產(chǎn)生的纖維素酶不能分泌到胞外，酶的提取和純化難度大、成本高，所以目前不適合用于工業(yè)生產(chǎn)[11]。對細(xì)菌的開發(fā)應(yīng)著重于厭氧或兼性厭氧菌方面，主要在于這些菌種在環(huán)境保護(hù)和飼料發(fā)酵等方面作用尤其突出，因?yàn)榻到馕畚锢w維素和飼料發(fā)酵加工等都在缺氧條件下進(jìn)行，好氧真菌則無法使用[12]。

3.2 真菌。真菌是目前已知的產(chǎn)纖維素酶的能力較強(qiáng)的微生物，主要在于真菌可以分泌胞外纖維素酶，真菌在生長過程中，其菌絲可以穿透植物的角質(zhì)層，破壞掉部分木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)暴露出纖維素，其分泌的胞外纖維素酶可直接與纖維素結(jié)合進(jìn)行酶解，從而提高降解效率。目前為止產(chǎn)纖維素酶真菌中研究較多的有木霉屬(Trichoderma)、青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)等[13]。迄今發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)纖維素酶真菌中，大部分為好氧型，但也有部分是厭氧型的；張艷英[14]研究了哺乳動物的瘤胃液中的產(chǎn)纖維素酶真菌，并成功分離出8株厭氧型產(chǎn)纖維素酶真菌。不同營養(yǎng)類型的真菌也為纖維素資源化利用的不同場景提供了可能。

3.3 放線菌。放線菌降解纖維素的能力要比真菌和細(xì)菌低的多，是因?yàn)槠浯x非常慢，產(chǎn)纖維素酶量極低，分泌的纖維素酶種類較少，且對纖維素酶活性較弱，因此很少應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)。但是放線菌產(chǎn)生的纖維素酶在強(qiáng)堿和高溫環(huán)境下仍然能較高的維持其原有的纖維素酶活性，目前研究較多的主要是纖維放線菌、玫瑰色放線菌以及黑紅旋絲放線菌[15]。

3.4 其它來源。自然界中能夠高效降解木質(zhì)纖維素的系統(tǒng)還有很多，其中白蟻與其共生微生物協(xié)同降解木質(zhì)纖維素一直被世界各國學(xué)者所關(guān)注；目前認(rèn)為白蟻降解木質(zhì)纖維素體系是通過白蟻?zhàn)陨矸置诘膬?nèi)源纖維素酶和其共生微生物分泌的外源纖維素酶協(xié)同發(fā)揮作用，是一種雙重降解機(jī)制。梁世優(yōu)[16]等研究了培菌白蟻的共生機(jī)制，培菌白蟻獨(dú)特生存方式是在其巢內(nèi)形成的一種三維立體多孔狀結(jié)構(gòu)—“菌圃”，這種特殊結(jié)構(gòu)為共生菌雞樅菌(Termitomycesspp)提供了生存空間，二者互利共生，形成了獨(dú)特的木質(zhì)纖維素降解體系。培菌白蟻的共生真菌是通過水平傳播得到的，但是在大白蟻屬及小白蟻屬中共生菌的來源是垂直傳播得到的，有研究表明成熟的蟻巢中僅存在一種共生真菌。

4 提高纖維素酶活性的策略

纖維素酶本質(zhì)是蛋白質(zhì)，其活性受溫度、pH值、酶濃度、底物濃度和離子強(qiáng)度等影響，不同種類的纖維素酶有不同的最適反應(yīng)條件。纖維素酶具有作用條件溫和、特異性強(qiáng)、不產(chǎn)生其他雜物、安全、無污染等優(yōu)點(diǎn)，是纖維素工業(yè)化的研究熱點(diǎn)。但目前纖維素酶普遍存在酶解效率低、反應(yīng)時(shí)間長等問題，這導(dǎo)致第一次纖維素乙醇工業(yè)失敗[17]。為解決這一問題，各國學(xué)者采取了多種策略以提高纖維素酶活性，包括添加合適的酶助劑、對微生物進(jìn)行誘變改良、基因工程育種和原生質(zhì)體融合育種等。

4.1 添加酶助劑。表面活性劑(Surfactant，SF)是具有1個(gè)疏水基團(tuán)和1個(gè)親水基團(tuán)的一種兩親性分子，能夠表現(xiàn)出乳化、增溶等特性，從而通過增加酶、底物以及溶劑的互溶來提高酶解效率。根據(jù)其極性基團(tuán)的解離性質(zhì)，SF可分為離子型和非離子型。非離子型SF對纖維素酶的酶解效率促進(jìn)較大，如Tween(吐溫)和聚乙二醇，因其具有穩(wěn)定性高、溶解性好等優(yōu)點(diǎn)，在提高纖維素水解率上有顯著作用[18]。楊耀剛[19]等研究發(fā)現(xiàn)金屬離子與表面活性劑可不同程度的提高搖瓶中還原糖的含量，即可提高纖維素酶解效率，其中促進(jìn)效果最好的金屬離子是Co2+和Cu2+，促進(jìn)效果最好的表面活性劑是SDS(十二烷基硫酸鈉)。王亞林[20]等研究發(fā)現(xiàn)表面活性劑Tween80和“一枝花”洗衣粉均能有效促進(jìn)木霉菌產(chǎn)生纖維素酶。王超[21]等研究結(jié)果表明：Na+、Ca2+、Mn2+、Zn2+對該纖維素酶活性有促進(jìn)作用。

4.2 微生物誘變育種。在微生物發(fā)酵工業(yè)中，通過人為的方式對菌種施加某種誘變因素，使微生物遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，引起細(xì)胞物質(zhì)代謝改變，通過篩選可以得到高產(chǎn)菌株，降低工業(yè)化生產(chǎn)成本；目前常用的誘變技術(shù)分為物理誘變、化學(xué)誘變和復(fù)合理化誘變。徐廣偉[22]通過復(fù)合理化誘變(紫外照射-LiCl)康氏木霉，篩選出1株突變株E-1 CMC(羧甲基纖維素鈉)，其酶活增長率是350.5%，而FPA(濾紙酶活)酶活增長率是87.65%。

4.3 基因工程育種?；蚬こ逃N是直接對纖維素酶基因進(jìn)行改造，可以快速、定向地對纖維素酶基因進(jìn)行修飾，獲得新的高比活力纖維素酶。改造后的纖維素酶在穩(wěn)定性和催化活性等方面也有很大的提升，對提高酶的生產(chǎn)效率及降低生產(chǎn)成本具有重要意義。因此，通過基因工程構(gòu)建高效表達(dá)高活性纖維素酶的基因工程菌，是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。人們已經(jīng)將纖維素酶的基因克隆到細(xì)菌、酵母、真菌中，并得到了重組型纖維素酶的表達(dá)菌株。丁軻[23]等利用PCR及酶切等技術(shù)將2個(gè)纖維素酶基因連接在一個(gè)開放閱讀框內(nèi)，構(gòu)建重組表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)。隨后通過大腸桿菌搖瓶培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中成功檢測出融合纖維素酶，通過試驗(yàn)該酶可適應(yīng)較廣的溫度和pH值范圍，酶活性對金屬離子敏感。還可以利用基因工程技術(shù)，來抑制阻遏基因的表達(dá)，從而提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。鄧嘉雯[24]等通過構(gòu)建多靶向siRNA表達(dá)載體對里氏木霉碳阻遏抑制因子進(jìn)行干擾，成功抑制里氏木霉的分解代謝物阻遏基因的表達(dá)，使得纖維素酶基因能夠充分表達(dá)，通過搖瓶培養(yǎng)檢測纖維素酶活力，干擾后的纖維素酶活性明顯比原始菌株要高。還有一些學(xué)者利用基因敲除技術(shù)，來修改表達(dá)基因，得到高產(chǎn)菌株，如劉富川[25]等采用基因敲除技術(shù)，去除掉纖維素酶轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子bglr基因及其上下游序列，獲得bglr基因敲除的菌株EU7-22Δbglr，該菌的纖維素酶活力均有不同程度提高?；蚯贸夹g(shù)是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，其應(yīng)用廣泛，目的性較強(qiáng)。

4.4 原生質(zhì)體融合育種。原生質(zhì)體融合(Protoplast Fusion)是一種基因重組技術(shù)。用相應(yīng)水解酶除去細(xì)胞壁，制成由細(xì)胞膜包被的裸細(xì)胞，然后選擇適當(dāng)?shù)奈锢?、化學(xué)或生物的方法進(jìn)行誘導(dǎo)融合，經(jīng)過融合，遺傳物質(zhì)重組并成功生存下來，通過篩選可獲得有效產(chǎn)物的高產(chǎn)菌株，為微生物應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)提供廣闊空間。該技術(shù)已成為微生物育種的研究熱點(diǎn)。研究者利用原生質(zhì)體融合技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)既能產(chǎn)生纖維素酶，又能產(chǎn)生木質(zhì)素酶的強(qiáng)化菌株；對于纖維素酶生產(chǎn)菌株的改良，原生質(zhì)體融合技術(shù)比常規(guī)雜交育種具有更大的優(yōu)越性。張素敏[26]等通過制備產(chǎn)纖維素酶菌株里氏木霉T306原生質(zhì)體，分別將其進(jìn)行紫外照射和微波輻射雙親滅活后，通過化學(xué)試劑聚乙二醇誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合，原生質(zhì)體融合率為0.5%。經(jīng)過2輪原生質(zhì)體融合試驗(yàn)，通過篩選獲得1株遺傳穩(wěn)定，纖維素酶活力較出發(fā)菌株有明顯提高的融合子。曾柏全[27]等將高產(chǎn)纖維素酶的青霉菌與強(qiáng)抗逆性的枯草芽孢桿菌分別經(jīng)過高溫、紫外雙親滅活后，通過化學(xué)試劑聚乙二醇誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合，最終成功篩選出了1株抗逆性比原始菌株有明顯提高的高產(chǎn)纖維素酶優(yōu)良菌株。

5 展望

目前選育的產(chǎn)纖維素酶系菌株，都存在產(chǎn)酶量不高、酶活性較低等問題，造成生產(chǎn)成本高，不能應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。自然界的菌株均難滿足工業(yè)化生產(chǎn)要求，必須對其進(jìn)行適當(dāng)改良，以適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)。在對菌株改良的方法中，復(fù)合理化誘變效果最為理想，廣泛應(yīng)用于各種菌株改良，具有效率高、操作簡單等特點(diǎn)，但是誘變育種存在不定向性和盲目性，要進(jìn)行多次重復(fù)試驗(yàn)才有可能獲得理想菌株。這是因?yàn)槿藗冃枰漠a(chǎn)物往往是多基因控制的，例如目的產(chǎn)物代謝途徑上的結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因、輔助基因等，這些基因不可能通過一次誘變?nèi)恳鹜蛔儯@得高產(chǎn)菌株，即使有這種可能，菌體DNA由于一次性改變太大，細(xì)胞代謝嚴(yán)重失調(diào)，而失去生存的可能性。但是復(fù)合理化因素交替處理時(shí)，誘變劑量應(yīng)適中或偏低。

原生質(zhì)體融合技術(shù)是獲得多功能產(chǎn)酶強(qiáng)化菌株的關(guān)鍵，首先要從自然界獲得性狀優(yōu)良的菌株，經(jīng)過誘變改良后，可以作為原生質(zhì)體融合的親本，經(jīng)過融合可獲得多功能強(qiáng)化菌株。原生質(zhì)體融合比常規(guī)遺傳育種具有明顯優(yōu)勢，它使親本的全部遺傳物質(zhì)進(jìn)行重組，雙親優(yōu)良性狀的保留率更高，但是原生質(zhì)體融合存在較大重組隨機(jī)性。相比以上方法，基因工程育種具有可操作性及目的性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，目前在實(shí)驗(yàn)室階段已成功克隆纖維素酶基因，并轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，但其目的產(chǎn)物分泌量不盡人意，還需進(jìn)一步研究。另外還應(yīng)結(jié)合基因修飾技術(shù)來改良產(chǎn)纖維素酶基因，以構(gòu)建出快速高效表達(dá)纖維素酶的基因組成。除了研究菌株內(nèi)部因素外，添加酶助劑等外部因素也很重要，因此，也應(yīng)加大尋找理想的酶助劑的研究力度，使纖維素酶的活性能更好的發(fā)揮出來。

選育和改良酶活性高、耐受性好、酶系多樣均衡的高產(chǎn)纖維素酶菌株仍然是纖維素酶產(chǎn)業(yè)化研究的重點(diǎn)。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，對高產(chǎn)纖維素酶工程菌研究的逐漸深入和完善，將大大地推動纖維素酶產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。