武林琳

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花研究所 山西 運(yùn)城 044000）

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)水平發(fā)展，國(guó)民對(duì)自身健康高度重視，這使得對(duì)蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的需求直線增加。肉、蛋、奶、豆是蛋白質(zhì)的主要來(lái)源，其中豆類因價(jià)格低廉、營(yíng)養(yǎng)豐富廣受關(guān)注。在豆類中，大豆蛋白質(zhì)豐富，且含有不飽和脂肪和多種人體必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，成為人們研究的重點(diǎn)。近年來(lái)，大豆制品因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富、不含肉類中的膽固醇、生產(chǎn)成本低廉，已成為公認(rèn)的最理想的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。營(yíng)養(yǎng)學(xué)家亦認(rèn)為豆制品既可滿足人們的營(yíng)養(yǎng)需求，又可預(yù)防營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩，因此研究者們預(yù)言21世紀(jì)將是“大豆世紀(jì)”。

為提高大豆產(chǎn)量，科研工作者將基因工程技術(shù)和分子輔助育種技術(shù)相結(jié)合，目前已培育出一些高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的大豆品種，即轉(zhuǎn)基因大豆。轉(zhuǎn)基因大豆高產(chǎn)、價(jià)廉、抗逆性強(qiáng)，因而被迅速推廣使用。轉(zhuǎn)基因大豆在大面積商品化過(guò)程中帶來(lái)了巨大經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益與環(huán)境效益，但同時(shí)也產(chǎn)生了許多問(wèn)題[1～3]。我國(guó)自1995年起，大豆由凈出口變?yōu)閮暨M(jìn)口，且進(jìn)口量逐年增加[4]。自耐除草劑的轉(zhuǎn)基因大豆于20世紀(jì)末被進(jìn)口后，越來(lái)越多的轉(zhuǎn)基因大豆相關(guān)產(chǎn)品逐漸進(jìn)入人們生活。加強(qiáng)對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆的檢測(cè)，對(duì)發(fā)展我國(guó)大豆產(chǎn)業(yè)具有重要意義，而首要任務(wù)是建立有效的檢測(cè)大豆轉(zhuǎn)基因成分的方法[5]。

目前常用的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)方法根據(jù)其檢測(cè)成分不同劃分為檢測(cè)蛋白質(zhì)、酶和核酸的方法。不同的成分檢測(cè)方法及效率各不相同。PCR技術(shù)用于檢測(cè)核酸，是針對(duì)基因的一種檢測(cè)技術(shù)，對(duì)轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)具有極強(qiáng)的針對(duì)性。此外，PCR技術(shù)又因其靈敏度高、快速、高效等特點(diǎn)，成為目前檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物成分最常用的技術(shù)之一。PCR檢測(cè)結(jié)果可重復(fù)性強(qiáng)，具有較高的可靠性和適應(yīng)性。核酸是生物的遺傳物質(zhì)，通過(guò)轉(zhuǎn)錄、翻譯、修飾等生物學(xué)過(guò)程決定生物的生長(zhǎng)、遺傳、變異等。因此，在DNA水平對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)行檢測(cè)，意義重大。

本文用CTAB法和SDS法分別對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆幼嫩葉片DNA進(jìn)行分離純化：首先使用去污劑破裂細(xì)胞膜和細(xì)胞核核膜，之后將蛋白質(zhì)和多糖沉淀去除，最后沉淀純化DNA[6]，然后再用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，以期研究出適合提取大豆DNA的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料。轉(zhuǎn)基因大豆幼嫩葉片。

1.1.2 試劑。液氮、CTAB、SDS、Tris Cl(pH值8.0)、EDTA(pH值8.0)、NaCl、酚、氯仿、異戊醇、無(wú)水乙醇、沉淀DNA、NaAc、巰基乙醇、超純水或TE溶液。

1.1.3 儀器與設(shè)備。研缽、恒溫水浴、離心機(jī)、離心管。

1.2 樣品基因組DNA的提取及純化方法

1.2.1 CTAB法提取轉(zhuǎn)基因大豆DNA。①將1.0 g葉片放于含有液氮的研缽中研磨成粉末，將研磨后的粉末移入1.5 ml離心管后加入600μl CTAB溶液(預(yù)先加0.2%的巰基乙醇，預(yù)熱至65℃)；②將上述離心管移入65℃水浴鍋中，1 h后使用低溫高速離心機(jī)離心15 min(12 000 rpm，4℃)；③冷卻后，加入600μl的酚∶氯仿∶異戊醇(300∶288∶12)混勻，用12 000 rpm離心機(jī)在4℃下離心15 min；④吸取上清液，將其轉(zhuǎn)入一新的離心管，加入600μl氯仿∶異戊醇(576∶24)，低溫高速離心15 min(12 000 rpm，4℃)；⑤將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入3 mol/L NaAc(1/3體積)充分沉淀DNA；⑥在離心管中加入1 ml的-20℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇，充分混勻后將離心管置于-20℃中3～4 h(或在-80℃環(huán)境放置30 min)；⑦將上述離心管12 000 rpm離心10 min，丟棄上清液后加入75%乙醇洗滌3次，將離心管中物質(zhì)倒入吸水紙上晾干；⑧加入雙蒸水(10～20μl)溶解。

1.2.2 SDS法提取基因組DNA。①將1.0 g葉片放于含有液氮的研缽中研磨成粉末，將研磨后的粉末移入1.5 ml離心管；②依次向離心管中加入10 ml提取緩沖液、0.7 ml的20%SDS，充分混勻后置于60℃中30 min，整個(gè)過(guò)程不斷晃動(dòng)；③待離心管中的物質(zhì)冷卻至室溫后，使用8 000 rpm離心5 min，吸取1 ml上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，根據(jù)說(shuō)明加入各種試劑，使用氯仿代替苯酚，提取DNA；④最后加入0.2 TE緩沖液100μl溶解DNA。

1.3 瓊脂糖凝膠電泳方法。使用瓊脂糖凝膠通過(guò)電泳技術(shù)將核酸根據(jù)大小和構(gòu)象分離開，進(jìn)而進(jìn)行核酸分析。瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)廣泛用于農(nóng)業(yè)科學(xué)領(lǐng)域，在生物化學(xué)和分子生物學(xué)中具有重要作用[8～11]。瓊脂糖是從海洋生物瓊脂中提取的經(jīng)糖基化修飾后的產(chǎn)物，是聚合鏈線性分子，在電泳過(guò)程中發(fā)揮分子篩功能，可將不同大小和構(gòu)象的核酸分子分離開，達(dá)到分離核酸的目的[12～14]。具體操作過(guò)程如下：①根據(jù)說(shuō)明書配制1%的瓊脂糖凝膠，加入EB染料。EB是一種高度靈敏的熒光染色劑，可以與核酸形成絡(luò)合物，在紫外光的激發(fā)下產(chǎn)生橘黃色的熒光，以便后期進(jìn)行DNA的觀察；②將2μl的DNA溶液與1μl的6×Loading Buffer混合后點(diǎn)樣。Loading Buffer中的藍(lán)色燃料可指示樣品的遷移過(guò)程；③80V恒壓電泳40 min；④最后將電泳后的瓊脂糖凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中成像并分析。

2 結(jié)果與分析

分別采用CTAB和SDS這2種方法從大豆幼嫩葉片中提取基因組DNA，DNA電泳結(jié)果如圖1、圖2所示。從圖中可以直觀地看到，雖然電泳時(shí)2組DNA上樣量相同，但DNA條帶亮度有較大區(qū)別：

2.1 SDS法提取DNA效果。SDS法(圖1)提取的20個(gè)DNA樣品在電泳時(shí)發(fā)現(xiàn)其DNA條帶亮度較低，有的甚至看不到，說(shuō)明DNA的量不充足；另外圖1中部分上樣孔較亮，且條帶下方基本都有明顯拖尾現(xiàn)象，這提示該組DNA降解嚴(yán)重，也說(shuō)明該組上樣樣品中可能存在較多雜質(zhì)(蛋白質(zhì)、多糖等)，而且由于提取過(guò)程中沒(méi)有添加RNA酶，所以顯示有9個(gè)泳道RNA還比較多，由于這些原因造成DNA純度相對(duì)較差。

2.2 CTAB法提取DNA效果。利用CTAB法(見圖2)提取的19個(gè)樣品的DNA，每個(gè)泳道均顯示出明顯的條帶，說(shuō)明利用這種方法均提取出各個(gè)樣品的基因組DNA，雖然也有拖尾信號(hào)，也有部分DNA降解，但是每條DNA條帶均比圖1中的條帶清晰、明亮，說(shuō)明利用CTAB法比用SDS法更容易提取出樣品的基因組DNA，而且提取的DNA數(shù)量更多、質(zhì)量更好，更能保證后續(xù)各項(xiàng)研究的使用。

圖1 SDS法提取的大豆基因組

圖2 CTAB法提取的大豆基因組

3 結(jié)論與討論

3.1 本試驗(yàn)以大豆幼嫩葉片為材料，研究CTAB法和SDS法提取DNA的效果，目的是比較2種方法的優(yōu)劣，從而篩選出更為高效的大豆DNA提取方法。在本研究中，我們每組的樣本均為1 g大豆幼嫩葉片，從中提取大豆DNA，使得本次檢測(cè)結(jié)果可以代表大豆整體DNA特點(diǎn)。同時(shí)在本研究中的SDS法中，我們使用氯仿代替苯酚抽提去雜質(zhì)，盡量避免了苯酚導(dǎo)致的DNA降解[15]。雖然我們已優(yōu)化SDS法，但從研究結(jié)果看，SDS法提取DNA仍比CTAB法DNA降解率高。

3.2 CTAB法的核心是CTAB。CTAB陽(yáng)離子去污劑可使蛋白質(zhì)變性，同時(shí)與變性后的蛋白質(zhì)和多糖形成復(fù)合物，使DNA被完全釋放。之后通過(guò)氯仿、不同濃度的鹽溶液去除雜質(zhì)，最終獲取高質(zhì)量、降解率低的DNA。本研究圖2的瓊脂糖凝膠電泳圖譜顯示DNA較完整，這與Mafra等人的研究結(jié)果相一致。

3.3 SDS法的核心是SDS。SDS使蛋白質(zhì)變性，之后與蛋白質(zhì)、多糖形成復(fù)合物，釋放DNA。通過(guò)此種方法可獲得較多的DNA，但同時(shí)存在的問(wèn)題是最終提取的DNA中雜質(zhì)較多，DNA純度差，我們的研究亦表明這一點(diǎn)。這些結(jié)果與張偉[16]等人的研究結(jié)果相一致。

3.4 實(shí)際工作中經(jīng)常涉及到對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆基因組的檢測(cè)，這就需要我們通過(guò)多方比較，篩選出最高效、快捷、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法。本研究中，CTAB法每次檢測(cè)需要5 h左右，而SDS法至少需要7 h，且CTAB法提取DNA純度比SDS法高，由此可見CTAB法步驟簡(jiǎn)便、用時(shí)短，比起SDS法更適合在實(shí)際檢測(cè)工作中推廣。

綜上所述，CTAB法提取的DNA純度和完整性較好，DNA降解率極低，且操作步驟簡(jiǎn)易、高效，適宜在大豆DNA提取工作中推廣使用。