賀偉平，黃春

萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院，江西 萍鄉(xiāng) 337055

糖尿病是世界上最普遍的疾病之一，并且與高死亡率指數(shù)相關(guān)，其主要并發(fā)癥之一是糖尿病足［1］。糖尿病足臨床表現(xiàn)為糖尿病患者下肢缺血或下肢神經(jīng)病變，產(chǎn)生足部潰瘍或組織病變，感染或不感染，嚴(yán)重者需要截肢或者導(dǎo)致死亡［2］。古籍最早記載糖尿病足為“脫癰”，后更名為“脫疽”［3］。發(fā)病通常在足趾，呈赤黑色。在中國(guó)，50 歲以上的糖尿病人中有8.1%患有糖尿病足潰瘍（diabetic foot ulcer,DFU），截肢率和死亡率據(jù)估計(jì)為22%和11%［4］。針對(duì)此病，西醫(yī)采用手術(shù)或非手術(shù)的方式治療，比如：控制血糖、調(diào)節(jié)代謝、增加足部血液微循環(huán)，減少感染等等［5］，但效果不佳，且治療費(fèi)用高昂，對(duì)患者家庭的經(jīng)濟(jì)造成一定的困難。隨著中醫(yī)藥的發(fā)展，關(guān)于DFU 的研究和中醫(yī)診療取得了很大的進(jìn)展。中醫(yī)治療DFU 主要從以下幾個(gè)方面入手：中藥外治、針灸推拿和按摩、中藥內(nèi)服等［5］。中藥外治包括外洗、膏藥貼敷、藥粉箍圍、中藥濕敷等。有學(xué)者通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)對(duì)于糖尿病足的外治方法多為活血祛瘀類、祛風(fēng)除濕類以及清熱消腫等藥物［4,6］。

本研究采用的活血化瘀方是綜合歷代中醫(yī)多年臨床經(jīng)驗(yàn)，在黃芪桂枝五物湯基礎(chǔ)上加減而成，含黃芪30 g、桂枝10 g、三七30 g、丹參20 g、雞血藤20 g、牛膝15 g、桑枝10 g 和甘草10 g 八味藥。黃芪是補(bǔ)益類中藥，可利水消腫，托毒生肌。桂枝溫通經(jīng)脈，助陽(yáng)化氣。有研究證明黃芪和桂枝配伍可以降低糖尿病足患者的血糖，降低機(jī)體炎癥［7］。三七化瘀止血，活血定痛，常治療跌打損傷，瘀血腫痛。研究表明三七總甙對(duì)糖尿病足患者具有很好的改善作用，可改善缺血病況，提高患者的康復(fù)速度［8］。丹參活血祛瘀，涼血消癰，臨床研究表明丹參注射液對(duì)糖尿病足的治療具有較好的療效［9］。雞血藤具有活血補(bǔ)血，舒筋活絡(luò)之功效，有研究表明，雞血藤水提物能改善糖尿病足大鼠模型的潰瘍，降低炎癥因子水平［10］。藥典記載牛膝可以逐瘀通經(jīng)，補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨；桑枝可以祛風(fēng)濕，利關(guān)節(jié)；甘草可調(diào)和諸藥，并能預(yù)防糖尿病并發(fā)癥。

雖然目前尚無(wú)其他已發(fā)表的研究關(guān)注本活血化瘀方對(duì)糖尿病足的治療效果，但是該方是經(jīng)萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱我院）專家協(xié)定而成，又經(jīng)我院小樣本臨床實(shí)踐證明其對(duì)DFU 的作用效果良好，所以該方具有很好的研究?jī)r(jià)值。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，探討本組方對(duì)糖尿病足的藥理機(jī)制?；凇俺煞?靶點(diǎn)-疾病”的互作網(wǎng)絡(luò)揭示藥物和疾病之間的聯(lián)系，活性成分和疾病之間的聯(lián)系，通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證成分靶點(diǎn)之間的作用力，為后續(xù)復(fù)方制劑的進(jìn)一步開發(fā)和臨床應(yīng)用提供參考。

1 方法

1.1 活性成分收集和靶點(diǎn)篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）分別檢索黃芪、桂枝、三七、丹參、雞血藤、牛膝、桑枝和甘草的化學(xué)成分。根據(jù)一定條件進(jìn)行篩選，即口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%和類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18，得到該組方的有效成分，然后在數(shù)據(jù)庫(kù)里得到有效成分相對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，在Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)將靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換成對(duì)應(yīng)的基因靶點(diǎn)。

1.2 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將“1.1”方法中收集到的成分和靶點(diǎn)構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)以了解活血化瘀湯活性成分和對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)之間的關(guān)系。利用Cytoscape 3.9.0 軟件制作網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 疾病靶點(diǎn)收集

以“diabetic foot ulcer”或“diabetic foot”為關(guān)鍵詞，在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索糖尿病足的相關(guān)靶點(diǎn)。刪除重復(fù)的靶點(diǎn)，在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)將靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換成對(duì)應(yīng)的基因靶點(diǎn)。

1.4 共同靶點(diǎn)的篩選

利用Venny 2.1.0 在線平臺(tái)分析“1.1”方法中收集到的成分靶點(diǎn)和“1.3”方法中收集到的疾病靶點(diǎn)，取交集，即為活血化瘀方作用于疾病的共同靶點(diǎn)。

1.5 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心作用蛋白的篩選

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。將網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cystoscope 軟件進(jìn)行結(jié)果分析，根據(jù)度值排名統(tǒng)計(jì)，得到藥物與疾病交互靶點(diǎn)中的核心關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.6 關(guān)鍵靶點(diǎn)GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析

為了研究活血化瘀方治療DFU 的潛在分子機(jī)制，運(yùn)用Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)上述獲得的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能富集分析和KEGG 通路分析。GO功能富集分析主要包括生物過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能三個(gè)方面。

1.7 “藥物-有效成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用Cytoscape 軟件，對(duì)活性成分、靶點(diǎn)與通路的結(jié)果進(jìn)行綜合性分析，構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.8 分子對(duì)接

根據(jù)“1.5”方法中得到的度值排名前3 的核心靶點(diǎn)蛋白及度值排名前3 的成分運(yùn)用AutoDock軟件對(duì)兩者進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。首先在PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載核心靶點(diǎn)蛋白的pdb 格式結(jié)構(gòu)文件。在AutoDock 軟件中進(jìn)行一定的操作，如加氫、去水等修飾該蛋白。然后在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載化學(xué)成分的mol2 文件，利用AutoDock 軟件對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾。然后在AutoDock 軟件中進(jìn)行分子對(duì)接。

2 結(jié)果

2.1 活血化瘀方活性成分及靶點(diǎn)的獲取

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索黃芪、桂枝、三七、丹參、雞血藤、牛膝、桑枝和甘草的化合物，并按照“1.1”方法中的篩選條件收集化合物，共收集到212 個(gè)化合物，其中黃芪20 個(gè)，桂枝7 個(gè)，三七8個(gè)，丹參65 個(gè)，牛膝20 個(gè)，雞血藤24 個(gè)，桑枝3個(gè)，甘草92 個(gè)。剔除重復(fù)成分后共計(jì)212 個(gè)，重復(fù)成分如下表1。然后依次收集212 個(gè)成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，再合并去除重復(fù)的靶點(diǎn)，獲得290 個(gè)靶點(diǎn)，運(yùn)用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)將相關(guān)靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換成對(duì)應(yīng)的基因信息。

表1 活血化瘀湯共同有效成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)數(shù)目

2.2 成分-靶點(diǎn)相互作用

利用Cystoscope 軟件構(gòu)建活血化瘀湯活性成分和靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，一共得到483 個(gè)節(jié)點(diǎn)，3 246 條邊。通過(guò)軟件計(jì)算所有節(jié)點(diǎn)度值，我們發(fā)現(xiàn)排名前三的成分為槲皮素，山柰酚和木犀草素。

2.3 糖尿病足的疾病相關(guān)靶點(diǎn)獲取

用“diabetic foot ulcer”或“diabetic foot”分別檢索Genecards、OMIM、TDD 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得疾病靶點(diǎn)，在OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)以“diabetic foot ulcer”為檢索詞獲得595 個(gè)靶點(diǎn)，以“diabetic foot”為檢索詞獲得601 個(gè)靶點(diǎn)，合并剔除重復(fù)靶點(diǎn)后共624 個(gè)。在TDD 數(shù)據(jù)庫(kù)分別用兩個(gè)檢索詞檢索到靶點(diǎn)20 個(gè)。在Genecard 數(shù)據(jù)庫(kù)以“diabetic foot ulcer”為檢索詞獲得2 550 個(gè)靶點(diǎn)，以“diabetic foot”為檢索詞獲得4 839 個(gè)靶點(diǎn)。合并3 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的疾病靶點(diǎn)并剔除重復(fù)靶點(diǎn)后獲得5 349 個(gè)靶點(diǎn)。

2.4 交集靶點(diǎn)收集和PPI 蛋白網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系

利用Venny 2.1.0 在線平臺(tái)分析對(duì)復(fù)方靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)取交集，如圖1 所示。205 個(gè)共有靶點(diǎn)或?yàn)榛钛鰷委烡FU 疾病的靶點(diǎn)。將205 個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）。將205 個(gè)交集靶點(diǎn)和“2.1”收集到的活性成分相互關(guān)聯(lián)，剔除沒(méi)有交集靶點(diǎn)的成分，得到179個(gè)有效成分。將179 個(gè)成分和205 個(gè)交集靶點(diǎn)用Cystoscope 軟件進(jìn)行分析，得出“成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)互作圖（圖3），根據(jù)度值排名，統(tǒng)計(jì)前10 的共表達(dá)基因靶點(diǎn)（表2）。

表2 度值排名前10的活性成分和交集靶點(diǎn)列表

圖1 活血化瘀湯活性成分靶點(diǎn)與DFU疾病靶點(diǎn)的共同靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 活血化瘀方治療糖尿病足的靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 活血化瘀方活性成分與糖尿病足的交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 活血化瘀方治療DFU 的分子機(jī)制

利用Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)將“2.1”獲得的205 個(gè)共有基因靶點(diǎn)進(jìn)行GO 和KEGG 通路富集分析。GO功能富集分析依照P 值大小排名繪制條形圖（圖4）。這些結(jié)果表明活血化瘀湯治療DFU 與細(xì)胞對(duì)氮化合物的反應(yīng)、對(duì)無(wú)機(jī)物的反應(yīng)和對(duì)異種生物刺激的反應(yīng)活性等相關(guān)。KEGG 通路富集分析依照P 值大小排名繪制氣泡圖（圖5）。結(jié)果表明活血化瘀湯治療DFU 與調(diào)控脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化，P13K-Akt信號(hào)等通路有關(guān)。

圖4 GO功能富集分析

圖5 KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果

2.6 “藥物-有效成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將含有活性成分、交集靶點(diǎn)、富集通路的excel數(shù)據(jù)表導(dǎo)入Cytoscape 軟件，構(gòu)建“藥物-有效成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。見圖6。

圖6 “藥物-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 分子對(duì)接驗(yàn)證

將“2.4”結(jié)果中表2 里面度值居前3 位的活性成分槲皮素，山柰酚，木犀草素與關(guān)鍵靶點(diǎn)PTGS2、ESR1、HSP90AA1 對(duì)接，對(duì)接得分見表3。最低結(jié)合能越低說(shuō)明靶蛋白與活性成分之間結(jié)合能力越好。以上結(jié)果表明ESR1、HSP90AA1 與槲皮素，山柰酚，木犀草素之間具有較強(qiáng)的結(jié)合能。PTGS2與槲皮素，山柰酚之間的結(jié)合較弱。以HSP90AA1為例，展示HSP90AA1 與3 個(gè)成分之間的結(jié)合如圖7。

圖7 HSP90AA1與槲皮素，山柰酚，木犀草素的分子對(duì)接圖

表3 度值排名前3的化合物與主要靶點(diǎn)對(duì)接情況 kcal/mol

3 討論

隨著我國(guó)人民生活水平的提高，我國(guó)糖尿病的流行趨勢(shì)不斷攀升，據(jù)《糖尿病流行病學(xué)調(diào)查研究》分析，成人糖尿病患者約占人口11%，嚴(yán)重加重了醫(yī)療負(fù)擔(dān)和患者的痛苦［11］。糖尿病足是糖尿病常見的并發(fā)癥，已發(fā)展成一個(gè)非常嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題［12］。自身的代謝管理、下肢運(yùn)動(dòng)康復(fù)治療及手術(shù)等方式是目前控制糖尿病足的主要方案［13］，但進(jìn)程并不理想。近年來(lái)，隨著中醫(yī)藥不斷進(jìn)步發(fā)展，國(guó)家也在出臺(tái)政策不斷鼓勵(lì)中醫(yī)藥的創(chuàng)新。有不少研究學(xué)者認(rèn)為應(yīng)用中藥治療糖尿病足有很好的治療前景。Zhou 等［14］研究發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方及相關(guān)藥理活性成分對(duì)于促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合有積極作用。

DFU 屬于中醫(yī)的“脫疽”范疇?！懊摼摇逼涿涊d在南齊龔慶宣《劉涓子鬼遺方》沿用至今［3］。脫疽常見“苦渴、數(shù)飲、身熱”等為特征，其病機(jī)多以陰虛燥熱為主，漸至痰瘀內(nèi)結(jié)。如《證治準(zhǔn)繩》曰:“飲食起居，一失其宜，皆能使血瘀滯不行，故百病由瘀血者多”［15］。因此，采用活血化瘀療法可以 “截?cái)嗯まD(zhuǎn)”，阻截疾病的惡化。對(duì)于不同類型的DFU 另可輔以清熱解毒、化痰軟堅(jiān)、溫補(bǔ)脾腎等法，遵照脫疽的分期，根據(jù)疾病的主次側(cè)重，繼而調(diào)和臟腑功能，通暢氣血運(yùn)行，扶正祛邪，從而起到治療作用［16］。

活血化瘀方是我院經(jīng)過(guò)多年實(shí)踐探討的寶貴結(jié)晶，綜合多年臨床經(jīng)驗(yàn)在黃芪桂枝五物湯基礎(chǔ)上，去白芍、生姜、大棗加三七、丹參、雞血藤、牛膝、桑枝、甘草，從而創(chuàng)立益氣活血、通絡(luò)化瘀的“活血化瘀方”。在臨床上已應(yīng)用于糖尿病足的治療，該方在延緩潰瘍進(jìn)程和促進(jìn)潰瘍愈合方面都有良好的進(jìn)展。本次研究結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接等現(xiàn)代科學(xué)方法，深入探討活血化瘀方在DFU 方面的療效。中醫(yī)治療代謝性疾病具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，這與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的特點(diǎn)不謀而合。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)如今已成為研究中醫(yī)藥藥理基礎(chǔ)及其中藥作用疾病的作用機(jī)制研究的一個(gè)熱門工具，在中藥活性成分篩選、中醫(yī)藥多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用機(jī)制闡釋等方面得到了廣泛的應(yīng)用［17］。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選活血化瘀方有效活性成分179 個(gè)，可作用于糖尿病足的治療靶點(diǎn)205個(gè)。排名靠前有效成分分別是槲皮素、山柰酚和木犀草素這3 種黃酮類化合物，提示這些化合物可能是活血化瘀方干預(yù)糖尿病足的核心藥效成分。有研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可以加快糖尿病大鼠難愈性傷口愈合，其機(jī)制與促進(jìn)傷口部位血管新生、肉芽組織增生、膠原纖維沉積，減輕傷口炎癥反應(yīng)有關(guān)［18］。含有槲皮素殼多糖納米粒在修復(fù)皮膚方面也有功效［19］。研究表明，山柰酚和木犀草素對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥的改善作用也很明顯。

根據(jù)PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)PTGS2、ESR1、HSP90AA1 等為關(guān)鍵靶點(diǎn)。PTGS2 蛋白在前列腺素生物合成、脂肪酸生物合成、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性、生理過(guò)程、血壓調(diào)控、環(huán)氧酶途徑、角化細(xì)胞分化、調(diào)控炎癥應(yīng)答等方面發(fā)揮了重要作用。Estrogen receptor 是一種雌激素受體，研究發(fā)現(xiàn)它與女童糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［20］。其中，PTGS2 和HSP90AA1 也是中藥復(fù)方益糖康防治糖尿病腎病的關(guān)鍵靶點(diǎn)［21］。而糖尿病腎病與DFU 病是糖尿病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要的并發(fā)癥。本研究表明，活血化瘀方干預(yù)DFU 的核心靶點(diǎn)與PTGS2、ESR1、HSP90AA1 有關(guān)。

GO 功能富集和KEGG 通路富集結(jié)果顯示活血化瘀湯治療DFU 與細(xì)胞對(duì)氮化合物的反應(yīng)、對(duì)無(wú)機(jī)物的反應(yīng)和對(duì)異種生物刺激的反應(yīng)活性等相關(guān)，可能與脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化，P13K-Akt 信號(hào)等通路有關(guān)。糖尿病病人中發(fā)生脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化的概率明顯高于非糖尿病人，P13K-Akt 信號(hào)通路在糖尿病的治療機(jī)制中研究甚多。在糖尿病腎病的研究中，P13K 的表達(dá)是增多的［22］。綜合以上研究，我們可以得出活血化瘀方通過(guò)槲皮素、山柰酚和木犀草素等活性成分調(diào)控PTGS2、ESR1、HSP90AA1 等靶點(diǎn)基因，進(jìn)而調(diào)控脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化，P13KAkt 信號(hào)通路起到治療DFU 的效果。本研究中，分子對(duì)接表示槲皮素、山柰酚和木犀草素對(duì)ESR1、HSP90AA1 靶點(diǎn)的結(jié)合較好，木犀草素對(duì)PTGS2 的結(jié)合較好，為后續(xù)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和處方開發(fā)提供了方向。