毛丹 梁芳芳 孫朝霞 趙鵬飛

摘要 選用朝天椒品系A(chǔ)1、B173這2份材料的F2代群體，運(yùn)用SSR構(gòu)建辣椒分子連鎖圖譜，進(jìn)行辣椒素、二氫辣椒素含量的QTL分析。結(jié)果表明，F(xiàn)2個(gè)體的辣椒素含量和二氫辣椒素含量的變異范圍超出親本的范圍，為辣椒素和二氫辣椒素的QTL性狀分子標(biāo)記篩選提供了較好的遺傳基礎(chǔ)。利用篩選出來(lái)的 62對(duì)SSR 標(biāo)記對(duì)群體DNA 進(jìn)行遺傳分析，共檢測(cè)到2個(gè)辣椒素QTL 位點(diǎn)，3個(gè)二氫辣椒素QTL 位點(diǎn);將10個(gè)連鎖群與辣椒染色體進(jìn)行了對(duì)應(yīng)，以上5個(gè)QTL位點(diǎn)可能均位于2號(hào)染色體上。該研究對(duì)朝天椒辣椒素含量的遺傳控制和分子標(biāo)記輔助選擇具有重要意義。

關(guān)鍵詞 朝天椒;辣椒素;二氫辣椒素;數(shù)量性狀位點(diǎn)

中圖分類號(hào) S 641.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2022）04-0048-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.04.015

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

CapsaicinContent and Phenotype of CorrelationAnalysis with Capsicum annuumParents

MAO Dan1，2，LIANG Fang-fang3，SUN Chao-xia4 et al （1.Henan Dingyou Agricultural Technology Co.，Ltd.，Zhengzhou，Henan 450015;2.Henan Seed Station， Zhengzhou，Henan 450015;3.Henan Vocational College of Agriculture，Zhongmu，Henan451450;4.Henan Red and Green Pepper Seed Industry，Zhengzhou，Henan 450004）

Abstract In this experiment，F(xiàn)2 populations of pepper strains A1 and B173 were selected to construct pepper molecular linkage map by SSR，and QTL analysis of capsaicin and dihydrocapsaicin content was carried out.The results showed that the variation range of capsaicin and dihydrocapsaicin content in F2 individuals were beyond the range of parents.It provided a good genetic basis for molecular marker screening of capsaicin and dihydrocapsaicin trait QTL.The 62 pairs of SSR markers were used for genetic analysis of population DNA.A total of 2 capsaicin QTL loci and 3 dihydrocapsaicin QTL loci were detected.Five QTL locus related to capsaicin and dihydrocapsaicin content were detected on P2 chromosomes.The results will be of great significance for the genetic control of capsaicin content and molecular marker assisted selection.

Key words Capsicum frutescensr;Capsaicin;Dihydrocapsaicin;QTL（Quantitative Trait Loci）

基金項(xiàng)目 鄭州市第四批“智慧鄭州”1125聚才計(jì)劃人才團(tuán)隊(duì)“朝天椒抗病優(yōu)質(zhì)基因資源挖掘及雜交優(yōu)勢(shì)利用”（鄭政預(yù)〔2019〕673號(hào)）;河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院科研創(chuàng)新人才項(xiàng)目（HNACSRHR-2021-05）。

作者簡(jiǎn)介 毛丹（1975—），男，河南許昌人，高級(jí)農(nóng)藝師，碩士，從事農(nóng)作物試驗(yàn)與示范研究。*通信作者，副教授，碩士，從事蔬菜教學(xué)和研究。

收稿日期 2021-12-22;修回日期 2021-12-27

辣椒（Capsicum annuum L.）為茄科（Solanaceae）辣椒屬（Capsicum）作物，目前在世界范圍內(nèi)都是主要的經(jīng)濟(jì)作物，特別是在中國(guó)和韓國(guó)[1-3]。朝天椒（Capsicum frutescensr）是辣椒變種，常作一年生栽培。與辣味相關(guān)的辣椒素類物質(zhì)有辣椒素（capsaicin）、二氫辣椒素（dihydrocapsaicin）、高辣椒素、高二氫辣椒素和降二氫辣椒素5類[4]。辣椒素和二氫辣椒素是起主要作用的辣椒素，提供了約90%的辣感和熱感，約占總量的90%[5-6]。辣椒素（capsaicin）具有預(yù)防心血管疾病和消化道疾病、減肥等藥理作用[7-11]。Kim等[12]研究證明辣椒素能改變細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)。筆者選用朝天椒品系A(chǔ)1、B173這2份材料的F2代群體，運(yùn)用SSR構(gòu)建辣椒分子連鎖圖譜，進(jìn)行辣椒素、二氫辣椒素含量的QTL分析，以期檢測(cè)辣椒素QTL 位點(diǎn)和二氫辣椒素QTL 位點(diǎn)，明確辣椒素含量及辣椒表型與親代相關(guān)性，為加快高辣朝天椒新品種培育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2019年4月和5月，以朝天椒品系A(chǔ)1為父本、品系B173為母本配制雜交組合，2020年獲得F1單株，進(jìn)一步自交產(chǎn)生F2，2021年種植F2分離群體，同時(shí)種植親本朝天椒品系A(chǔ)1、B173和F1、F2分離群體共76個(gè)單株。2019—2021年所有試驗(yàn)材料均種植在河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院高新科技園試驗(yàn)基地。苗期取樣提取基因組DNA;果實(shí)青熟時(shí)采集果實(shí)測(cè)定辣椒素和二氫辣椒素含量。

1.2 辣椒素和二氫辣椒素的測(cè)定 利用超高效液相色譜（UPLC）測(cè)定朝天椒辣椒素和二氫辣椒素含量。

1.3 辣椒素含量的 QTL定位

1.3.1 基因組DNA的提取。苗期取辣椒品系A(chǔ)1、B173、F1和F2分離群體的幼嫩真葉，F(xiàn)2分離群體按單株取樣。DNA 提取方法采用CTAB 法[13]。

1.3.2 SSR標(biāo)記引物。

利用300 對(duì)均勻分布在辣椒染色體上的SSR 引物對(duì)辣椒親本進(jìn)行多樣性篩選[14-17]。SSR 標(biāo)記的PCR 反應(yīng)采用25 μL 反應(yīng)體系，包括20 ng總 DNA、0.2 mmol/L dNTP、0.5 U Taq DNA 聚合酶、2 mmol/L Mg2+（10×buffer）、正向和反向引物各0.33 μmol/L。SSR 標(biāo)記反應(yīng)程序：94 ℃ 預(yù)變性3 min;94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 次循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR 反應(yīng)產(chǎn)物用 10% 變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，電泳緩沖液為1倍TBE，180 V恒壓電泳1.0～1.5 h。

1.3.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染顯色。參考Mimura聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染顯色[17]。

1.3.4 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建和QTL定位。篩選在父母本間表現(xiàn)多態(tài)的SSR 標(biāo)記;利用獲得的多態(tài)性引物分析F2群體各單株基因型;將篩選到的親本和F2群體中多態(tài)性標(biāo)記數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件進(jìn)行分析并構(gòu)建遺傳連鎖圖[18]。采用 Kosambi 函數(shù)計(jì)算遺傳距離，利用軟件區(qū)間作圖法進(jìn)行 QTL 定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1和圖2可知，辣椒素的回歸方程為Y=106X-568.73，R2=0.997 8，二氫辣椒素的回歸方程為Y=6 386 890X+2 962.65，R2=0.998 9，表明辣椒素和二氫辣椒素在0.01～1.00 mg/mL線性關(guān)系良好，即峰面積與進(jìn)樣量有良好的線性關(guān)系。

2.2 辣椒素和二氫辣椒素含量

取親本、雜交F1和F2分離群體的辣椒樣品，測(cè)定峰面積，計(jì)算辣椒素和二氫辣椒素含量，對(duì)F2個(gè)體的辣椒素和二氫辣椒素含量分析表明，其性狀的變異范圍超出了親本的范圍（表1），說(shuō)明控制這2個(gè)性狀的增效基因和減效基因在雙親中是分散的，這為辣椒素和二氫辣椒素性狀QTL的分子標(biāo)記篩選提供了較好的遺傳基礎(chǔ)。F2群體的辣椒素和二氫辣椒素含量均表現(xiàn)出超親分離現(xiàn)象，適合QTL的定位分析。

2.3 標(biāo)記的篩選

利用已公布的300 對(duì)SSR 引物對(duì)兩親本辣椒品系A(chǔ)1、品系B173及其F1進(jìn)行差異引物篩選，在兩親本間有差異的引物共有62對(duì)，占所有用于擴(kuò)增引物的20.67%（圖3）。

2.4 群體分析、圖譜構(gòu)建QTL位點(diǎn)的定位分析

利用篩選出來(lái)的 62對(duì)SSR 標(biāo)記對(duì)群體DNA 進(jìn)行遺傳分析（圖 4），對(duì)多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)的分離比例與孟德?tīng)柪碚摲蛛x比例3∶1（完全顯性）和1∶2∶1（共顯性）進(jìn)行了χ2測(cè)驗(yàn)，有9對(duì)引物表現(xiàn)偏分離，其余均符合孟德?tīng)柗蛛x比例。采用 JionMap 4.0 對(duì)標(biāo)記統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行遺傳連鎖性分析，構(gòu)建了由10個(gè)連鎖群構(gòu)成的遺傳連鎖圖譜，其上共有65個(gè)SSR標(biāo)記。共檢測(cè)到2個(gè)辣椒素QTL 位點(diǎn)， 3個(gè)二氫辣椒素QTL 位點(diǎn)。參照辣椒遺傳連鎖圖譜，將10個(gè)連鎖群與辣椒染色體進(jìn)行了對(duì)應(yīng)，以上5個(gè)QTL位點(diǎn)可能均位于2號(hào)染色體上。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)采集青熟時(shí)果實(shí)，對(duì)親本朝天椒品系A(chǔ)1、B173和F1、F2分離群體的辣椒素和二氫辣椒素含量進(jìn)行分析，結(jié)果表明，F(xiàn)2 群體的辣椒素和二氫辣椒素含量均表現(xiàn)出超親分離現(xiàn)象，適合QTL的定位分析。利用已公布的300 對(duì)SSR 引物對(duì)兩親本朝天椒品系A(chǔ)1、品系B173及其F1進(jìn)行差異引物篩選，在兩親本間有差異的引物共有62對(duì)，占所有用于擴(kuò)增引物的20.67%。利用篩選出來(lái)的 62對(duì)SSR 標(biāo)記對(duì)群體DNA 進(jìn)行遺傳分析，對(duì)多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)的分離比例與孟德?tīng)柪碚摲蛛x比例3∶1（完全顯性）和1∶2∶1（共顯性）進(jìn)行了χ2測(cè)驗(yàn)，有9對(duì)引物表現(xiàn)偏分離，其余均符合孟德?tīng)柗蛛x比例。偏分離位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)、標(biāo)記定位和遺傳效應(yīng)研究都需要有高密度的分子遺傳圖譜為基礎(chǔ)，目前絕大多數(shù)重要植物上開(kāi)展了遺傳作圖[19]。構(gòu)建了由10個(gè)連鎖群構(gòu)成的遺傳連鎖圖譜，其上共有65個(gè)SSR標(biāo)記。共檢測(cè)到2個(gè)辣椒素QTL 位點(diǎn)， 3個(gè)二氫辣椒素QTL 位點(diǎn)。參照辣椒遺傳連鎖圖譜，將10個(gè)連鎖群與辣椒染色體進(jìn)行了對(duì)應(yīng)，以上5個(gè)QTL位點(diǎn)可能均位于2號(hào)染色體上。5個(gè)QTL位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，初步明確了辣椒素含量及辣椒表型與親代相關(guān)性，為加快高辣朝天椒新品種培育提供理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]

CHEN C M，HAO X F，CHEN G J，et al.Characterization of a new male sterility-related gene Camf1 in Capsicum annum L.[J].Molecular biology reports，2011，39（1）：737-744.

[2] 鄒學(xué)校，張竹青，陳文超，等.辣椒果實(shí)性狀的遺傳分析[J].西北植物學(xué)報(bào)，2007，27（3）：497-501.

[3] 劉辰，馬寧，付楠，等.辣椒GMS育性相關(guān)候選基因的克隆及表達(dá)分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，47（16）：3264-3276.

[4] KORKUTATA N F，KAVAZ A.A comparative study of ascorbic acid and capsaicinoid contents in red hot peppers （Capsium annum L.） grown in Southeastern Anatolia Region[J].International journal of food properties，2015，18（4）：725-734.

[5] USMAN M G，RAFII M Y，ISMAIL M R，et al.Capsaicin and dihydrocapsaicin determination in chili pepper genotypes using ultra-fast liquid chromatography[J].Molecules，2014，19（5）：6474-6488.

[6] WU S X，ZENG J M，XIE H，et al.Capsaicin determination and chili sauce discrimination using low-cost and portable electrochemical sensors based on all graphite pencil electrodes[J].Analytical methods，2016，8（39）：7025-7029.

[7] MAIHFNER C，SCHMELZ M，F(xiàn)ORSTER C，et al.Neural activation during experimental allodynia：A functional magnetic resonance imaging study [J].European journal of neuroscience，2004，19（12）：3211-3218.

[8] KEMPAIAH R K，MANJUNATHA H，SRINIVASAN K.Protective effect of dietary capsaicin on induced oxidation of low-density lipoprotein in rats [J].Molecular and cellular biochemistry，2005，275（1/2）：7-13.

[9] KATAGIRI F，INOUE S，SATO Y，et al.Ecabet sodium raises plasma levels of calcitonin gene-related peptide and substance P in healthy humans[J].Journal of pharmacy and pharmacology，2010，57（6）：799-805.

[10] BARTNESS T J，SONG C K，SHI H F，et al.Brain-adipose tissue cross talk[J].Proceedings of the nutrition society，2005，64（1）：53-64.

[11] 姜越君，劉素純，李佳蓮，等.辣椒素的生理功能及提取研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（31）：15426-15428.

[12] KIM J D，KIM J M，PYO J O，et al.Capsaicin can alter the expression of tumor forming-related genes which might be followed by induction of apoptosis of a Korean stomach cancer cell line，SNU-1[J].Cancer letters，1997，120（2）：235-241.

[13] KUMAR S，RAI M.Chile in India[J].Theoretical and applied genetics，2005，75：224-228.

[14] LEE J M，NAHM S H，KIM Y M，et al.Characterization and molecular genetic mapping of microsatellite loci in pepper[J].Theoretical and applied genetics，2004，108（4）：619-627.

[15] YI G，LEE J M，LEE S，et al.Exploitation of pepper EST-SSRs and an SSR-based linkage map[J].Theoretical and applied genetics，2006，114（1）：113-130.

[16]

MINAMIYAMA Y，TSURO M，HIRAI M.An SSR-based linkage map of Capsicum annuum[J].Molecular breeding，2006，18（2）：157-169.

[17] MIMURA Y，INOUE T，MINAMIYAMA Y，et al.An SSR-based genetic map of pepper （Capsicumannuum L.） serves as an anchor for the alignment of major pepper maps[J].Breeding science，2012，62（1）：93-98.

[18] VAN OOIJEN J W.JoinMap 4：Software for the calculation of genetic linkage maps in experimental populations[M].Wageningen，Netherlands：Kyazma BV，2006.

[19] 宋憲亮，孫學(xué)振，張?zhí)煺?偏分離及對(duì)植物遺傳作圖的影響[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2006，14（2）：286-292.

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