夏暉，張芹，吳弘，季超，陳怡，原楚妍，孫星宇，鄭文杰*

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.天津師范大學(xué)天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201）

三七[Panax notogingseng（Burk.）F.H.Chen]，五加科植物，又名田三七、山漆、田七等，具有止血散瘀、降血糖等作用[1-5]。此前，依據(jù)我國原衛(wèi)生部《關(guān)于進(jìn)一步規(guī)范保健食品原料管理的通知》，三七屬于可用于保健食品的名單。近年來，三七飲片及其他制品越來越受消費者歡迎，一些不法商販在經(jīng)濟利益的驅(qū)使下，在制品中摻雜、摻假，這極大地?fù)p害消費者的利益和健康。目前對于三七尚且沒有現(xiàn)存的標(biāo)準(zhǔn)可用于向市場監(jiān)管提供依據(jù)[6]。市面上各種三七制品存在一定的實物與標(biāo)簽不符的現(xiàn)象，已報道的可作為三七摻假材料主要包括水田七、菊三七和姜黃等[7-8]，因此建立三七真?zhèn)舞b定的方法和標(biāo)準(zhǔn)十分必要。目前關(guān)于三七及其制品摻假的檢測方法主要包括顯微鏡觀察法[9-12]、紅外光譜方法[13-14]、色譜分析法[14-19]和分子生物學(xué)方法[20-23]。根據(jù)已有的文獻(xiàn)報道，劉潤花等[18]、王晶等[19]成功使用薄層色譜、紫外光譜掃描等測定三七有效成分的含量評價三七產(chǎn)品；崔秀明等[24]建立三七及其偽品的指紋圖譜，以達(dá)到區(qū)分的目的。隨著近年三七的需求日益上升，開發(fā)快速高效的檢測方法具有重要意義。

本研究通過比對三七及多種近緣植物的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列，分析種內(nèi)保守、種間特異的序列，并以此設(shè)計特異性引物，旨在建立三七及其制品的快速聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測方法，為三七及其制品的摻假檢測提供更多技術(shù)支撐。這種基于ITS序列作為DNA條形碼的鑒別方法操作簡便、靈敏度高，為有效監(jiān)控三七產(chǎn)品的質(zhì)量，進(jìn)行證偽鑒定提供一種可行方案。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

三七樣品（采自云南石林西街口、大黑山、硯山彎沖、丘北小白山村、尋甸、戈的、壩子、大塘子）；三七近緣物種（珠子參、人參、西洋參、竹節(jié)參）；易混植物（姜黃、血三七、莪術(shù)、白芨、菊三七）；三七花翠竹茶、三七花粉、姜黃三七膠囊、三七葉粉、三七片、三七根等13種食品保健品：市售。

磁珠法植物基因組提取試劑盒、天根DL2000 DNA Marker、DL500 DNA Marker、Emerald MAX HS PCR Master Mix：寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；Gold View：天津為科生物技術(shù)有限公司；PCR引物合成：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 DNA提取和檢測

磁珠法主要參照磁珠法植物基因組提取試劑盒（天根）提取，選擇GPS plus溶液；十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法及十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）法參照文獻(xiàn)[25]。提取全基因組DNA后，使用核酸蛋白測定儀測定提取DNA濃度及純度[26]。

1.3 引物設(shè)計和PCR擴增

選擇三七ITS通用引物[27]（正向引物：5'-AGAAGTCGTAACAAGGTTTC-3'，反向引物：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）進(jìn)行PCR擴增。對不同地點的三七進(jìn)行擴增，經(jīng)Sanger測序后在GenBank中檢索比對，確認(rèn)測序結(jié)果后通過MEGA7進(jìn)行序列比對，找出不同地點三七堿基存在差異之處，即為種內(nèi)可變異位點。對三七等樣品進(jìn)行擴增，經(jīng)測序后在GenBank中檢索比對，確認(rèn)測序結(jié)果后通過MEGA7進(jìn)行同源性比對，找到特異位點經(jīng)Primer Express 5.0設(shè)計特異性引物。

通用引物擴增PCR條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃復(fù)性 60 s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。特異性引物擴增PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性10 s，59℃退火30 s，72℃復(fù)性10 s，共32個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

取5 μL PCR擴增產(chǎn)物直接進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將PCR擴增后的產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1.4 特異性試驗

選取8個地區(qū)的三七以及三七的近緣種、易混種（珠子參、西洋參、人參、竹節(jié)參、菊三七、莪術(shù)、白芨、姜黃共8種）。CTAB法提取DNA后，以此為模版采用建立的PCR方法與三七進(jìn)行擴增，驗證該方法的特異性。

1.5 靈敏度試驗

將三七及西洋參、人參、白芨的DNA稀釋至20 ng/μL，然后將三七DNA分別與西洋參、人參、白芨的DNA混合，制成含三七DNA 10%、1%、0.5%、0.1%、0.05%（體積分?jǐn)?shù)）的混合DNA樣。以混合DNA樣為模版，采用建立的PCR方法進(jìn)行擴增，以確定不同樣品的檢出限。

1.6 市售樣品驗證

以三七根、三七超細(xì)粉、三七壓片制品等13種各類別三七產(chǎn)品為樣品，提取核酸，應(yīng)用已建立的方法進(jìn)行檢測并采用植物源性樣品通用引物對其驗證。以18S rRNA基因的通用引物作為內(nèi)參進(jìn)行擴增（正向引物：5'-GATGCGCTCCTGTCCTTAAC-3'，反向引物：5'-CATCCTTGGCAAATGCTTTC-3'），PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃復(fù)性30 s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。取5 μL PCR擴增產(chǎn)物直接進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取方法比較

本文采用CTAB法、改良SDS法、磁珠法3種不同的DNA提取方式處理三七根（鮮組織）、三七葉（鮮組織）、三七根（干粉）、血三七根（干粉）。將提取的DNA利用超微量分光光度計進(jìn)行測定，得到其濃度與純度數(shù)值見表1，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到不同樣品的DNA電泳圖見圖1。為了進(jìn)一步比較其提取質(zhì)量，本試驗以提取的DNA為模板，利用ITS通用引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2。

圖1 3種提取方法所得樣品全基因組DNA的電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoretic results of genomic DNA obtained by three extraction methods

表1 3種方法提取的DNA濃度與純度結(jié)果Table 1 DNA concentration and purity results extracted by three methods

3種DNA提取方法在處理三七樣品中各有優(yōu)缺點。磁珠法方便簡單快速，三七鮮組織的提取效果較好。CTAB法耗時大約2 h～3 h，但產(chǎn)物帶有顏色，且會加深至褐色，推測為植物根部次生代謝產(chǎn)物如酚類等物質(zhì)未被除凈。電泳時，血三七根泳道出現(xiàn)深色陰影，為有色物質(zhì)條帶，該類物質(zhì)雖不影響PCR擴增反應(yīng)，但不利于植物基因組的分析研究。SDS法則利用K+與SDS結(jié)合形成PDS吸附多糖蛋白，且提取過程中經(jīng)歷兩次沉淀，相比CTAB法，沉淀時顏色較淺，但基因組電泳未檢測到條帶。由圖2可知，這3種方法提取的DNA擴增后均能產(chǎn)生質(zhì)量較好的條帶。因此，針對不同樣品，比較這3種方法提取質(zhì)量，結(jié)果表明：新鮮組織提取效果均比較理想；干粉提取后直接電泳，檢測不到條帶，推測可能由于長時間保存導(dǎo)致DNA降解嚴(yán)重。在實際情況中，市場上的三七產(chǎn)品大多為粉末狀且保存時間較長，因此綜合PCR結(jié)果與DNA的提取質(zhì)量，初步認(rèn)為在三七的分子鑒定過程中CTAB法提取的DNA不僅擴增后條帶明亮，并且由于提取量大，得率較高比較適于研究使用。

圖2 利用通用引物擴增不同提取方法所得基因組DNA的電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoretic results of genomic DNA amplified by universal primers

2.2 三七特異性鑒別引物設(shè)計

為進(jìn)一步了解三七種內(nèi)的差異情況，利用通用引物對目前從8個點采集來的三七樣品進(jìn)行擴增，將得到的ITS序列送公司完成測序。針對結(jié)果進(jìn)行深入分析，發(fā)現(xiàn)不同樣品ITS的變異位點見表2。

表2 三七種內(nèi)ITS序列變異位點Table 2 ITS sequence variation sites in Panax notoginseng species

由表2可知，三七ITS序列種內(nèi)僅存在4個變異位點，適合進(jìn)行特異性引物的設(shè)計。對三七及其常見偽品的ITS區(qū)序列進(jìn)行比對分析，從而設(shè)計三七的特異性引物。利用CTAB方法提取了三七近緣及相似植物的基因組DNA。隨后以植物的基因組DNA為模板，利用ITS通用引物進(jìn)行擴增，得到結(jié)果后進(jìn)行序列分析。4種植物樣品經(jīng)CTAB法DNA濃度與純度結(jié)果見表3。CTAB方法在這幾種常見植物的DNA提取中表現(xiàn)出較高的效率。將4種植物（人參、西洋參、血三七、珠子參）以及三七的ITS序列進(jìn)行測序分析，見圖3。

表3 4種植物樣品經(jīng)CTAB法DNA濃度與純度結(jié)果Table 3 DNA concentration and purity results of 4 plant samples by CTAB method

圖3 ITS序列通用引物擴增序列比對Fig.3 Alignment of ITS sequence amplification results

利用序列間的差異，設(shè)計出三七的特異性引物（正向引物：5'-CGACATGAGAAGAGGGCTCTTA-3'，反向引物：5'-ATCATTCCCTCGCGGGAGTC-3'）。為進(jìn)一步提高特異性，在上游引物引入錯配位點。對引物進(jìn)行篩選，并對PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立三七的DNA檢測方法。

2.3 特異性試驗結(jié)果

8個地區(qū)三七樣品特異性試驗結(jié)果見圖4，三七與8個陰性樣品特異性試驗結(jié)果見圖5。

圖4 8個地區(qū)三七樣品特異性試驗結(jié)果Fig.4 The specificity experimental results of Panax notoginseng from eight regions

為驗證引物對三七的特異性，將三七以及其近緣種、易混植物（珠子參、西洋參、人參、竹節(jié)參、姜黃、菊三七、莪術(shù)、白芨）的DNA作為模板，利用本研究設(shè)計的特異性引物進(jìn)行PCR擴增，三七具有特異性擴增條帶，大小在100 bp～150 bp之間，符合預(yù)期；由圖5可知，其余8種中藥均沒有條帶出現(xiàn)。因此，通過特異性試驗發(fā)現(xiàn)，本試驗設(shè)計的引物針對三七及其近緣種、易混植物具有較好的特異性，可以用于三七的鑒定試驗。

圖5 三七與8個陰性樣品特異性試驗結(jié)果Fig.5 The specificity experimental results of Panax notoginseng and eight negative samples

8個不同采樣地三七特異性引物擴增結(jié)果序列比對見圖6。

圖6 8個不同采樣地三七特異性引物擴增結(jié)果序列比對Fig.6 Amplified sequence alignment of Panax notoginseng from eight different places

將三七PCR產(chǎn)物送測序公司測序，分析測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)擴增序列在種內(nèi)擴增穩(wěn)定，準(zhǔn)確度高，進(jìn)一步證明了該引物特異性強、準(zhǔn)確度高。

2.4 靈敏度試驗

三七與西洋參、人參、白芨按照一定比例混合特異引物擴增，結(jié)果見圖7。

圖7 三七與西洋參、人參、白芨按照一定比例混合特異引物擴增結(jié)果Fig.7 Amplification results of Panax notoginseng mixed with Panax quinquefolium L.，Panax ginseng C.A.Meyer，Bletilla striata，in a certain proportion

將提取到的三七DNA樣品與西洋參、人參、白芨DNA樣品混合，制成一定比例梯度濃度的DNA樣品（濃度梯度為10%、1%、0.5%、0.1%、0.05%）。以不同濃度的三七混合品為模版，利用之前確定的特異性引物進(jìn)行擴增鑒別。結(jié)果表明，西洋參和白芨在0.5%的濃度下，擴增不出條帶，PCR結(jié)果呈現(xiàn)為陰性，而人參則在0.05%的濃度下條帶不明顯，空白對照無擴增。因此該結(jié)果說明，西洋參、白芨與三七的混合品DNA濃度均能達(dá)到0.5%檢出限水平，而人參與三七的混合品則可以達(dá)到0.05%的檢出限水平。本研究初步建立的基于ITS基因的三七PCR鑒別體系能夠穩(wěn)定、準(zhǔn)確地對三七及其偽品進(jìn)行分子水平的鑒別。

2.5 市售樣品檢測

市售樣品18S rRNA通用引物擴增結(jié)果見圖8，市售樣品特異引物擴增結(jié)果見圖9。

圖8 市售樣品18S rRNA通用引物擴增結(jié)果Fig.8 Amplification of commercially available samples using 18S rRNA

圖9 市售樣品特異引物擴增結(jié)果Fig.9 Amplification of commercially available samples using specific primer

應(yīng)用本文所建立的PCR檢測方法對市售的13份樣品進(jìn)行三七源性成分檢測。提取市售三七樣品的DNA，以18S rRNA通用引物作為內(nèi)參進(jìn)行擴增，13種樣品均能擴增出特定條帶，說明DNA提取情況良好，以特異性引物繼續(xù)擴增試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中10份樣品檢出三七源性成分。由此說明所建立的PCR方法能夠快速檢測市場三七源性成分的食品和保健品，未檢出的市售樣品可能存在質(zhì)量摻假問題。

3 結(jié)論

本研究建立的檢測三七及其制品中三七源性成分的PCR方法特異性強，通過觀察多次試驗的數(shù)據(jù)，證實該法重現(xiàn)性良好，靈敏度較高，可達(dá)到0.5%的檢測限，該方法的檢出限基本能夠滿足市場監(jiān)測的要求。試驗證明：基于三七ITS序列的PCR檢測是一種非常有效的鑒別和檢測三七的方法，為三七制品中三七源性成分檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)化提供科學(xué)依據(jù)。并且基于此方法還可以建立熒光定量PCR檢測方法以滿足更加豐富的檢測需求，可以達(dá)到更低的檢出限、并可定量分析三七制品的摻假比例。