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        高效液相色譜法測定雞蛋中白藜蘆醇

        2022-03-10 12:56:52毋春楠吳鳳明蔡鋒隆范真真張宇強(qiáng)毛帥強(qiáng)于曉雪李留安
        食品研究與開發(fā) 2022年4期
        關(guān)鍵詞:白藜蘆醇乙腈液相

        毋春楠,吳鳳明,蔡鋒隆,范真真,張宇強(qiáng),毛帥強(qiáng),于曉雪*,李留安*

        (1.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300392;2.天津市廣源畜禽養(yǎng)殖有限公司,天津 301806)

        雞蛋是人們餐桌上的“常客”,為人體提供優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)和脂類等營養(yǎng)物質(zhì)。在蛋雞飼糧中添加一定濃度的生物活性物質(zhì),可增加其在雞蛋中的富集,生產(chǎn)出功能性雞蛋,如富硒雞蛋等。白藜蘆醇(resveratrol,res)是一種非黃酮類多酚物質(zhì),是植物在受到外界因素刺激時(shí)產(chǎn)生的一種抗毒素[1-2],廣泛存在于葡萄、虎杖、花生等植物和果實(shí)中[3]。白藜蘆醇具有抗菌、抗癌、抗炎、抗氧化及清除自由基等生物調(diào)節(jié)功能,具有較高的應(yīng)用價(jià)值。在蛋雞飼糧中添加白藜蘆醇,研發(fā)富白藜蘆醇雞蛋,具有較好的市場前景。研究表明,在蛋雞飼糧中添加白藜蘆醇可以改善哈氏單位和蛋白高度等蛋品質(zhì)指標(biāo),提高飼料轉(zhuǎn)化率,降低蛋黃丙二醇含量,延長雞蛋的保質(zhì)期[4]。然而,受測定動(dòng)物來源樣品中白藜蘆醇含量方法的限制,其在雞蛋中富集情況的研究,未見文獻(xiàn)報(bào)道。

        目前,檢測植物中白藜蘆醇的方法有熒光光度法、紫外分光光度法、氣相色譜法、高效液相色譜法等[5-8]。傳統(tǒng)的熒光光度法和紫外分光光度法操作簡單、成本低,但容易造成結(jié)果誤差大;氣相色譜法操作快速、損失小,但處理過程要求較高,樣品必須經(jīng)過衍生化。高效液相色譜法具有簡便、快速、重現(xiàn)性好、測定結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),并能夠同時(shí)測定多種多酚化合物[9]的含量。本試驗(yàn)擬采用高效液相色譜法,對(duì)蛋雞飼糧中添加白藜蘆醇后獲得的試驗(yàn)雞蛋樣品中白藜蘆醇含量進(jìn)行測定,以期建立一種操作簡便、快速的測定動(dòng)物樣品中白藜蘆醇含量的方法。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        1.1.1 試驗(yàn)樣品

        試驗(yàn)雞蛋樣品:金洼農(nóng)業(yè)科技發(fā)展(天津)有限公司蘆花雞養(yǎng)殖基地。隨機(jī)選取114只34周齡的健康蘆花雞,分為3組,每組38只,室內(nèi)平地放養(yǎng),自由采食和飲水。第一組為普通雞蛋組,飼喂基礎(chǔ)日糧,基礎(chǔ)飼糧組成見表1,第2組在基礎(chǔ)日糧中添加1.5 g/kg的白藜蘆醇(1.5 g/kg Res組),第3組在基礎(chǔ)日糧中添加3 g/kg的白藜蘆醇(3 g/kg Res組)。飼喂10 d后,從每組隨機(jī)采集20枚雞蛋,用于檢測雞蛋中白藜蘆醇的含量。

        表1 基礎(chǔ)飼糧組成Table 1 Composition of basal diet

        1.1.2 儀器與設(shè)備

        高效液相色譜儀(Agilent-1260):安捷倫科技公司;分析天平(FB223):上海舜寧恒平科學(xué)儀器有限公司;超聲波清洗器(KQ-500B):昆山市超聲儀器有限公司;多用途旋渦混合器(VORTEX-6):海門市其林貝爾儀器制造有限公司;醫(yī)用離心機(jī)(H1850R):湘儀離心機(jī)儀器有限公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱(DGX-9143 B-2):上海?,攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

        1.1.3 主要試劑

        白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%):索萊寶生物科技有限公司;白藜蘆醇原料(純度94%):陜西楊凌慈緣生物技術(shù)有限公司;甲醇(色譜純):默克股份兩合公司;純凈水:娃哈哈集團(tuán)有限公司;乙酸(冰醋酸):天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

        1.2 方法

        1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

        標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:取白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品5 mg,甲醇溶解,定容至100 mL棕色容量瓶中,制成濃度為0.05 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,4℃避光封閉保存。

        標(biāo)準(zhǔn)工作液:分別準(zhǔn)確吸取 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于5 mL棕色容量瓶中,用甲醇定容至刻度,該白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)系列濃度分別為 1、2、4、6、8、10 μg/mL,以上溶液均需現(xiàn)用現(xiàn)配。

        1.2.2 樣品前處理

        蛋黃樣品前處理:稱取1g蛋黃樣品于50mL棕色離心管中,加入10mL甲醇,用漩渦混合儀充分振蕩2min,超聲30 min后,5 000 r/min離心10 min,離心后取上清液過0.22 μm微孔濾膜,供高效液相色譜進(jìn)樣測定。

        蛋清樣品前處理方法同蛋黃。

        1.2.3 高效液相色譜條件的優(yōu)化

        色譜柱:C18(4.6mm×250mm,5μm);流動(dòng)相:乙酸+水(0.9 mL+750 mL)∶乙腈,不同流動(dòng)相比例(體積比)=65∶35 和 75∶25;不同流速:0.7 mL/min 和 1 mL/min;不同柱溫:20、25、30 ℃;波長:306 nm;進(jìn)樣量:10 μL。

        1.2.4 精密度測定

        按1.2.1方法配制濃度為4 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液,參照1.2.3高效液相色譜條件重復(fù)進(jìn)行6次試驗(yàn),記錄峰面積,確定精密度。

        1.2.5 回收率測定

        在同一個(gè)雞蛋樣品中,分別加入濃度為0.4、0.6、0.7μg/mL的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)工作液,充分混合,參照1.2.2樣品前處理及1.2.3確定的高效液相色譜條件,各進(jìn)行3次平行測定,測定回收率。

        1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

        將白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(0.05 mg/mL)稀釋為濃度 10、8、6、4、2、1 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液,參照 1.2.3 高效液相色譜條件進(jìn)行測定分析,橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品工作液濃度,縱坐標(biāo)為峰面積。

        1.2.7 試驗(yàn)雞蛋中白藜蘆醇含量測定

        試驗(yàn)雞蛋樣品測定參照1.2.2樣品前處理方法和1.2.3高效液相色譜條件進(jìn)行,樣品中白藜蘆醇的含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程進(jìn)行計(jì)算。

        1.3 數(shù)據(jù)處理

        采用SPSS 22.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,用單因子方差分析(one-way ANOVA analysis)Duncan’D檢驗(yàn)進(jìn)行均值間多重比較,并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),P<0.05為差異顯著,所有測定結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 色譜基本條件優(yōu)化

        色譜基本條件的優(yōu)化見表2。

        表2 色譜基本條件的優(yōu)化Table 2 Optimization of basic chromatographic conditions

        由表2可知,試驗(yàn)比較乙酸+水-乙腈流動(dòng)相體系的不同體積比例,結(jié)果表明,乙酸+水(0.9 mL+750 mL)∶乙腈=65∶35(體積比)時(shí),樣品分析時(shí)間短,且色譜圖分離良好;此外,通過考察流動(dòng)相體系的不同流速和柱溫,結(jié)果顯示當(dāng)流速為1 mL/min,柱溫為30℃時(shí),出峰時(shí)間提前至9.626 min,此時(shí)柱壓穩(wěn)定,目標(biāo)峰與周圍雜峰分離完全,更適用于進(jìn)行批量樣品檢測。本試驗(yàn)最終確定色譜條件:流動(dòng)相為乙酸+水(0.9 mL+750 mL)∶乙腈=65∶35(體積比)、流速 1 mL/min、柱溫 30℃。

        2.2 檢出限和定量限

        該方法的最低檢出限為0.013 4 μg/mL,定量限為0.044 6 μg/mL。

        2.3 精密度試驗(yàn)

        精密度試驗(yàn)結(jié)果見表3。

        表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Precision test results

        由表3可知,白藜蘆醇峰面積的RSD為0.4%,說明該方法精密度較高。

        2.4 回收率試驗(yàn)

        樣品加標(biāo)回收率見表4。

        由表4可知,白藜蘆醇的平均回收率為86.72%~99.41%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD范圍為0.50%~1.05%。

        表4 樣品加標(biāo)回收率Table 4 Recovery rate of samples with added standard

        2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

        根據(jù)1.2.1方法制備不同質(zhì)量濃度的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)工作液,參照1.2.3確定的高效液相色譜條件測定分析記錄峰面積,以其質(zhì)量濃度x(μg/mL)為橫坐標(biāo),峰面積y為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖1所示。

        圖1 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of resveratrol

        圖1結(jié)果表明:白藜蘆醇在線性范圍1 μg/mL~10 μg/mL內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品濃度與峰面積線性關(guān)系良好,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=72.777x,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7。

        2.6 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜圖

        標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜圖如圖2所示。

        圖2 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of standard and sample

        由圖2可知,白藜蘆醇色譜峰分離情況良好,出峰時(shí)間保留在9 min左右,普通雞蛋樣品中無目標(biāo)峰。

        2.7 試驗(yàn)雞蛋中白藜蘆醇含量測定

        按照1.2.2和1.2.3建立的方法對(duì)試驗(yàn)雞蛋中白藜蘆醇含量進(jìn)行測定,結(jié)果如圖3所示。

        圖3 高效液相色譜法檢測蛋黃中白藜蘆醇含量Fig.3 Determination of resveratrol in egg yolk by HPLC

        普通雞蛋組和各試驗(yàn)組蛋清中均未檢測出白藜蘆醇;普通雞蛋組蛋黃中未檢測出白藜蘆醇,1.5 g/kg Res組和3 g/kg Res組蛋黃中均檢測出白藜蘆醇,1.5 g/kg Res組含量為 0.083 μg/g,3 g/kg Res 組含量顯著高于1.5 g/kg Res組(P<0.05),含量為 0.371 μg/g。

        3 討論

        3.1 HPLC流動(dòng)相比例和流速對(duì)白藜蘆醇出峰的影響

        管錫建等[10]以乙腈-0.1%冰乙酸(20∶80)為流動(dòng)相,流速:1.6 mL/min,柱溫:25℃,測定葡萄酒中的白藜蘆醇,測定方法準(zhǔn)確、分析時(shí)間短,但流速較大,流動(dòng)相流速是影響保留時(shí)間的重要因素之一,當(dāng)流速過大時(shí),容易造成柱壓不穩(wěn)定,出峰時(shí)間提前,與雜峰分離不完全;俸靈林等[11]以乙腈-水(20∶80)為流動(dòng)相,流速:1 mL/min,柱溫:30℃,測定虎杖中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量,分離度好,操作簡便,但出峰時(shí)間在25 min左右,不適用于進(jìn)行批量樣品檢測;GB/T 24903—2010《糧油檢驗(yàn)花生中白藜蘆醇的測定》[12]以乙腈+水+乙酸(250 mL+750 mL+0.9 mL)為流動(dòng)相,流速0.7 mL/min,柱溫:室溫,對(duì)花生中的白藜蘆醇進(jìn)行測定,目標(biāo)物白藜蘆醇出峰時(shí)間早,與雜峰分離完全。本試驗(yàn)對(duì)流動(dòng)相比例、流速及柱溫進(jìn)行了優(yōu)化,確定了流動(dòng)相:乙酸+水(0.9 mL+750 mL)∶乙腈=65∶35(體積比)、流速:1 mL/min、柱溫:30℃的色譜條件,以該方法測定試驗(yàn)雞蛋中的白藜蘆醇,出峰時(shí)間早,峰型好,與雜峰分離完全。

        3.2 樣品中白藜蘆醇的含量測定

        目前國內(nèi)外關(guān)于白藜蘆醇含量測定的研究多集中于植物提取、醫(yī)藥護(hù)膚品等方面,對(duì)動(dòng)物產(chǎn)品中白藜蘆醇含量的測定研究未見報(bào)道。曹庸等[13]利用HPLC對(duì)虎杖中的白藜蘆醇含量進(jìn)行測定,結(jié)果表明虎杖鮮根莖中的白藜蘆醇含量最高,可達(dá)0.157%;向陽等[14]建立HPLC測定不同品種葡萄皮和葡萄籽中白藜蘆醇含量的方法,結(jié)果表明葡萄皮中的白藜蘆醇含量均高于葡萄籽,且同一產(chǎn)地不同品種葡萄中的白藜蘆醇含量也不相同,為保證結(jié)果準(zhǔn)確可靠,在樣品處理過程中應(yīng)避免白藜蘆醇成分的損耗和降解;史先敏等[15]等利用反向高效液相色譜法(reversed-phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)建立護(hù)膚品中白藜蘆醇含量的測定方法,采用甲醇作為提取試劑,處理成本低、測定方法簡便,可滿足化妝品中白藜蘆醇含量的檢測,便于產(chǎn)品的質(zhì)量控制。本試驗(yàn)通過在蛋雞基礎(chǔ)飼糧中添加1.5、3 g/kg的白藜蘆醇來獲得試驗(yàn)雞蛋樣品,結(jié)合白藜蘆醇易溶于有機(jī)溶劑的特性,采用甲醇對(duì)試驗(yàn)雞蛋進(jìn)行預(yù)處理,并優(yōu)化建立HPLC檢測試驗(yàn)雞蛋中白藜蘆醇含量的方法,操作簡單、重現(xiàn)性好,為白藜蘆醇在動(dòng)物源性食品中富集的含量測定提供方法參考。

        4 結(jié)論

        本試驗(yàn)優(yōu)化建立了一種高效液相色譜法測定雞蛋中白藜蘆醇的分析方法,在色譜條件為流動(dòng)相:乙酸+水(0.9 mL+750 mL)∶乙腈=65∶35(體積比)、流速:1 mL/min、柱溫:30℃時(shí),可在飼糧添加白藜蘆醇獲得的試驗(yàn)雞蛋蛋黃中檢測出白藜蘆醇。該方法操作簡單、目標(biāo)物白藜蘆醇出峰時(shí)間早,與雜峰分離完全,重現(xiàn)性良好。

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