童凌斐，胡建新

江西省人民醫(yī)院（南昌醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院），江西 南昌 330006

由細(xì)菌引起的臨床危重感染特別是膿毒癥日益增多，盡管使用了包括碳青霉烯類在內(nèi)的各種強(qiáng)效廣譜抗菌藥物，但感染患者的死亡率仍居高不下［1］。其原因可能與抗菌藥物在殺死細(xì)菌的同時(shí)會(huì)誘導(dǎo)釋放大量的內(nèi)毒素引起全身炎癥反應(yīng)和嚴(yán)重膿毒癥相關(guān)，從而導(dǎo)致臨床最終治療失?。?］。內(nèi)毒素是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的重要組成成分［3］。巨噬細(xì)胞在內(nèi)毒素的作用下釋放相關(guān)的炎癥因子，進(jìn)而引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）反應(yīng)，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、血清炎癥因子白介素-6（IL-6）等炎癥因子濃度會(huì)升高［4］。作為中藥爵科植物穿心蓮有效成分之一的穿心蓮內(nèi)酯，既往研究能有效減輕機(jī)體的炎癥反應(yīng)［5］，從而提高臨床療效，但穿心蓮內(nèi)酯所發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)并不十分明確，是否能直接中和或破壞內(nèi)毒素結(jié)構(gòu)的具體成分尚未明確，因此以其為例進(jìn)行研究，進(jìn)行體內(nèi)外拮抗試驗(yàn)，明確其相關(guān)作用，對未來防治膿毒癥具有重要的參考意義。

1 材料

1.1 試劑和藥物

鱟試劑盒（廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司，0.1～1.0 EU/mL）；脂多糖（LPS，美國sigma-aldrich公司，大腸桿菌0111:B4，批號L5293-2ML）；穿心蓮內(nèi)酯（阿拉丁試劑上海有限公司）；RAW264.7 細(xì)胞（中國科學(xué)院上海生化與細(xì)胞研究所），內(nèi)毒素檢測用水（廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司）；IL-6 ELISA 試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，EK0412）；TNF-α ELISA 試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，EK0526）。DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基（賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司），胎牛血清（杭州四季青生物科技有限公司），其余試劑均為分析純，所有實(shí)驗(yàn)用水均為去離子超純水。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與儀器

清潔級KM 小鼠50 只（體重18～20 g/只，南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可編號：ncdx2019102，雌雄兼用，雌鼠未孕）；鱟試驗(yàn)微生物快速檢測系統(tǒng)ELx808IU-SN（廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司）。

2 方法

2.1 體外中和內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)

首先將實(shí)驗(yàn)分組為：LPS 組，LPS+穿心蓮內(nèi)酯組，穿心蓮內(nèi)酯對照組（40 μg/mL）。LPS 組作為陽性對照；LPS 組、LPS+穿心蓮內(nèi)酯組中的LPS 劑量均為10 ng/mL；配置好為80、40 和20 μg/mL 的穿心蓮內(nèi)酯濃度，再加入LPS 10 ng/mL 分別在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min 進(jìn)行體外中和實(shí)驗(yàn)，與LPS 組進(jìn)行對比以探究穿心蓮內(nèi)酯的作用。取孵育后樣品100 μL，每個(gè)樣品設(shè)6 復(fù)孔，每組樣品中的LPS 可通過鱟試劑動(dòng)態(tài)濁度法檢測。被穿心蓮內(nèi)酯中和的內(nèi)毒素占加入的內(nèi)毒素總量的百分比表示清除率：清除率=（內(nèi)毒素總量-未被中和的內(nèi)毒素量）/內(nèi)毒素總量×100%。

2.2 穿心蓮內(nèi)酯對LPS 刺激RAW264.7 表達(dá)細(xì)胞因子的抑制實(shí)驗(yàn)

首先在DMEM 培養(yǎng)液中加入10%的胎牛血清、100 U/mL 的鏈霉素和100 U/mL 的青霉素，于37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。調(diào)整RAW264.7 細(xì)胞數(shù)為1×105/mL 在48 孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)；其中0.5 mL細(xì)胞液/孔對小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7 進(jìn)行培養(yǎng)。

用10 ng/mL 的LPS 刺激RAW264.7 細(xì)胞1 h 后，之后分別加入80、40、20 μg/mL 的穿心蓮內(nèi)酯，共同孵育4 h 取上清測相關(guān)的炎性因子，根據(jù)對應(yīng)添加的穿心蓮內(nèi)酯濃度的不同，觀察其對內(nèi)毒素刺激RAW264.7 細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子的抑制作用的量效關(guān)系，ELISA 法檢測培養(yǎng)液上清中TNF-α 和IL-6 的濃度。以LPS組作為LPS+穿心蓮內(nèi)酯組的陽性對照。

2.3 穿心蓮內(nèi)酯對LPS 攻擊小鼠的保護(hù)實(shí)驗(yàn)

體重18～20 g/只的KM 小鼠雌雄各25 只，編號后隨機(jī)分組。分別設(shè)空白對照組，LPS 對照組，LPS+穿心蓮內(nèi)酯組（高、中、低三個(gè)濃度）；每組10 只小鼠，穿心蓮內(nèi)酯的藥物濃度分別為160，80和40 mg/kg，LPS：18 mg/kg。均 按300 μL/20 g 體積對所有小鼠進(jìn)行注射，之后6 h 后去除眼球采血。同時(shí)檢測小鼠血清中的IL-6 和TNF-α 濃度，分析LPS 攻擊小鼠的炎癥反應(yīng)以及穿心蓮內(nèi)酯在體內(nèi)對LPS 的抑制和拮抗作用。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 體外中和內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)

與LPS 對照組比較，高、中、低劑量的穿心蓮內(nèi)酯在體外均有不同程度的中和內(nèi)毒素作用，測定值與對照組比較均顯著降低（見表1）。隨著穿心蓮內(nèi)酯濃度的成倍升高，內(nèi)毒素清除也增加，顯示穿心蓮內(nèi)酯具有體外清除內(nèi)毒素的作用。

表1 3種不同濃度穿心蓮內(nèi)酯的體外中和內(nèi)毒素試驗(yàn)

3.2 穿心蓮內(nèi)酯對LPS 刺激RAW264.7 的抑制實(shí)驗(yàn)

抑制試驗(yàn)中細(xì)胞上清液IL-6 和TNF-α 的Elisa 檢測結(jié)果如圖1 和2 所示。在空白對照組中，RAW264.7 細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中IL-6、TNF-α 含量極低。當(dāng)給予10 μg/mL LPS 刺激后，RAW264.7細(xì)胞分泌的IL-6、TNF-α 含量顯著增高，分別達(dá)到75.3 pg/mL 和360.2 pg/mL，隨后分別與80、40、20 μg/mL 的穿心蓮內(nèi)酯孵育時(shí)，三組治療組均能不同程度地降低RAW264.7 細(xì)胞分泌的IL-6 和TNF-α 含量。其中80 μg/mL 的穿心蓮內(nèi)酯能顯著降低抑制試驗(yàn)中的IL-6 和TNF-α 水平，分別對應(yīng)降至23.2 pg/mL 和88.9 pg/mL 左右，結(jié)果表明穿心蓮內(nèi)酯能抑制LPS 對RAW264.7 細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥刺激作用，當(dāng)其濃度越高時(shí)效果更顯著，各濃度組與LPS 組比較，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001），并且各濃度組間也差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 三種濃度的穿心蓮內(nèi)酯抑制試驗(yàn)中IL-6結(jié)果

圖2 三種濃度的穿心蓮內(nèi)酯對抑制試驗(yàn)中TNF-α結(jié)果

3.3 穿心蓮內(nèi)酯對LPS 攻擊小鼠的保護(hù)實(shí)驗(yàn)

給予小鼠尾靜脈注射18 mg/kg 的LPS，統(tǒng)計(jì)空白對照組、LPS 對照組、LPS+40 μg/mL、LPS+80 μg/mL 和LPS+160 μg/mL 各組小鼠注射6 h 后IL-6和TNF-α 含量來確定小鼠保護(hù)試驗(yàn)的結(jié)果，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)如表2 所示。注射LPS 入體內(nèi)6 h 后，LPS 對照組的血清TNF-α 和IL-6 濃度分別高達(dá)789.1 和897.5 pg/mL。給予穿心蓮內(nèi)酯160 μg/mL 時(shí)，小鼠血清TNF-α 和IL-6 的數(shù)值明顯下降至LPS 對照組的TNF-α 和IL-6 濃度的四分之一以下，分別為168.3 和200.4 pg/mL。選取尾靜脈注射18 mg/kg 的LPS 來攻擊小鼠時(shí)，反饋穿心蓮內(nèi)酯對其有保護(hù)作用，而且與濃度呈正相關(guān)，各濃度組間與LPS 比較，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001），并且各濃度組間也差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 LPS三種濃度的穿心蓮內(nèi)酯對LPS攻擊小鼠6 h后的IL-6和TNF-α值（） pg/mL

表2 LPS三種濃度的穿心蓮內(nèi)酯對LPS攻擊小鼠6 h后的IL-6和TNF-α值（） pg/mL

4 討論

家兔法雖然是熱原反應(yīng)檢查的首選，但只能定性且操作繁瑣，難以用于內(nèi)毒素定量，故本實(shí)驗(yàn)采用鱟試驗(yàn)法，相對操作簡單［6］。膿毒癥所產(chǎn)生的炎性因子是感染性疾病發(fā)生過程中重要的組成部分，某種程度上可決定膿毒癥的轉(zhuǎn)歸，炎癥因子中TNF-α 和IL-6 相對較活躍［7］。有研究表明，在治療銅綠假單胞菌引起的膿毒癥患者時(shí)，穿心蓮內(nèi)酯可減少侵襲的細(xì)菌數(shù)量，降低細(xì)菌感染所致上皮細(xì)胞乳酸脫氫酶的釋放及線粒體損傷，降低機(jī)體損傷程度［8］。本研究表明，穿心蓮內(nèi)酯在體外可以一定程度中和內(nèi)毒素；在對LPS 刺激RAW264.7 細(xì)胞的抑制實(shí)驗(yàn)中，穿心蓮內(nèi)酯濃度越高，IL-6 和TNF-α 相對清除越多；穿心蓮內(nèi)酯對LPS 攻擊小鼠的保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的穿心蓮內(nèi)酯均具有一定的抗炎作用，表明體內(nèi)LPS 可被其有效清除，避免更大的炎癥連鎖級聯(lián)反應(yīng)。

綜上所述，穿心蓮內(nèi)酯可抑制或中和細(xì)菌的LPS 產(chǎn)生，可減少炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的IL-6 和TNF-α，從而減少炎癥風(fēng)暴的產(chǎn)生，減少膿毒癥對相關(guān)臟器的損傷，為中醫(yī)輔助治療膿毒癥或膿毒癥休克提供理論依據(jù)，為后續(xù)的中西醫(yī)合璧治療提供新思路。