余永雄，陳唯，陳潔，梁棟，黃小娟，廖彭

(廣西壯族自治區(qū)梧州市婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣西梧州 543002)

地中海貧血(thalassemia，簡(jiǎn)稱“地貧”)是源于珠蛋白基因突變而引起珠蛋白合成障礙，導(dǎo)致溶血性貧血的一類常染色體隱性遺傳血液病。地貧的分子基礎(chǔ)復(fù)雜、突變類型多，地貧數(shù)據(jù)庫(kù)(Http://globin.bx.psu.edu/)資料顯示，目前已報(bào)道1 600多種珠蛋白基因突變[1]。在臨床工作中發(fā)現(xiàn)，有些地貧表型篩查陽(yáng)性的個(gè)體，常規(guī)試劑盒未檢出常見(jiàn)地貧基因，須進(jìn)一步采用相應(yīng)的技術(shù)方法檢測(cè)其他基因突變，以確定其基因型而防止漏檢。本研究通過(guò)對(duì)廣西梧州地區(qū)地貧流行現(xiàn)狀、罕見(jiàn)基因型類型及表型特征的調(diào)查研究，了解本地區(qū)地貧基因的突變譜，為建立適用可靠的地貧分子篩查和基因診斷方法、有效實(shí)現(xiàn)地貧的人群防控提供科學(xué)的理論根據(jù)。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 2019年1月至2020年12月于梧州市婦幼保健院及梧州地區(qū)三縣一市各婚育服務(wù)中心接受婚前及產(chǎn)前地貧篩查的夫婦共31 008例，年齡20～42歲，簽署知情同意書(shū)后，采集各研究對(duì)象外周靜脈血各2份，EDTA-K2抗凝，其中1份4 ℃保存，用于檢測(cè)紅細(xì)胞參數(shù)和進(jìn)行血紅蛋白電泳，另1份-20 ℃保存，用于后續(xù)所需的地貧基因檢測(cè)。

1.2主要儀器與試劑 XN-1000血液細(xì)胞分析儀及配套檢測(cè)試劑(日本希森美康公司)， VariantTMⅡ血紅蛋白分析系統(tǒng)及配套檢測(cè)試劑(美國(guó)Bio-Rad公司)，Capillarys2 Flex Piercing毛細(xì)管電泳儀及配套檢測(cè)試劑(法國(guó)Sebia公司)，全自動(dòng)核酸提取儀及配套基因組DNA提取試劑盒(廈門(mén)致善生物公司)，PCR擴(kuò)增儀(珠海黑馬公司)，缺失型α-地貧基因試劑盒(深圳益生堂生物公司)，非缺失型α-地貧基因和β-地貧基因試劑盒(深圳亞能生物公司)等。

1.3血液學(xué)表型分析 用XN-1000血液細(xì)胞分析儀檢測(cè)血紅蛋白含量(Hb)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(MCH)；用VariantTMⅡ血紅蛋白分析系統(tǒng)或Capillarys2 Flex Piercing毛細(xì)管電泳儀檢測(cè)Hb組分。根據(jù)廣西地貧篩查及產(chǎn)前診斷技術(shù)規(guī)范，以MCV<82 fL和/或MCH<27 pg、HbA2升高或降低、HbF升高、檢出異常血紅蛋白等為表型篩查陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)，將初篩陽(yáng)性樣本進(jìn)行后續(xù)的地貧基因檢測(cè)。

1.4常規(guī)地貧基因檢測(cè) 按全自動(dòng)核酸提取儀及配套試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取基因組DNA，滅菌雙蒸水稀釋至50～100 ng/μL。按各試劑盒說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)中國(guó)人群常見(jiàn)的4種缺失型α-地貧基因(--SEA、-α4.2、-α3.7、--THAI)、3種非缺失型α-地貧基因(αWSα、αQSα、αCSα)和17種β-地貧基因點(diǎn)突變CD41-42(-CTTT)、IVS-Ⅱ-654(C>T)、-28(A>G)、CD71-72(+A)、CD17(AAG>TAG)、CD26(GAG>AAG)、CD31(-C)、CD27/28(+C)、IVS-Ⅰ-1(G>T)、CD43(GAG>TAG)、-32(C>A)、-29(A>G)、-30(T>C)、CD14-15(+G)、CAP+40-43(-AAAC)、起始密碼子Int(ATG>AGG)、IVS-Ⅰ-5(G>C)。

1.5罕見(jiàn)地貧基因及異常血紅蛋白基因分析 按表型與基因型相結(jié)合的地貧基因診斷原則，對(duì)有地貧表型特征或異常血紅蛋白組份未檢出地貧基因、基因型結(jié)果與表型參數(shù)不符的樣本，送深圳亞能生物技術(shù)公司，根據(jù)紅細(xì)胞表型參數(shù)及血紅蛋白組分等具體情況，采用多重鏈接探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA)、缺口PCR(Gap-PCR)、基因測(cè)序等相應(yīng)技術(shù)對(duì)珠蛋白基因進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果與人類珠蛋白基因數(shù)據(jù)庫(kù)(http://globin.bx.psu.edu/)進(jìn)行比對(duì)分析，以確定其基因型。

2 結(jié)果

2.1地貧常規(guī)基因檢測(cè)結(jié)果 31 008例人群樣本中，地貧血液學(xué)表型初篩陽(yáng)性7 853例。經(jīng)常規(guī)試劑盒檢測(cè)常見(jiàn)地貧基因，并按基因型結(jié)果與表型特征相符的原則進(jìn)行分析，確定了7 632例常見(jiàn)地貧基因型樣本，包括α-地貧5 136例、β-地貧2 023例、α-地貧合并β-地貧473例。

2.2罕見(jiàn)地貧基因及異常血紅蛋白分析結(jié)果 221例表型陽(yáng)性而未檢出常見(jiàn)地貧基因、基因型結(jié)果與表型特征不符、血紅蛋白電泳分析異常帶的樣本，經(jīng)進(jìn)一步檢測(cè)分析，共檢出異常血紅蛋白、少見(jiàn)或罕見(jiàn)地貧基因53例，見(jiàn)表1。

表1 53例罕見(jiàn)地貧基因及異常血紅蛋白基因型

2.3廣西梧州地區(qū)地貧基因突變譜 根據(jù)確診基因型，在7 853例表型篩查陽(yáng)性樣本中，7 685例檢出珠蛋白基因突變攜帶者的分類及比例見(jiàn)表2，人群珠蛋白基因突變攜帶率為24.78%(7 685/31 008)；共計(jì)檢出8 019個(gè)地貧等位基因，其分類及比例見(jiàn)表3。

表2 廣西梧州地區(qū)7 685例珠蛋白基因突變攜帶者分類及其比例

表3 廣西梧州地區(qū)地中海貧血基因突變譜及其比例

3 討論

由于地貧基因具有明顯的遺傳多樣性，常規(guī)試劑盒只覆蓋了中國(guó)人群中95%～98%的地貧基因突變，罕見(jiàn)或未知突變的漏檢率約為2%[2-3]。夫婦一方為攜帶者而另一方漏檢，即易導(dǎo)致重型地貧患兒的出生。

在本地區(qū)的31 008例婚前或產(chǎn)前人群樣本中，共檢出7 685例珠蛋白基因突變攜帶者，其中α-地貧攜帶者占67.08%，β-地貧攜帶者占32.71%，異常血紅蛋白者占0.21%，人群總攜帶率為24.78%，且SEA缺失或CD41-42(-TCTT)分別為最常見(jiàn)的α-和β-地貧基因，與廣西壯族自治區(qū)分子流行病學(xué)調(diào)查所報(bào)道的總體數(shù)據(jù)相符[4]。β-地貧基因突變譜中，-28(A>G)常見(jiàn)，與廣西地區(qū)分子流行病學(xué)調(diào)查總數(shù)據(jù)不同[4]，但與本團(tuán)隊(duì)2013年[5-6]及任振敏等[7]的報(bào)道結(jié)果一致。本研究檢出的β-地貧基因純合子或雙重雜合中間型個(gè)體占β-地貧攜帶者的1.23% (31/2 514)，較本團(tuán)隊(duì)2013年所報(bào)道有明顯下降，很可能是全區(qū)范圍內(nèi)所實(shí)施的地貧人群大防控，降低了β-地貧基因純合子或雙重雜合子胎兒的出生率。

本研究中檢出β-地貧合并α-地貧473例，占β-地貧攜帶者的18.81%(473/2 514)。α-/β-復(fù)合型地貧攜帶者的血液學(xué)表型通常為β-地貧(Hb A2增高)表型特征，因此對(duì)β-地貧確診者需要再進(jìn)行α-地貧基因檢測(cè)，以免漏檢。本結(jié)果也說(shuō)明泰國(guó)型α0-地貧基因缺失(--THAI)在本地區(qū)具有較高的頻率，有必要在臨床實(shí)踐中應(yīng)用包含此突變類型的商品化常規(guī)試劑盒，以防漏診誤診。

從基因型結(jié)果與表型特征不符而進(jìn)一步檢測(cè)分析的221例樣本中：(1)檢出8例香港型(HKαα/αα)。HKαα是α珠蛋白基因簇同源序列不等交換所致，HKαα/αα患者臨床表現(xiàn)為靜止型地貧[8]。常規(guī)α-地貧基因缺失型gap-PCR檢測(cè)時(shí)疑為-α3.7，卻與血液學(xué)表型、臨床特征不相符時(shí)，需高度懷疑HKαα/αα并進(jìn)一步確認(rèn)。另外，基因型為HKαα/--SEA的癥狀要輕于--SEA/-α3.7的HbH病，臨床表型類似--SEA/αα，因此應(yīng)避免在產(chǎn)前診斷中將HKαα/--SEA誤診為-α3.7/--SEA。(2)檢出罕見(jiàn)β-地貧基因CD37(TGG>TAG)突變5例、-90(C>T)4例，提示這2個(gè)突變?cè)诒镜貐^(qū)人群有一定的攜帶率，有必要納入常規(guī)檢測(cè)的位點(diǎn)范圍以防漏檢[9-10]。(3)檢出中國(guó)型Gγ+(Aγδβ)0缺失5例，此突變的攜帶者個(gè)體表型為典型的遺傳性高胎兒血紅蛋白血癥(HPFH)，因此當(dāng)血紅蛋白電泳分析HbA2稍低或正常，HbF明顯增高(約為10%～20%)[11]，則首先檢測(cè)是否為此突變基因攜帶者。(4)檢出異常血紅蛋白基因突變16例，其表型特征均表現(xiàn)為血紅蛋白電泳分析時(shí)檢出異常帶，其中最常見(jiàn)的為Hb New York。必須注意的是，Hb New York于血紅蛋白高效液相色譜分析難以檢出，而毛細(xì)管電泳在Z11區(qū)可見(jiàn)電泳條帶[12]。(5)另168例表型特征為MCV或MCH偏低的樣本，部分檢出無(wú)生物學(xué)效應(yīng)的同義突變或非編碼區(qū)單堿基多態(tài)，未發(fā)現(xiàn)明確意義的珠蛋白基因突變而排除地中海貧血或異常血紅蛋白病，其血液學(xué)表型可能源于其他因素，如缺鐵、G6PD缺乏等。

本研究充分說(shuō)明在地貧基因分子診斷中，必須嚴(yán)格遵循血液學(xué)表型與基因型相結(jié)合的原則，采用可靠的操作流程和檢測(cè)技術(shù)，保證地貧基因的檢出率及準(zhǔn)確性，避免漏診或誤診。