張晨曦， 賴云強， 楊嵐， 樊學偉， 王陽光， 李文婷， 康相濤

(河南農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，河南 鄭州 450046)

雞蛋作為蛋雞產(chǎn)業(yè)的主要產(chǎn)品，是人類攝取動物蛋白的主要來源之一，而產(chǎn)蛋量是蛋雞生產(chǎn)中重要的經(jīng)濟性狀[1-2]。蛋雞繁殖性能與卵巢等器官發(fā)育密切相關(guān)，直接影響產(chǎn)蛋量[3]，因此，對卵巢發(fā)育相關(guān)基因克隆及分析將有助于蛋雞育種工作。目前，中國家禽育種選留工作處于現(xiàn)代分子生物學技術(shù)與傳統(tǒng)育種手段相結(jié)合的階段[4]，許多研究者通過分子生物學方法發(fā)掘相關(guān)基因功能，包括基因克隆、實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)及分子生物信息學分析等。利用這些技術(shù)探究基因結(jié)構(gòu)和功能，將為后續(xù)深入研究基因參與調(diào)控的生物學機制提供重要理論參考。

卵泡生長發(fā)育直接影響產(chǎn)蛋量，受自分泌和旁分泌因子調(diào)控。轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factorsβ，TGF-β)家族通過自分泌方式作用于顆粒細胞、卵母細胞和卵泡膜細胞，進而調(diào)控卵泡發(fā)育[5-8]，其家族成員包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)、生長分化因子(growth differentiation factors，GDFs)、活化素、抑制素等。BMPR1B基因是影響綿羊多羔的主效基因，具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性[9]，且該基因所編碼的蛋白是多種BMPs的受體，在卵泡發(fā)育、生長和免疫等方面扮演重要角色，與動物的繁殖密切相關(guān)[10-12]。BMPR1B蛋白與TGF-β家族成員中的BMP15蛋白特異性結(jié)合后，形成BMP配體復合物，磷酸化后激活Ⅰ型受體，通過Smad1/5/8磷酸化作用影響顆粒細胞分泌孕酮從而調(diào)控卵泡發(fā)育，進而影響產(chǎn)蛋率[13-14]。此外，BMP15作為其配體在參與雞卵泡的選擇過程，與雞的產(chǎn)蛋性狀密切相關(guān)[15-16]。目前，關(guān)于BMP基因以及BMPR1B基因的研究主要集中在羊上，并將其作為多羔候選基因進行探究[17-19]，并判定其主要功能是影響動物卵巢的排卵。然而，BMPR1B基因在家禽中相關(guān)研究較少。本研究利用cDNA末端快速擴增技術(shù)(rapid amplification of cDNA ends，RACE)克隆獲得雞BMPR1B基因cDNA序列，并對該基因進行生物信息學分析，通過qRT-PCR檢測雞BMPR1B基因在各組織中的表達，為BMPR1B基因在分子水平上的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗選取43周齡太行雞(太行雞保種場)6只，飼養(yǎng)于相同條件下。頸部放血處死后，采集6～8 mm小黃卵泡及整個卵巢組織，同時取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸肌和腿肌組織，迅速置于液氮中冷凍，之后保存于-80 ℃冰箱備用。試驗過程符合動物倫理要求及動物福利法相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要試劑與儀器

TRIzolTMReagent 試劑、DNA Marker、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)；DNase/RNase-free去離子水、2×Taq PCR Master Mix(北京康為世紀生物公司)；DNA 純化回收試劑盒、pMD18-T 載體、DH5α 感受態(tài)細胞、TB Green?Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)、KOD One TM PCR Master Mix(東洋紡(上海)生物科技有限公司)、RACE試劑盒(takara)。

普通PCR 儀(PowerCycle，德國 Eppendorf 公司)；qRT-PCR儀(LightCycler96，瑞士Roche公司)；臺式高速離心機(Neofuge 23R，美國 Thermo 公司)；超低溫冰箱(MF-U53869，日本Panasonic公司)；電泳儀(DYY-Ⅲ型，上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；凝膠成像系統(tǒng)(GBOX EF，英國 SYNGENE 公司)；分光光度計(NanoDrop 2000，美國Thermo公司)。

1.3 引物設(shè)計

根據(jù)NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)上雞BMPR1B的參考基因序列(NM_205132.1)，使用Primer5.0設(shè)計基因克隆特異性引物和熒光定量PCR引物(表1)。引物設(shè)計完成后均交由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 BMPR1B基因引物信息Table 1 Primer information of BMPR1B gene

1.4 試驗方法

1.4.1 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄 利用Trizol法[20]提取組織的總RNA，溶于DNase/RNase-free H2O，通過瓊脂凝膠電泳檢測RNA完整性，使用NanoDrop 2000分光光度計測定其濃度，并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)得到cDNA，置于-20 ℃冰箱保存，用于后續(xù)試驗。

1.4.2 雞BMPR1B基因克隆 以小黃卵泡組織的cDNA為模板，擴增BMPR1B基因的編碼序列(coding sequence, CDS)區(qū)，擴增體系為：25 μL KOD One TM PCR Master Mix，BMPR1B-F 0.5 μL，BMPR1B-R 0.5 μL，cDNA 1 μL，去離子水補至50 μL。反應程序：98 ℃ 預變形3 min； 98 ℃變性10 s，65 ℃退火5 s，68 ℃延伸10 s，35個循環(huán)；68 ℃ 繼續(xù)延伸5 min。擴增所得產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒回收后進行測序。

以測序得到的CDS序列為基礎(chǔ)，設(shè)計雞BMPR1B基因5’ RACE與3’ RACE的特異性引物，利用RACE試劑盒克隆其5’端(5’UTR)和3’端(3’UTR)序列。以5’ RACE為例，具體擴增體系：1)一輪巢式PCR：cDNA 2.5 μL，2×Taq PCR Master Mix 25 μL，UPM (10×) Primer 5 μL，BMPR1B-5R-521R 1 μL，去離子水補至50 μL，PCR產(chǎn)物稀釋50倍；2)二輪巢式PCR: 一輪稀釋產(chǎn)物5 μL，2×Taq PCR Master Mix 25 μL，NEST 1 μL，BMPR1B-5R-337R 1 μL，去離子水補至50 μL，PCR產(chǎn)物稀釋50倍；3) 三輪巢式PCR: 一輪稀釋產(chǎn)物5 μL，2×Taq PCR Master Mix 25 μL，NEST 1 μL，BMPR1B-5R-165R 1 μL, 去離子水補至50 μL, PCR產(chǎn)物稀釋50倍。反應程序：1)一輪巢式PCR：95 ℃預變形5 min，95 ℃變性30 s，89 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，20個循環(huán)；95 ℃變性30 s，79 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，20個循環(huán)；2)二輪巢式PCR：95 ℃預變形5 min；95 ℃變性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，20個循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸10 min；3)三輪巢式PCR：95 ℃預變形5 min；95 ℃變性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，20個循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸10 min。PCR產(chǎn)物純化后與載體pMD18-T在16 ℃下連接過夜，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5α中，經(jīng)菌落PCR驗證后，選取陽性片段的克隆送至上海生工生物工程股份有限公司測序。

1.4.3 雞BMPR1B基因生物信息學分析 利用不同生物信息學軟件對雞BMPR1B基因進行如下分析，主要分為核苷酸序列的同源性比較和進化樹構(gòu)建、蛋白理化參數(shù)分析、蛋白結(jié)構(gòu)及功能預測、磷酸化和糖基化位點預測(表2)。

表2 生物學信息分析軟件及項目Table 2 Softwares and projects of biological information analysis

1.4.4 雞BMPR1B基因組織表達分析 以雞的心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、胸肌、腿肌和卵巢組織的cDNA為模板，分析雞BMPR1B基因在各個組織中的表達。qRT-PCR的反應體系：TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ 5 μL，DNase/RNase-free H2O 3 μL，cDNA 1 μL，BMPR1B-F3 0.5 μL，BMPR1B-R3 0.5 μL。反應條件：95 ℃預變性 2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)，每個待測樣本設(shè)置3個重復。

1.5 統(tǒng)計與分析

以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法進行分析。另外，通過SPSS22.0軟件中單因素方差分析法對其表達量進行顯著性檢驗，P<0.05 表示差異顯著，P>0.05 表示差異不顯著。數(shù)值表示為平均數(shù)±標準差，使用 GraphPad Prism8.0 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞BMPR1B基因的克隆

根據(jù)所設(shè)計的引物對雞BMPR1B基因的CDS區(qū)進行擴增(圖1)，與NCBI上雞BMPR1B基因的CDS區(qū)進行比對，確認所獲得的序列為目的基因序列。在所獲得的CDS序列基礎(chǔ)上，分別進行5’ RACE及3’ RACE。5’ RACE獲得擴增條帶長260 bp和430 bp左右，3’ RACE獲得長度為620 bp左右的擴增條帶(圖2)。測序分析后，5’ UTR存在2種轉(zhuǎn)錄本，長度分別為248和77 bp。3’ UTR存在1種轉(zhuǎn)錄本，長度為168 bp。將5’ RACE和3’ RACE結(jié)果與CDS序列進行拼接后，得到雞BMPR1B基因的2種轉(zhuǎn)錄本T1和T2，長度分別為1 925和1 754 bp(圖3)。轉(zhuǎn)錄本T1包括5’ UTR 248 bp，3’ UTR 168 bp，CDS 1 509 bp，轉(zhuǎn)錄本T2包括5’ UTR 77 bp，3’ UTR 168 bp，CDS 1 509 bp。

圖1 雞BMPR1B 基因CDS 擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of chicken BMPR1B gene

圖2 雞BMPR1B基因5’ RACE(左圖)、3’ RACE(右圖)擴增結(jié)果Fig.2 5’RACE(left) and 3’ RACE (right)PCR amplification results of chicken BMPR1B gene

2.2 雞BMPR1B基因核苷酸同源性分析及進化樹構(gòu)建

雞BMPR1B基因序列與不同物種比較結(jié)果顯示，雞與火雞、野鴨、大猩猩、家鼠、馬、山羊、家貓、牛、人和蛙的BMPR1B基因核苷酸序列同源性分別為99.60%、98.80%、91.63%、91.62%、93.63%、91.04%、86.85%、92.23%、91.43%和90.84%(表3)。進化樹分析表明，雞BMPR1B基因在進化過程中與火雞親緣關(guān)系最近(圖4)。

圖3 雞BMPR1B基因2種轉(zhuǎn)錄本Fig.3 Two transcripts of chicken BMPR1B gene

表3 雞與其他物種BMPR1B基因核苷酸序列比對Table 3 Alignment of BMPR1B gene nucleotide sequence

圖4 雞BMPR1B基因系統(tǒng)進化樹

2.3 雞BMPR1B基因編碼蛋白理化性質(zhì)分析

對雞BMPR1B基因編碼蛋白進行理化性質(zhì)分析，結(jié)果表明，其分子式為C2 505H3 959N691O747S33，包含7 935個原子，相對分子質(zhì)量為 56.77 ku，理論等電點(pI)為7.51，含有20種氨基酸(表4)。其中，亮氨酸含量最高(9.8%)，色氨酸含量最低(1.4%)。氨基酸不穩(wěn)定性指數(shù)為 53.63，表明該蛋白為不穩(wěn)定蛋白；蛋白疏水性分析顯示，最大值為4.04，最小值為-2.83，平均親水性為-0.365，則該蛋白為親水性蛋白(圖5)，脂溶性指數(shù)為 81.95，表明該蛋白的流動性較好。

表4 雞BMPR1B基因編碼蛋白氨基酸組成Table 4 Amino acid composition of BMPR1B gene encoding protein chicken

2.4 雞BMPR1B基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)與功能預測

利用TMHMM在線軟件對雞BMPR1B基因編碼蛋白的氨基酸序列進行跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽分析。結(jié)果表明，該蛋白有1段跨膜結(jié)構(gòu)，無信號肽(圖6-A)，屬于跨膜蛋白(圖6-B)。通過PRABI在線軟件預測雞BMPR1B基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)有α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲4種類型，分別占整個二級結(jié)構(gòu)的35.46%、10.96%、3.39%和50.20%，即無規(guī)卷曲是該蛋白的主要結(jié)構(gòu)(圖6-C)。使用SWISS-MODEL在線軟件預測該蛋白三級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)無規(guī)卷曲為雞BMPR1B蛋白結(jié)構(gòu)的主要組成，與二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果一致(圖6-D)。利用SMART軟件進行蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域預測，發(fā)現(xiàn)該蛋白存在1段跨膜結(jié)構(gòu)域，位于第127～149個氨基酸；1個GS保守結(jié)構(gòu)域，位于第174～204個氨基酸(圖6-E)。

圖5 雞BMPR1B基因編碼蛋白疏水性分析

注：A：雞BMPR1B基因編碼蛋白信號肽預測：B：雞BMPR1B基因編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預測；C：雞BMPR1B基因編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)預測；D：雞BMPR1B基因編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)預測；E: 雞BMPR1B基因編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域預測。

2.5 雞BMPR1B基因編碼蛋白潛在磷酸化位點和糖基化位點預測

利用NetPhos2.0在線軟件預測雞BMPR1B基因編碼蛋白潛在磷酸化位點。結(jié)果表明，有1個絲氨酸(Ser)、1個蘇氨酸(Thr)和2個酪氨酸(Tyr)可能成為蛋白激酶的磷酸化位點(圖7)。使用NETOGlyc3.1在線軟件預測糖基化位點，存在2個潛在的糖基化位點(圖8)。該結(jié)果表明，磷酸化是雞BMPR1B基因編碼蛋白修飾后的主要方式之一。

圖7 雞BMPR1B基因編碼蛋白潛在磷酸化位點

圖8 雞BMPR1B基因編碼蛋白潛在糖基化位點

2.6 雞BMPR1B基因組織表達分析

通過qRT-PCR技術(shù)檢測雞BMPR1B基因在雞的心、肝、脾、肺、腎、胸肌、腿肌和卵巢8個組織的表達情況，結(jié)果表明，雞BMPR1B基因在各個組織中均有表達，以卵巢組織中顯著最高(P<0.05)，其次是肝臟、胸肌、腎臟、腿肌，隨后是心臟、脾臟(圖9)。

注：1.脾臟;2.心臟;3.肺臟;4.腿肌;5.腎臟;6.胸肌;7.肝臟;8.卵巢。不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

BMPR1B基因通過與其配體結(jié)合調(diào)節(jié)細胞增殖分化，尤其在畜禽繁殖調(diào)控中發(fā)揮重要作用[21]，被認為是卵泡發(fā)育和正常排卵的必要生長因子[22]。本研究從雞的小黃卵泡組織中成功克隆了雞BMPR1B基因序列，并獲得了2種轉(zhuǎn)錄本T1和T2，長度分別為1 925 bp和1 754 bp，編碼502個氨基酸。核苷酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)該基因與火雞的BMPR1B基因有較高的同源性，并且與火雞親緣關(guān)系最近，符合生物進化特征。蛋白結(jié)構(gòu)域?qū)ζ浒l(fā)揮功能起關(guān)鍵作用[23]。本研究發(fā)現(xiàn)雞BMPR1B基因編碼蛋白存在1個跨膜區(qū)段，無信號肽，屬于跨膜蛋白。此外，該蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析表明，該蛋白存在單個跨膜區(qū)段和1個GS保守結(jié)構(gòu)域，位于第174～204個氨基酸處，該區(qū)域高度保守，是TGF-βI型受體活化的重要部位[24]，這與哺乳動物中的研究結(jié)果相類似。在哺乳動物中，BMPR1B基因編碼蛋白包括N端細胞外結(jié)構(gòu)域、單個跨膜結(jié)構(gòu)域和C端細胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域(GS結(jié)構(gòu)域)3部分，其C端的GS結(jié)構(gòu)域是信號傳導的重要部位[25-26]。因此，在不同物種中，BMPR1B的信號傳導方式可能是相同的。此外，相關(guān)研究表明，BMPR1B基因編碼的蛋白受體以磷酸化方式活化，之后迅速作用于Smads信號蛋白，形成轉(zhuǎn)錄復合物，從而發(fā)揮相應的生物學效應[27-28]，這與本研究結(jié)果中預測其可能存在Ser、Thr和Tyr共4個磷酸化位點的結(jié)果相符合。本研究還發(fā)現(xiàn)，雞BMPR1B基因編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)卷曲為主，占整個二級結(jié)構(gòu)的50.20%；其次是α-螺旋，占35.46%。該結(jié)果說明該蛋白穩(wěn)定性不強。張筱艷[29]在綿羊中發(fā)現(xiàn)BMPR1B基因編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)也是以無規(guī)卷曲為主，這與本研究結(jié)果類似。一般認為，在二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)卷曲是造成蛋白不穩(wěn)定的重要原因，且是蛋白分子功能實施及構(gòu)象的重要區(qū)域。因此，蛋白結(jié)構(gòu)域的預測對正確認識基因的蛋白結(jié)構(gòu)及功能具有重要意義。

基因在不同組織的表達具有廣泛性和特異性，其表達受多種因素調(diào)控[30]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，BMPR1B基因在動物體內(nèi)的不同組織內(nèi)廣泛表達[31]，這與本研究結(jié)果相一致，即雞BMPR1B基因在雞的心、肝、脾、肺和卵巢等8個組織均有表達，且在卵巢表達量最高。卵巢是影響繁殖性狀及激素分泌的主要效應器官[32]，其正常發(fā)育對家禽排卵非常重要，而本研究中BMPR1B基因在雞的卵巢中的高表達，說明該基因在卵巢發(fā)育中發(fā)揮一定作用。在哺乳動物和家禽中，BMP15作為卵母細胞釋放的特異性信號因子，通過與受體BMPR1B基因編碼蛋白組成 BMP復合物[14]，磷酸化 Smad 蛋白，激活 Smad1/5/8通路[33]，調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控卵泡的發(fā)育。因此，探究雞BMPR1B基因的遺傳結(jié)構(gòu)和蛋白功能為下一步研究BMPR1B基因在雞卵巢發(fā)育中的功能奠定了遺傳信息學基礎(chǔ)，對于提高禽類的產(chǎn)蛋性能具有一定的借鑒意義。