夏暉,張芹,吳弘,季超,陳怡,原楚妍,孫星宇,鄭文杰*
(1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,天津 300387;2.天津師范大學(xué)天津市動植物抗性重點實驗室,天津 300387;3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,云南 昆明 650201)
三七[Panax notogingseng(Burk.)F.H.Chen],五加科植物,又名田三七、山漆、田七等,具有止血散瘀、降血糖等作用[1-5]。此前,依據(jù)我國原衛(wèi)生部《關(guān)于進(jìn)一步規(guī)范保健食品原料管理的通知》,三七屬于可用于保健食品的名單。近年來,三七飲片及其他制品越來越受消費者歡迎,一些不法商販在經(jīng)濟利益的驅(qū)使下,在制品中摻雜、摻假,這極大地?fù)p害消費者的利益和健康。目前對于三七尚且沒有現(xiàn)存的標(biāo)準(zhǔn)可用于向市場監(jiān)管提供依據(jù)[6]。市面上各種三七制品存在一定的實物與標(biāo)簽不符的現(xiàn)象,已報道的可作為三七摻假材料主要包括水田七、菊三七和姜黃等[7-8],因此建立三七真?zhèn)舞b定的方法和標(biāo)準(zhǔn)十分必要。目前關(guān)于三七及其制品摻假的檢測方法主要包括顯微鏡觀察法[9-12]、紅外光譜方法[13-14]、色譜分析法[14-19]和分子生物學(xué)方法[20-23]。根據(jù)已有的文獻(xiàn)報道,劉潤花等[18]、王晶等[19]成功使用薄層色譜、紫外光譜掃描等測定三七有效成分的含量評價三七產(chǎn)品;崔秀明等[24]建立三七及其偽品的指紋圖譜,以達(dá)到區(qū)分的目的。隨著近年三七的需求日益上升,開發(fā)快速高效的檢測方法具有重要意義。
本研究通過比對三七及多種近緣植物的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)序列,分析種內(nèi)保守、種間特異的序列,并以此設(shè)計特異性引物,旨在建立三七及其制品的快速聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)檢測方法,為三七及其制品的摻假檢測提供更多技術(shù)支撐。這種基于ITS序列作為DNA條形碼的鑒別方法操作簡便、靈敏度高,為有效監(jiān)控三七產(chǎn)品的質(zhì)量,進(jìn)行證偽鑒定提供一種可行方案。
三七樣品(采自云南石林西街口、大黑山、硯山彎沖、丘北小白山村、尋甸、戈的、壩子、大塘子);三七近緣物種(珠子參、人參、西洋參、竹節(jié)參);易混植物(姜黃、血三七、莪術(shù)、白芨、菊三七);三七花翠竹茶、三七花粉、姜黃三七膠囊、三七葉粉、三七片、三七根等13種食品保健品:市售。
磁珠法植物基因組提取試劑盒、天根DL2000 DNA Marker、DL500 DNA Marker、Emerald MAX HS PCR Master Mix:寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;Gold View:天津為科生物技術(shù)有限公司;PCR引物合成:生工生物工程(上海)股份有限公司。
磁珠法主要參照磁珠法植物基因組提取試劑盒(天根)提取,選擇GPS plus溶液;十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)法及十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)法參照文獻(xiàn)[25]。提取全基因組DNA后,使用核酸蛋白測定儀測定提取DNA濃度及純度[26]。
選擇三七ITS通用引物[27](正向引物:5'-AGAAGTCGTAACAAGGTTTC-3',反向引物:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')進(jìn)行PCR擴增。對不同地點的三七進(jìn)行擴增,經(jīng)Sanger測序后在GenBank中檢索比對,確認(rèn)測序結(jié)果后通過MEGA7進(jìn)行序列比對,找出不同地點三七堿基存在差異之處,即為種內(nèi)可變異位點。對三七等樣品進(jìn)行擴增,經(jīng)測序后在GenBank中檢索比對,確認(rèn)測序結(jié)果后通過MEGA7進(jìn)行同源性比對,找到特異位點經(jīng)Primer Express 5.0設(shè)計特異性引物。
通用引物擴增PCR條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性10 s,55℃退火30 s,72℃復(fù)性 60 s,共35個循環(huán);最后72℃延伸10 min。特異性引物擴增PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min;94℃變性10 s,59℃退火30 s,72℃復(fù)性10 s,共32個循環(huán);最后72℃延伸10 min。
取5 μL PCR擴增產(chǎn)物直接進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,將PCR擴增后的產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。
選取8個地區(qū)的三七以及三七的近緣種、易混種(珠子參、西洋參、人參、竹節(jié)參、菊三七、莪術(shù)、白芨、姜黃共8種)。CTAB法提取DNA后,以此為模版采用建立的PCR方法與三七進(jìn)行擴增,驗證該方法的特異性。
將三七及西洋參、人參、白芨的DNA稀釋至20 ng/μL,然后將三七DNA分別與西洋參、人參、白芨的DNA混合,制成含三七DNA 10%、1%、0.5%、0.1%、0.05%(體積分?jǐn)?shù))的混合DNA樣。以混合DNA樣為模版,采用建立的PCR方法進(jìn)行擴增,以確定不同樣品的檢出限。
以三七根、三七超細(xì)粉、三七壓片制品等13種各類別三七產(chǎn)品為樣品,提取核酸,應(yīng)用已建立的方法進(jìn)行檢測并采用植物源性樣品通用引物對其驗證。以18S rRNA基因的通用引物作為內(nèi)參進(jìn)行擴增(正向引物:5'-GATGCGCTCCTGTCCTTAAC-3',反向引物:5'-CATCCTTGGCAAATGCTTTC-3'),PCR 反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃復(fù)性30 s,共35個循環(huán),最后72℃延伸10 min。取5 μL PCR擴增產(chǎn)物直接進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。
本文采用CTAB法、改良SDS法、磁珠法3種不同的DNA提取方式處理三七根(鮮組織)、三七葉(鮮組織)、三七根(干粉)、血三七根(干粉)。將提取的DNA利用超微量分光光度計進(jìn)行測定,得到其濃度與純度數(shù)值見表1,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到不同樣品的DNA電泳圖見圖1。為了進(jìn)一步比較其提取質(zhì)量,本試驗以提取的DNA為模板,利用ITS通用引物進(jìn)行PCR反應(yīng),將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果見圖2。
圖1 3種提取方法所得樣品全基因組DNA的電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoretic results of genomic DNA obtained by three extraction methods
表1 3種方法提取的DNA濃度與純度結(jié)果Table 1 DNA concentration and purity results extracted by three methods
3種DNA提取方法在處理三七樣品中各有優(yōu)缺點。磁珠法方便簡單快速,三七鮮組織的提取效果較好。CTAB法耗時大約2 h~3 h,但產(chǎn)物帶有顏色,且會加深至褐色,推測為植物根部次生代謝產(chǎn)物如酚類等物質(zhì)未被除凈。電泳時,血三七根泳道出現(xiàn)深色陰影,為有色物質(zhì)條帶,該類物質(zhì)雖不影響PCR擴增反應(yīng),但不利于植物基因組的分析研究。SDS法則利用K+與SDS結(jié)合形成PDS吸附多糖蛋白,且提取過程中經(jīng)歷兩次沉淀,相比CTAB法,沉淀時顏色較淺,但基因組電泳未檢測到條帶。由圖2可知,這3種方法提取的DNA擴增后均能產(chǎn)生質(zhì)量較好的條帶。因此,針對不同樣品,比較這3種方法提取質(zhì)量,結(jié)果表明:新鮮組織提取效果均比較理想;干粉提取后直接電泳,檢測不到條帶,推測可能由于長時間保存導(dǎo)致DNA降解嚴(yán)重。在實際情況中,市場上的三七產(chǎn)品大多為粉末狀且保存時間較長,因此綜合PCR結(jié)果與DNA的提取質(zhì)量,初步認(rèn)為在三七的分子鑒定過程中CTAB法提取的DNA不僅擴增后條帶明亮,并且由于提取量大,得率較高比較適于研究使用。
圖2 利用通用引物擴增不同提取方法所得基因組DNA的電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoretic results of genomic DNA amplified by universal primers
為進(jìn)一步了解三七種內(nèi)的差異情況,利用通用引物對目前從8個點采集來的三七樣品進(jìn)行擴增,將得到的ITS序列送公司完成測序。針對結(jié)果進(jìn)行深入分析,發(fā)現(xiàn)不同樣品ITS的變異位點見表2。
表2 三七種內(nèi)ITS序列變異位點Table 2 ITS sequence variation sites in Panax notoginseng species
由表2可知,三七ITS序列種內(nèi)僅存在4個變異位點,適合進(jìn)行特異性引物的設(shè)計。對三七及其常見偽品的ITS區(qū)序列進(jìn)行比對分析,從而設(shè)計三七的特異性引物。利用CTAB方法提取了三七近緣及相似植物的基因組DNA。隨后以植物的基因組DNA為模板,利用ITS通用引物進(jìn)行擴增,得到結(jié)果后進(jìn)行序列分析。4種植物樣品經(jīng)CTAB法DNA濃度與純度結(jié)果見表3。CTAB方法在這幾種常見植物的DNA提取中表現(xiàn)出較高的效率。將4種植物(人參、西洋參、血三七、珠子參)以及三七的ITS序列進(jìn)行測序分析,見圖3。
表3 4種植物樣品經(jīng)CTAB法DNA濃度與純度結(jié)果Table 3 DNA concentration and purity results of 4 plant samples by CTAB method
圖3 ITS序列通用引物擴增序列比對Fig.3 Alignment of ITS sequence amplification results
利用序列間的差異,設(shè)計出三七的特異性引物(正向引物:5'-CGACATGAGAAGAGGGCTCTTA-3',反向引物:5'-ATCATTCCCTCGCGGGAGTC-3')。為進(jìn)一步提高特異性,在上游引物引入錯配位點。對引物進(jìn)行篩選,并對PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,建立三七的DNA檢測方法。
8個地區(qū)三七樣品特異性試驗結(jié)果見圖4,三七與8個陰性樣品特異性試驗結(jié)果見圖5。
圖4 8個地區(qū)三七樣品特異性試驗結(jié)果Fig.4 The specificity experimental results of Panax notoginseng from eight regions
為驗證引物對三七的特異性,將三七以及其近緣種、易混植物(珠子參、西洋參、人參、竹節(jié)參、姜黃、菊三七、莪術(shù)、白芨)的DNA作為模板,利用本研究設(shè)計的特異性引物進(jìn)行PCR擴增,三七具有特異性擴增條帶,大小在100 bp~150 bp之間,符合預(yù)期;由圖5可知,其余8種中藥均沒有條帶出現(xiàn)。因此,通過特異性試驗發(fā)現(xiàn),本試驗設(shè)計的引物針對三七及其近緣種、易混植物具有較好的特異性,可以用于三七的鑒定試驗。
圖5 三七與8個陰性樣品特異性試驗結(jié)果Fig.5 The specificity experimental results of Panax notoginseng and eight negative samples
8個不同采樣地三七特異性引物擴增結(jié)果序列比對見圖6。
圖6 8個不同采樣地三七特異性引物擴增結(jié)果序列比對Fig.6 Amplified sequence alignment of Panax notoginseng from eight different places
將三七PCR產(chǎn)物送測序公司測序,分析測序結(jié)果,發(fā)現(xiàn)擴增序列在種內(nèi)擴增穩(wěn)定,準(zhǔn)確度高,進(jìn)一步證明了該引物特異性強、準(zhǔn)確度高。
三七與西洋參、人參、白芨按照一定比例混合特異引物擴增,結(jié)果見圖7。
圖7 三七與西洋參、人參、白芨按照一定比例混合特異引物擴增結(jié)果Fig.7 Amplification results of Panax notoginseng mixed with Panax quinquefolium L.,Panax ginseng C.A.Meyer,Bletilla striata,in a certain proportion
將提取到的三七DNA樣品與西洋參、人參、白芨DNA樣品混合,制成一定比例梯度濃度的DNA樣品(濃度梯度為10%、1%、0.5%、0.1%、0.05%)。以不同濃度的三七混合品為模版,利用之前確定的特異性引物進(jìn)行擴增鑒別。結(jié)果表明,西洋參和白芨在0.5%的濃度下,擴增不出條帶,PCR結(jié)果呈現(xiàn)為陰性,而人參則在0.05%的濃度下條帶不明顯,空白對照無擴增。因此該結(jié)果說明,西洋參、白芨與三七的混合品DNA濃度均能達(dá)到0.5%檢出限水平,而人參與三七的混合品則可以達(dá)到0.05%的檢出限水平。本研究初步建立的基于ITS基因的三七PCR鑒別體系能夠穩(wěn)定、準(zhǔn)確地對三七及其偽品進(jìn)行分子水平的鑒別。
市售樣品18S rRNA通用引物擴增結(jié)果見圖8,市售樣品特異引物擴增結(jié)果見圖9。
圖8 市售樣品18S rRNA通用引物擴增結(jié)果Fig.8 Amplification of commercially available samples using 18S rRNA
圖9 市售樣品特異引物擴增結(jié)果Fig.9 Amplification of commercially available samples using specific primer
應(yīng)用本文所建立的PCR檢測方法對市售的13份樣品進(jìn)行三七源性成分檢測。提取市售三七樣品的DNA,以18S rRNA通用引物作為內(nèi)參進(jìn)行擴增,13種樣品均能擴增出特定條帶,說明DNA提取情況良好,以特異性引物繼續(xù)擴增試驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中10份樣品檢出三七源性成分。由此說明所建立的PCR方法能夠快速檢測市場三七源性成分的食品和保健品,未檢出的市售樣品可能存在質(zhì)量摻假問題。
本研究建立的檢測三七及其制品中三七源性成分的PCR方法特異性強,通過觀察多次試驗的數(shù)據(jù),證實該法重現(xiàn)性良好,靈敏度較高,可達(dá)到0.5%的檢測限,該方法的檢出限基本能夠滿足市場監(jiān)測的要求。試驗證明:基于三七ITS序列的PCR檢測是一種非常有效的鑒別和檢測三七的方法,為三七制品中三七源性成分檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)化提供科學(xué)依據(jù)。并且基于此方法還可以建立熒光定量PCR檢測方法以滿足更加豐富的檢測需求,可以達(dá)到更低的檢出限、并可定量分析三七制品的摻假比例。