陳玉霞 邱建輝 谷峰

摘要 [目的]探索葡萄新品種快繁技術(shù)。[方法]以葡萄1年生枝條腋芽為外植體，研究葡萄無菌植株的建立，篩選叢生芽分化、幼苗生根培養(yǎng)基配方及試管苗移栽的適宜基質(zhì)。[結(jié)果]腋芽可作為外植體并以0.1% HgCl2消毒9 min為宜，黑奧林、先鋒、紅富士3個供試品種的無菌植株獲得率為45.10%～60.00%;篩選出的叢生芽分化培養(yǎng)基配方為B5+ 6-BA 0.5 mg/L+ NAA 0.10 mg/L + 蔗糖20 g/L+瓊脂6.5 g/L，3個葡萄品種的平均叢生芽分化數(shù)為4.14 芽/莖段;幼苗生根培養(yǎng)基配方為改良B5+IAA 0.10 mg/L+蔗糖20 g/L+瓊脂 6.5 g/L+活性炭0.3%，試管苗生根率達100%，幼苗根多且粗壯，莖葉生長旺盛;以不同基質(zhì)移栽試管苗，細河砂的移栽成活率最高，3個品種的幼苗成活率達86.67%～100%，其次為蛭石，幼苗成活率為71.67%～85.00%，而腐殖質(zhì)土的試管苗成活率只有33.33%～43.33%，幼苗很少發(fā)新根。試管苗不經(jīng)煉苗，可直接從培養(yǎng)瓶移栽到基質(zhì)中。[結(jié)論]建立了一整套葡萄組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)體系，可為葡萄新品種的快速繁殖、老品種的培養(yǎng)復(fù)壯提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞 葡萄;腋芽;叢生芽分化;生根培養(yǎng);移栽;細河砂

中圖分類號 S 663.1文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2022）04-0106-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.04.028

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Study on Tissue Culture Rapid Propagation Technology of New Grape Varieties

CHEN Yu-xia， QIU Jian-hui， GU Feng

（Institute of Agricultural Products Processing and Nuclear Agriculture Technology， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan， Hubei430064）

Abstract [Objective]To explore the rapid propagation technology of new grape varieties.[Method]By using axillary bud of the annual branch of grape as explants， the establishment of grape sterile plantless， the medium formula of the differentiation of cluster buds and seedling root， the suitable substrate for transplanting test-tube seedlings were studied. [Result]The results showed that axillary bud could be used as explants and disinfected with 0.1% HgCl2 for 9 minutes. The sterile plant acquisition rates of three tested varieties were 45.10%-60.00%. The medium formula of cluster bud differentiation was B5 +6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.10 mg/L + sucrose 20 g/L + agar 6.5 g/L， and the number of cluster bud differentiation of the three grape varieties was the above 4.14 bud per stem segment. The formula of seedling root medium was modified B5+IAA 0.10 mg/L+sucrose 20 g/L +agar 6.5 g/L+activated carbon 0.3%. On this medium， the rooting rate of test-tube plantlets reached 100%， the roots of seedlings were many and strong， and the stems and leaves grew vigorously. Transplanting the test tube seedlings with different substrates， and the transplanting survival rate of the fine river sand was the highest，and the survival rate of three varieties seedlings was 86.67%-100%， followed by vermiculite， the survival rate of the seedlings was 71.67%-85.00%，and the survival rate of test-tube plantlets in humus soil was only 33.33%-43.33%. Test-tube plantlets can be directly transferred from the culture bottle to the substrate without refining them. [Conclusion]In this study， a set of tissue culture rapid propagation technology system of grape was established， which provided the basis for the rapid propagation of new grape varieties and the culture and rejuvenation of old varieties.

Key words Grape;Axillary bud;Cluster bud differentiation;Root culture;Transplanting;Fine river sand

葡萄（Vitis vinifera L.），葡萄科藤本植物，世界各地均有栽培，面積達1 000萬 hm2，占世界水果產(chǎn)量的30%以上[1]。葡萄既可鮮食，又可制葡萄干、葡萄汁或釀酒，還可作為美化庭園樓閣、綠化荒山堿灘的觀賞和綠化樹種。葡萄是世界最古老的果樹樹種之一。生產(chǎn)上通常采用扦插繁殖的方法繁殖葡萄苗木，易扦插成活，常規(guī)繁殖方法經(jīng)濟有效[2]。但長期采用扦插繁殖，易導(dǎo)致品種退化、品質(zhì)變劣，尤其在南方多雨地區(qū)，扦插苗易受病蟲感染，嚴重影響苗木質(zhì)量[3]。植物組織培養(yǎng)技術(shù)就是將植物體的細胞、組織、器官采用無菌操作的方法，使其在人工條件及外源激素的作用下繼續(xù)生長，并分化發(fā)育成完整的小植株。該技術(shù)可用于新品種的快速繁殖，老品種的培養(yǎng)復(fù)壯，不受季節(jié)、地區(qū)、氣候、病蟲等因素影響，可周年進行生產(chǎn)[4-6]。葡萄組織培養(yǎng)最早始于1944年，morel.G 進行葡萄的離體培養(yǎng)，我國曹孜義等[7-9]先后開展了葡萄組織培養(yǎng)研究，其目的在于加快優(yōu)良品種繁殖;之后國內(nèi)普遍開展了葡萄莖尖（或莖段）組織培養(yǎng)的研究工作，

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄試管繁殖研究組經(jīng)過一系列研究，實現(xiàn)了葡萄小型化育苗;黃貞光等[2]通過對葡萄離體培養(yǎng)接種、繼代繁殖、生根等研究，篩選出適合多個品種生長的廣譜培養(yǎng)基—— B5培養(yǎng)基;李國樹等[3]研究表明，外植體以莖尖為最佳，并對莖尖愈傷組織誘導(dǎo)、莖葉分化以及生根培養(yǎng)進行了研究。筆者選取當前推廣的優(yōu)良葡萄品種1年生枝條腋芽為試材，對無菌植體的建立、叢生芽的分化、不定根的誘導(dǎo)以及試管苗的移栽等關(guān)鍵技術(shù)進行研究，以期形成一整套葡萄組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)體系，為葡萄組培快速繁殖及大規(guī)模工廠化育苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試品種。黑奧林、紅富士、先鋒，由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所葡萄盆栽試驗基地提供。

1.1.2 主要設(shè)備。立式自動電熱壓力蒸氣滅菌器，合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司;超凈工作臺（單人單面垂直送風(fēng)），蘇州江東精密儀器有限公司;光照培養(yǎng)箱，蘇州長留凈化科技有限公司;三角瓶、移液管等玻璃儀器，北京博美玻璃儀器廠;組織培養(yǎng)室。

1.1.3 化學(xué)試劑。B5培養(yǎng)基、蔗糖、瓊脂、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、6-芐基氨基嘌呤（6-BA）、氯化汞或次氯酸鈉、乙醇等。

1.2 方法

1.2.1 取材和消毒。取盆栽葡萄1年生枝條，去除葉片，放入冰箱（4 ℃左右）保存7 h后取出，切成帶1個節(jié)的莖段，再對莖段進行消毒。首先用0.1%洗衣粉溶液漂洗10～15 min，洗凈材料表面的污染物。用紗布將莖段包好，懸于水龍頭下，小水流沖洗20 min，用濾紙吸干莖段的水分。將莖段轉(zhuǎn)入無菌三角瓶中，用0.1% HgCl2（加吐溫）消毒8～10 min。消毒時，不斷振動容器，使HgCl2與莖段充分接觸。最后用無菌水沖洗3～4次，每次洗滌1～2 min，備用。

1.2.2 腋芽的接種。在超凈工作臺上，將已消毒的莖段放在無菌濾紙上吸干水分，用解剖刀小心切取帶少部分莖組織的腋芽，接種到裝有芽生長培養(yǎng)基的3瓶中，每瓶接種3個腋芽，以腋芽剛好接觸培養(yǎng)基為宜。在培養(yǎng)過程中，觀察記錄腋芽的生長情況，及時剔除帶菌材料。

1.2.3 叢生芽分化培養(yǎng)基配方。以B5為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的NAA和6-BA配制成不同的培養(yǎng)基，接種3個供試品種的無菌苗，置于光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)，保持溫度25～28 ℃，光照時間12～16 h/d，光照強度2 000 lx。在培養(yǎng)過程中，每天觀察記錄叢生芽分化及生長情況，30 d后統(tǒng)計各品種叢生芽數(shù)等各項指標。

1.2.4 生根培養(yǎng)基配方。以改良B5為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加一定濃度的IAA、蔗糖和活性炭配制成生根培養(yǎng)基，接種有2～3片真葉，生長基本一致的叢生芽，每品種接種7瓶，每瓶接種5株，30 d后對生根情況進行調(diào)查分析。

1.2.5 試管苗移栽。將葡萄試管苗從培養(yǎng)室移至室外，不需經(jīng)過煉苗，直接將試管苗從三角瓶中取出，洗去根部附著的培養(yǎng)基，栽于基質(zhì)中。移栽基質(zhì)為細河砂、腐殖質(zhì)土和蛭石。栽后適量澆水，覆以塑料薄膜，并做成拱棚形式。移栽后30 d調(diào)查試管苗的成活率等各項指標。

2 結(jié)果與分析

2.1 無菌植株的建立

取盆栽的紅富士、先鋒、黑奧林1年生枝條腋芽進行培養(yǎng)。由于腋芽帶菌量大，雖然用0.1%HgCl2消毒9 min，但難以徹底解決腋芽帶菌問題。接種3 d以后，陸續(xù)可見帶菌的腋芽，有的腋芽周圍有細菌菌落生長，有的腋芽周圍有真菌菌落生長，因此應(yīng)及時將未染菌的腋芽轉(zhuǎn)移到無菌培養(yǎng)基上。有的腋芽雖未染菌，但已被組織內(nèi)的氧化物氧化而褐化。接種后7 d，未被污染的腋芽均開始生長，表現(xiàn)為芽體膨大，少數(shù)可見葉片逐漸轉(zhuǎn)綠，葉片平展，即獲得無菌植株。3個品種腋芽生長情況的調(diào)查結(jié)果見表1。由表1可知，3個供試品種中，以黑奧林褐化率最低，僅28.33%，成苗率最高，為60.00%。培養(yǎng)30 d后，將無菌植株切成帶一個節(jié)的小段，在芽生長培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，以擴大無菌苗數(shù)量。

2.2 叢生芽分化培養(yǎng)基的篩選

2.2.1 不同6-BA濃度對叢生芽分化效果的影響。在B5+NAA 0.10 mg/L+蔗糖20 g/L+瓊脂6.5 g/L培養(yǎng)基上，添加0.40、0.50、0.60 mg/L 6-BA，配制成3種培養(yǎng)基，接種3個供試品種無菌苗的帶節(jié)莖段，每處理接種6瓶，每瓶接種5個莖段。培養(yǎng)30 d后，對3個品種叢生芽的分化情況進行調(diào)查，結(jié)果見表2。由表2可知，當6-BA濃度為0.50 mg/L時，3個品種的平均叢芽數(shù)、平均芽高、每芽葉片數(shù)、單芽鮮重均高于其他2個濃度處理，濃度為0.60 mg/L時4項指標均為最低值。另外，3個品種間叢生芽分化效果存在差異，黑奧林的4項指標均高于先鋒和紅富士，而先鋒和紅富士間差異不明顯。

2.2.2 不同NAA濃度對叢生芽分化效果的影響。在B5+6-BA 050 mg/L+蔗糖20 g/L+瓊脂6.5 g/L基礎(chǔ)培養(yǎng)上添加010、0.15、0.20 mg/L NAA，配制成3種培養(yǎng)基，接種3個供試品種無菌苗，每處理接種6瓶，每瓶接種5苗。培養(yǎng)30 d后，對3個品種叢生芽的分化情況進行調(diào)查，結(jié)果見表3。由表3可知，當NAA濃度為0.10 mg/L時，先鋒的平均叢生芽數(shù)、平均芽高、每芽葉片數(shù)均優(yōu)于其他2個濃度處理，叢芽生長快，葉片嫩綠，同時，在培養(yǎng)15 d后，有30%～40%小植株長出2～3條短而粗的白根。當NAA濃度為0.20 mg/L時，叢生芽發(fā)生少，且矮小皺縮，3個供試品種表現(xiàn)一致。

2.3 葡萄無菌苗生根培養(yǎng)基配方

以改良B5（微量元素和肌醇減半）為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加蔗糖20 g/L、瓊脂6.5 g/L、活性炭0.3%和0.05、0.10、0.15 mg/L IAA，配制成3種不同培養(yǎng)基，接種3～4片真葉、生長基本一致的黑奧林無菌苗。接種后6 d幼苗基部膨大且有白色根尖突起，13 d后在3種生根培養(yǎng)基上的幼苗全部長出嫩根。由表4可知，當IAA濃度為0.10 mg/L時，幼苗生長良好，表現(xiàn)為苗高適度，平均每株根數(shù)達6.53條，根多而粗壯。因此，B5+IAA 0.10 mg/L+蔗糖20 g/L+瓊脂6.5 g/L+活性炭0.3%可作為葡萄試管苗生根培養(yǎng)基。

2.4 葡萄試管苗移栽

3個供試品種的無菌苗在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d，不需煉苗，可直接將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，用自來水洗去根部附著的培養(yǎng)基，移栽到細河砂、腐殖質(zhì)土和蛭石中，用灑水壺適量澆水，再覆蓋塑料薄膜，做成拱棚形式。移栽后每天記錄試管苗植株生長情況，結(jié)果見表5。從移栽到長出新根天數(shù)看，以細河砂為基質(zhì)發(fā)新根天數(shù)最短，3個品種的發(fā)根天數(shù)為11～16 d，其次為蛭石，發(fā)根天數(shù)為15～18 d，而在腐殖質(zhì)土中的小植株很少發(fā)新根;第30天統(tǒng)計試管苗株高，3個品種生長在細河砂和蛭石中的苗高為9.13～11.33 cm和8.06～11.61 cm，而生長在腐殖質(zhì)土中的苗高與移栽時的高度變化不大，為6.17～6.31 cm;第30天統(tǒng)計試管苗成活率，以細河砂和蛭石為基質(zhì)的成活率較高，尤其是黑奧林在細河砂中移栽成活率達100%，植株根系發(fā)達，莖葉生長健壯。試管苗最適移栽氣溫為10～22 ℃，在試管苗移栽后，若塑料棚內(nèi)溫度達到30 ℃以上，須開棚通風(fēng)，以降低棚內(nèi)溫度，避免高溫灼傷植株，傍晚溫度下降時，再將薄膜蓋嚴。待試管苗完全成活，可揭去塑料薄膜，讓試管苗在自然條件下生長。

3 結(jié)論與討論

以葡萄1年生枝條腋芽為外植體，以0.1%HgCl2消毒9 min為宜，3個供試品種的無菌苗獲得率為45.10%～6000%。以B5為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，進行NAA、6-BA的單因素莖段培養(yǎng)試驗，篩選出了較優(yōu)的叢生芽分化培養(yǎng)基配方，即 B5+6-BA 0.50 mg/L+NAA 0.10 mg/L+蔗糖20 g/L+瓊脂6.5 g/L，在該培養(yǎng)基上培養(yǎng)的3個葡萄品種的叢生芽分化率較高，平均叢生芽數(shù)在4.14芽/莖段。經(jīng)試驗，試管苗生根培養(yǎng)基配方為改良B5+IAA 0.10 mg/L+蔗糖20 g/L+瓊脂6.5 g/L+活性炭0.3%，在該培養(yǎng)基上培養(yǎng)的無菌苗13 d后全部長出嫩根，試管苗生根率達100%，幼苗根多且粗壯，莖葉生長旺盛。

以細河砂、腐殖質(zhì)土、蛭石為基質(zhì)移栽試管苗，并覆以塑料薄膜，以細河砂的移栽成活率最高，3個品種的幼苗成活率達86.67%～100%，其次為蛭石，試管苗成活率為71.67%～85.00%，而以腐殖質(zhì)土為基質(zhì)的試管苗成活率只有33.33%～43.33%，幼苗很少發(fā)新根。試管苗不需煉苗，可直接從培養(yǎng)瓶移栽到基質(zhì)中，這與曾斌等[10]將已生根的瓶苗移出培養(yǎng)室，放置散射光較強處煉苗，使瓶苗在出瓶前充分進行光、濕、溫鍛煉的研究結(jié)果一致。移出3 d后擰松瓶蓋，5 d后將瓶蓋揭開，7 d后小心倒出瓶苗，用自來水沖洗，洗凈培養(yǎng)基，并直接移植到塑料小拱棚或溫室內(nèi)的苗床上，這與潘春云等[11]先將葡萄試管苗煉苗7～11 d，再移栽到營養(yǎng)缽中有所不同。

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