楊佳慧 孫玉萍 陸雅寧 劉歡 盧存福 陳玉珍

（北京林業(yè)大學生物科學與生物技術學院 教育部林木花卉育種與基因工程重點實驗室，北京 100083）

端粒酶的生物學功能研究在寄生蟲［14］、老鼠［15］、人［16］等領域取得較大進展。植物端粒酶的研究最初是在煙草細胞的提取物中檢測到端粒酶活性［17］；并首次從擬南芥懸浮細胞中克隆出擬南芥AtTERT的cDNA，端粒酶分子量131 kD，等電點9.9［18］；Heller-Uszynska等［19］采用同源序列比對的方法克隆出單子葉植物水稻中的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因，為植物端粒酶功能研究奠定了基礎。端粒酶的研究在非模式植物中取得較大進展，建立了不同植物材料端粒酶活性檢測方法［20-21］。已有研究表明，在大腸桿菌中可成功表達出有活性的逆轉(zhuǎn)錄酶，Tanese等［22］構(gòu)建了莫洛尼鼠白血病病毒的pol核心區(qū)域的表達載體，在大腸桿菌中成功表達出具有活性逆轉(zhuǎn)錄酶。

目前，人hTERT已在大腸桿菌中實現(xiàn)活性重建［23］，但尚未見植物TERT在大腸桿菌中發(fā)揮功能的報道。本研究擬在前期研究基礎上，將擬南芥AtTERT轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，誘導表達可溶性AtTERT蛋白，研究其對大腸桿菌生長及非生物脅迫的影響，為深入研究TERT蛋白非端粒功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

所用植物材料為哥倫比亞（Col-0）擬南芥。菌株為實驗室保存的轉(zhuǎn)pET32a-AtTERT原核表達菌株。

IPTG、考馬斯亮藍、GST親和層析純化試劑、鎳柱親和層析純化試劑、Western blotting相關試劑及試劑盒均購自北京拜爾迪生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 原核表達載體構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化 引物設計：利用Primer5軟件分析AtTERT的CDS序列，結(jié)合pET32a和pGEX-4T-1原核表達載體上的多克隆位點信息，確定酶切位點BamH I和NotI。使用軟件CE Design（http://www.vazyme.com）設計引物，pGEX-4T-1和pET32a對應的引物分別為GST-F/R和32-F/R（32-F：5′-gccatggctgatatcggatccATGCCGCGTAA ACCTAGACATC-3′、32-R：5′-tggtggtgctcgagtgcggccgc ATAATTCAACTTCCACAGCGAAG-3′；GST-F：5′-gat ctggttccgcgtggatccATGCCGCGTAAACCTAGACATC-3′、GST-R：5′-tcagtcagtcacgatgcggccgcTCAATAATTCAA CTTCCACAGCGA-3′；小寫字母代表載體序列引物部分）。

目的基因的PCR擴增：提取保存測序正確的AtTERT克隆菌株質(zhì)粒，作為PCR擴增模板，以32a-F/GST-F及引物32a-R/GST-R為引物進行PCR擴增，切膠回收目的基因片段。

1.2.1受試者檢查方法 對受試者開展常規(guī)治療。例如胃腸道減壓、及時抗感染等等。分別使用彩色多普勒超聲診斷設備以及多功能直接數(shù)字化X線成像系統(tǒng)，對患兒開展檢查。受試者取仰臥位，多切面掃查患兒腹部。開展實時監(jiān)控腸壁回聲，全面判定腸壁厚度和腸管外形形狀情況對受試者的腸腔、門靜脈以及腹腔加以觀察，分析是否存在異?，F(xiàn)象。例如擴張積液等等[3]。在此之后，對患兒腹部開展橫向以及縱向掃描檢查，以免發(fā)生積氣假象現(xiàn)象發(fā)生。對探頭加壓，分析積氣來源。全面明確病變位置位于管壁內(nèi)還是管腔中。使用陽性以及陰性，來表示X線檢查和超聲診斷結(jié)果。陽性代表腸壁內(nèi)存在積氣。陰性代表腸壁積氣、腸壁增厚以及門靜脈積氣等均未出現(xiàn)。

載體構(gòu)建：提取pET32a和pGEX-4T-1空載體質(zhì)粒，利用BamH I和NotI進行酶切，然后與目的基因片段重組連接，構(gòu)建原核表達載體pET32a-AtTERT和pGEX-4T-1-AtTERT，并轉(zhuǎn)化Trans5α感受態(tài)細胞進行PCR鑒定。

遺傳轉(zhuǎn)化：選取測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒菌液，轉(zhuǎn)化Transetta（DE3）感受態(tài)細胞中，獲得轉(zhuǎn)化表達菌株。

1.2.2 AtTERT蛋白的誘導表達 融合蛋白誘導表達：將陽性重組菌及空載菌液置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至對數(shù)期（OD600=0.6-0.8）；加入終濃度為1.0 mmol/L IPTG誘導12 h，以不加IPTG作為對照。

樣品制備：收集菌體，使用細胞破碎儀破碎菌體至菌液澄清，并進行SDS-PAGE檢測，融合蛋白純化試驗在4℃條件下操作。

Western blotting檢測：將經(jīng)SDS-PAGE電泳分離蛋白樣品電轉(zhuǎn)至0.45 μm硝酸纖維素膜上，加入一抗（HIS抗體）、二抗（羊抗鼠的辣根過氧化物酶HRP抗體），洗膜、拍照。

1.2.3 轉(zhuǎn)AtTERT大腸桿菌的非生物脅迫抗性檢測 轉(zhuǎn)AtTERT大腸桿菌的生長特性：將對照菌pET32a及轉(zhuǎn)AtTERT重組菌以1∶100的比例接種至新鮮50 mL LB液體培養(yǎng)基（含有終濃度0.5 mmol/L IPTG），誘導至菌液濃度為OD600=0.6，此時記為初始濃度，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)，在2、4、6、8、10和12 h時測量OD600值，做好記錄，并做成曲線。

對照菌pET32a及轉(zhuǎn)AtTERT重組菌活化后，加入終濃度為0.5 mmol/L IPTG，20℃、100 r/min過夜誘導培養(yǎng)；將2種菌稀釋至相同濃度（OD600=1.2），進行不同非生物脅迫抗性檢測存活率，試驗重復3次。

氯化鈉、甘露醇抗性檢測：經(jīng)實驗室前期預試驗，確定氯化鈉的處理濃度為400和500 mmol/L，甘露醇的處理濃度為400和600 mmol/L。取6 μL兩種菌液分別垂直加到LB固體培養(yǎng)基（含有0.5 mmol/L IPTG和NaCl/甘露醇）上，37℃，倒置培養(yǎng)12 h，按照計數(shù)法統(tǒng)計存活率。

低溫抗性檢測：取1 mL的2種菌液于液氮中反復凍融5-6次，然后取6 μL分別垂直加到LB固體培養(yǎng)基（含有0.5 mmol/L IPTG）上，37℃，倒置培養(yǎng)12 h，統(tǒng)計存活率。

過氧化氫（H2O2）耐受性檢測：采用點板計數(shù)法，取6 μL計數(shù)法準備的2種菌液分別垂直加到LB固體培養(yǎng)基（含有0.4 mmol/L H2O2）上，37℃，倒置培養(yǎng)12 h，統(tǒng)計存活率。

2 結(jié)果

2.1 AtTERT的PCR擴增及原核表達載體的構(gòu)建

提取測序正確的菌株質(zhì)粒作為模板進行PCR擴增（圖1），以帶有15-20 bp載體序列的引物進行PCR擴增，獲得目的基因片段，片段大小與預期一致，為3 409 bp。

圖1 AtTERT的PCR擴增Fig. 1 PCR amplification of AtTERT gene

將測序正確的菌液提取質(zhì)粒，并用BamH I及NotI酶切鑒定，酶切后片段大小與目的基因片段一致（圖2），說明pET32a/ pGEX-4T-1-AtTERT原核表達載體構(gòu)建成功。

圖2 pET32a/ pGEX-4T-1-AtTERT重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.2 Double digestion identification of pET32a/ pGEX-4T-1-AtTERT

2.2 AtTERT蛋白的誘導表達及鑒定

2.2.1 誘導表達 GST-AtTERT融合蛋白條件的優(yōu)化 用Transetta（DE3）感受態(tài)細胞對蛋白誘導表達的IPTG濃度（0.3/0.5/1.0 mmol/L）及溫度（20/30℃）進行了優(yōu)化（圖3），在溫度為20℃時特異性蛋白的表達量明顯高于30℃時。在誘導溫度為30℃，IPTG濃度為0.5 和1.0 mmol/L時，特異性蛋白條帶在上清及沉淀中均有表達，但主要存在于沉淀中；而在溫度為20℃，IPTG濃度為0.3、0.5和1.0 mmol/L時，特異性蛋白條帶在上清及沉淀中均有表達，但主要存在于上清中，而且在IPTG濃度為0.5 mmol/L時，上清中蛋白表達量相對較高。因此，優(yōu)化后的蛋白誘導條件為誘導溫度20℃，誘導劑（IPTG）濃度0.5 mmol/L。

圖3 GST-TERT蛋白的SDS-PAGE檢測Fig. 3 Detection of GST-TERT protein by SDS-PAGE

2.2.2 GST-AtTERT融合蛋白的純化及鑒定 為驗證SDS-PAGE中的特異性蛋白條帶是否為帶有GST標簽的目的蛋白，利用融合蛋白中的GST標簽對全菌液、上清、沉淀及純化后組分進行了Western blotting驗證，結(jié)果（圖4）顯示，在誘導全菌、上清及沉淀中均出現(xiàn)與預期蛋白相對分子量大小相符的條帶，為156 kD，與SDS-PADG分析結(jié)果一致。

圖4 Western blotting鑒定GST-AtTERT融合蛋白Fig. 4 Western blotting identification of GST-AtTERT fusion protein

2.3 轉(zhuǎn)AtTERT大腸桿菌對非生物脅迫的響應

2.3.1AtTERT抑制大腸桿菌的生長 為研究AtTERT對大腸桿菌生長特性的影響，測定空載對照菌（pET32a）和轉(zhuǎn)AtTERT重組菌在同等條件下的生長狀況，結(jié)果（圖5）顯示，兩種菌株均呈現(xiàn)“S”型生長趨勢，在生長4-10 h時，空載對照菌的生長速度總是顯著高于轉(zhuǎn)AtTERT重組菌；在生長10-12 h時，空載對照菌生長速度趨于平緩，而轉(zhuǎn)基因重組菌生長仍然相對較快，兩者菌濃度差距變小但空載對照菌的菌濃度仍然顯著高于轉(zhuǎn)基因重組菌，說明AtTERT抑制了大腸桿菌的生長。

圖5 AtTERT對大腸桿菌生長特性的影響Fig.5 Effect of AtTERT on the growth characteristics of E.coli

2.3.2 轉(zhuǎn)AtTERT大腸桿菌的鹽脅迫抗性增強 為研究轉(zhuǎn)AtTERT大腸桿菌對鹽脅迫抗性的影響，采用點板法對轉(zhuǎn)AtTERT重組菌和空載體對照菌進行了NaCl抗性檢測，結(jié)果表明，對照菌和重組菌在空白LB基本固體培養(yǎng)基（0 mmol/L NaCl）上生長良好且無顯著差異；但采用400和500 mmol/L NaCl處理時，轉(zhuǎn)AtTERT重組菌存活率顯著高于空載對照菌（圖6），說明轉(zhuǎn)AtTERT大腸桿菌的鹽脅迫抗性增強。

圖6 鹽脅迫下AtTERT對大腸桿菌存活率的影響Fig.6 Effect of AtTERT on the survival rate of E. coli under salt stress

2.3.3 轉(zhuǎn)AtTERT大腸桿菌甘露醇脅迫抗性增強 采用點板法對轉(zhuǎn)AtTERT重組菌和空載體對照菌進行了甘露醇脅迫處理，發(fā)現(xiàn)對照菌和重組菌在空白LB基本固體培養(yǎng)基上生長良好且無顯著差異；但經(jīng)400和600 mmol/L甘露醇處理時，轉(zhuǎn)AtTERT重組菌存活率明顯高于空載對照菌（圖7），故轉(zhuǎn)AtTERT大腸桿菌甘露醇脅迫抗性增強。

圖7 甘露醇脅迫下AtTERT對大腸桿菌存活率的影響Fig.7 Effect of AtTERT on the survival rate of E. coli under mannitol stress

2.3.4 轉(zhuǎn)AtTERT大腸桿菌低溫抗性減弱 為研究轉(zhuǎn)AtTERT對大腸桿菌低溫脅迫抗性的影響，采用點板法對轉(zhuǎn)AtTERT重組菌和空載體對照菌進行了液氮反復凍融處理，結(jié)果（圖8）表明，對照菌和重組菌在LB基本固體培養(yǎng)基上生長良好且無顯著差異；經(jīng)過液氮反復凍融5次時，兩者的存活率沒有顯著差異，但是液氮反復凍融6次時，轉(zhuǎn)AtTERT重組菌存活率顯著低于空載對照菌，說明轉(zhuǎn)AtTERT大腸桿菌低溫抗性減弱。

圖8 低溫脅迫下AtTERT對大腸桿菌存活率的影響Fig.8 Effect of AtTERT on the survival rate of E. coli under cold stress

2.3.5 轉(zhuǎn)AtTERT大腸桿菌H2O2耐受性增強 為研究轉(zhuǎn)AtTERT對大腸桿菌H2O2耐受性影響，采用點板技術法及在菌液中直接添加H2O2測定菌液OD600值2種方法（圖9）。點板法結(jié)果顯示，對照菌和重組菌在空白LB固體培養(yǎng)基上生長良好且無顯著差異；但是在含有H2O2的LB固體培養(yǎng)基上生長狀況顯著高于空載對照菌（圖9-B）。

圖9 H2O2脅迫下AtTERT對大腸桿菌存活率的影響Fig. 9 Effect of AtTERT on the survival rate of E. coli under hydrogen peroxide stress

3 討論

端粒酶是基本的核蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶，在真核細胞中負責端粒延長，把DNA復制損失的端粒填補起來，使端粒不會因細胞分裂而有所損耗，端粒酶在保持端粒穩(wěn)定、基因組完整、細胞長期的活性和潛在的繼續(xù)增殖能力等方面具有重要作用［3-5］。已有研究表明，端粒酶除具有端粒DNA的合成作用外，還具有非端粒功能［7］，生命活動的多種應激反應與TERT介導相關，如調(diào)節(jié)與細胞增殖和分化有關的基因表達［24］，改善DNA損傷修復［25-26］，增加細胞凋亡抗性［27］或減少凋亡信號傳導［28］等。在研究模式植物擬南芥AtTERT功能時發(fā)現(xiàn)，由AtTERT生物學功能網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)可推測，AtTERT和多種蛋白相互作用，這些蛋白中部分參與維持端粒長度，具有保護端粒末端結(jié)構(gòu)的作用，值得關注的是SMG7可能在植物防御中發(fā)揮作用，這表明擬南芥AtTERT如同動物等TERT，除具有合成端粒末端結(jié)構(gòu)生物學功能外，還可行使其非端粒的生物學功能［29-32］。

Fojtová等［33］研究重金屬鎘脅迫與DNA修復時發(fā)現(xiàn)，大部分DNA鏈斷裂在脫鎘48 h內(nèi)得到修復，端粒酶活性在恢復期增加了2.5倍，表明端粒酶可能與DNA修復有關，認為植物可能已經(jīng)建立了一套高效的DNA修復系統(tǒng)來應對短暫的環(huán)境脅迫。吳曉飛等［34］以胡楊（Populus euphratica）和合作楊（P.simonii×P. pyramibalis）懸浮細胞為材料，0和20 mmol/L H2O2處理提高胡楊細胞端粒酶活性，而合作楊端粒酶對H2O2不敏感，研究認為抗鹽性強胡楊細胞的端粒酶對抵御其細胞內(nèi)氧化損傷具有一定作用。張徐俞等［32］發(fā)現(xiàn)，采用500 mmol/L高濃度鹽脅迫時，初期端粒酶活性迅速增加，但隨后端粒酶活性下降；當高鹽處理后移除 NaCl 脅迫，端粒酶活性可增加1.4倍，且DNA穩(wěn)定性提高；同時孫麗春等［35］采用熒光定量PCR檢測到，高鹽、干旱、高熱及低溫脅迫均能導致沙冬青幼苗根和葉中AmTERT的表達量升高，表明植物細胞端粒酶可能和動物細胞一樣具有應激保護功能。王楊等［36］發(fā)現(xiàn)，采用濃度100 mmol/L NaCl處理模式植物擬南芥幼苗3 d時，其端粒酶活性升高，鹽處理時間延長端粒酶活性下降；同時AtTERT表達量也呈現(xiàn)先升高后降低的規(guī)律性變化，這些抗性結(jié)果說明，雖然不同物種對不同脅迫處理抗性程度表現(xiàn)不同，但在一定脅迫范圍內(nèi)，植物抗性應激反應與其端粒酶活性及TERT的表達量密切相關。

端粒酶的生物發(fā)生是一個高度調(diào)控的過程，解決了DNA的末端復制問題，但這些研究均是在真核生物背景下完成。Hansen等［23］為了揭示TERT的結(jié)構(gòu)和功能，進行了人類端粒酶在原核生物中的表達研究，在表達序列優(yōu)化的hTERT基因大腸桿菌細胞提取物中，檢測到端粒酶重復擴增（TRAP）陽性活性，尤其是終點TRAP顯示的表達水平是HeLa癌細胞的3倍，這些結(jié)果首次報道了來自細菌的TRAP活性，并為獨立于真核環(huán)境的組裝因子和抗癌治療的研究提供了一個簡便的系統(tǒng)。而植物TERT在大腸桿菌中的表達還未見報道，本研究將擬南芥AtTERT成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，構(gòu)建了pET32a-AtTERT原核表達載體，并優(yōu)化了AtTERT蛋白誘導條件，獲得了純化GST-AtTERT融合蛋白（156 kD）；同時檢測了轉(zhuǎn)AtTERT大腸桿菌的非生物脅迫抗性：轉(zhuǎn)AtTERT重組菌在NaCl（400 和500 mmol/L）、甘露醇（400和600 mmol/L）和H2O2（0.4 mmol/L）的LB固體培養(yǎng)基上的存活率顯著高于空載對照菌LB固體培養(yǎng)基上的存活率，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)AtTERT大腸桿菌NaCl鹽脅迫、甘露醇滲透脅迫、H2O2氧化脅迫抗性增強，表明擬南芥AtTERT具有提高大腸桿菌的鹽滲透脅迫抗性及氧化應激能力。Ahmed等［29］在細胞中過表達hTERT時發(fā)現(xiàn)，線粒體膜電位增加，線粒體超氧化物產(chǎn)生和細胞過氧化物水平降低及mtDNA受到保護，但TERT在大腸桿菌中如何參與非生物脅迫過程減少ROS的形成、保護DNA完整性、增強細胞凋亡抗性以及調(diào)控相關基因表達等還有待于進一步深入研究。

4 結(jié)論

優(yōu)化AtTERT蛋白誘導條件，獲得156 kD純化GST-AtTERT融合蛋白，轉(zhuǎn)AtTERT重組大腸桿菌獲得多種非生物脅迫抗性，表明擬南芥AtTERT具有抗非生物脅迫的非端粒功能。