毋春楠，吳鳳明，蔡鋒隆，范真真，張宇強(qiáng)，毛帥強(qiáng)，于曉雪*，李留安*

（1.天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300392；2.天津市廣源畜禽養(yǎng)殖有限公司，天津 301806）

雞蛋是人們餐桌上的“常客”，為人體提供優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)和脂類等營養(yǎng)物質(zhì)。在蛋雞飼糧中添加一定濃度的生物活性物質(zhì)，可增加其在雞蛋中的富集，生產(chǎn)出功能性雞蛋，如富硒雞蛋等。白藜蘆醇（resveratrol，res）是一種非黃酮類多酚物質(zhì)，是植物在受到外界因素刺激時產(chǎn)生的一種抗毒素[1-2]，廣泛存在于葡萄、虎杖、花生等植物和果實中[3]。白藜蘆醇具有抗菌、抗癌、抗炎、抗氧化及清除自由基等生物調(diào)節(jié)功能，具有較高的應(yīng)用價值。在蛋雞飼糧中添加白藜蘆醇，研發(fā)富白藜蘆醇雞蛋，具有較好的市場前景。研究表明，在蛋雞飼糧中添加白藜蘆醇可以改善哈氏單位和蛋白高度等蛋品質(zhì)指標(biāo)，提高飼料轉(zhuǎn)化率，降低蛋黃丙二醇含量，延長雞蛋的保質(zhì)期[4]。然而，受測定動物來源樣品中白藜蘆醇含量方法的限制，其在雞蛋中富集情況的研究，未見文獻(xiàn)報道。

目前，檢測植物中白藜蘆醇的方法有熒光光度法、紫外分光光度法、氣相色譜法、高效液相色譜法等[5-8]。傳統(tǒng)的熒光光度法和紫外分光光度法操作簡單、成本低，但容易造成結(jié)果誤差大；氣相色譜法操作快速、損失小，但處理過程要求較高，樣品必須經(jīng)過衍生化。高效液相色譜法具有簡便、快速、重現(xiàn)性好、測定結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點，并能夠同時測定多種多酚化合物[9]的含量。本試驗擬采用高效液相色譜法，對蛋雞飼糧中添加白藜蘆醇后獲得的試驗雞蛋樣品中白藜蘆醇含量進(jìn)行測定，以期建立一種操作簡便、快速的測定動物樣品中白藜蘆醇含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗樣品

試驗雞蛋樣品：金洼農(nóng)業(yè)科技發(fā)展（天津）有限公司蘆花雞養(yǎng)殖基地。隨機(jī)選取114只34周齡的健康蘆花雞，分為3組，每組38只，室內(nèi)平地放養(yǎng)，自由采食和飲水。第一組為普通雞蛋組，飼喂基礎(chǔ)日糧，基礎(chǔ)飼糧組成見表1，第2組在基礎(chǔ)日糧中添加1.5 g/kg的白藜蘆醇（1.5 g/kg Res組），第3組在基礎(chǔ)日糧中添加3 g/kg的白藜蘆醇（3 g/kg Res組）。飼喂10 d后，從每組隨機(jī)采集20枚雞蛋，用于檢測雞蛋中白藜蘆醇的含量。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成Table 1 Composition of basal diet

1.1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（Agilent-1260）：安捷倫科技公司；分析天平（FB223）：上海舜寧恒平科學(xué)儀器有限公司；超聲波清洗器（KQ-500B）：昆山市超聲儀器有限公司；多用途旋渦混合器（VORTEX-6）：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；醫(yī)用離心機(jī)（H1850R）：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（DGX-9143 B-2）：上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司。

1.1.3 主要試劑

白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：索萊寶生物科技有限公司；白藜蘆醇原料（純度94%）：陜西楊凌慈緣生物技術(shù)有限公司；甲醇（色譜純）：默克股份兩合公司；純凈水：娃哈哈集團(tuán)有限公司；乙酸（冰醋酸）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：取白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，甲醇溶解，定容至100 mL棕色容量瓶中，制成濃度為0.05 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，4℃避光封閉保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別準(zhǔn)確吸取 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液于5 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，該白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)系列濃度分別為 1、2、4、6、8、10 μg/mL，以上溶液均需現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品前處理

蛋黃樣品前處理：稱取1g蛋黃樣品于50mL棕色離心管中，加入10mL甲醇，用漩渦混合儀充分振蕩2min，超聲30 min后，5 000 r/min離心10 min，離心后取上清液過0.22 μm微孔濾膜，供高效液相色譜進(jìn)樣測定。

蛋清樣品前處理方法同蛋黃。

1.2.3 高效液相色譜條件的優(yōu)化

色譜柱：C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：乙酸+水（0.9 mL+750 mL）∶乙腈，不同流動相比例（體積比）=65∶35 和 75∶25；不同流速：0.7 mL/min 和 1 mL/min；不同柱溫：20、25、30 ℃；波長：306 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.4 精密度測定

按1.2.1方法配制濃度為4 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，參照1.2.3高效液相色譜條件重復(fù)進(jìn)行6次試驗，記錄峰面積，確定精密度。

1.2.5 回收率測定

在同一個雞蛋樣品中，分別加入濃度為0.4、0.6、0.7μg/mL的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)工作液，充分混合，參照1.2.2樣品前處理及1.2.3確定的高效液相色譜條件，各進(jìn)行3次平行測定，測定回收率。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（0.05 mg/mL）稀釋為濃度 10、8、6、4、2、1 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液，參照 1.2.3 高效液相色譜條件進(jìn)行測定分析，橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品工作液濃度，縱坐標(biāo)為峰面積。

1.2.7 試驗雞蛋中白藜蘆醇含量測定

試驗雞蛋樣品測定參照1.2.2樣品前處理方法和1.2.3高效液相色譜條件進(jìn)行，樣品中白藜蘆醇的含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程進(jìn)行計算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，用單因子方差分析（one-way ANOVA analysis）Duncan’D檢驗進(jìn)行均值間多重比較，并進(jìn)行顯著性檢驗，P＜0.05為差異顯著，所有測定結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜基本條件優(yōu)化

色譜基本條件的優(yōu)化見表2。

表2 色譜基本條件的優(yōu)化Table 2 Optimization of basic chromatographic conditions

由表2可知，試驗比較乙酸+水-乙腈流動相體系的不同體積比例，結(jié)果表明，乙酸+水（0.9 mL+750 mL）∶乙腈=65∶35（體積比）時，樣品分析時間短，且色譜圖分離良好；此外，通過考察流動相體系的不同流速和柱溫，結(jié)果顯示當(dāng)流速為1 mL/min，柱溫為30℃時，出峰時間提前至9.626 min，此時柱壓穩(wěn)定，目標(biāo)峰與周圍雜峰分離完全，更適用于進(jìn)行批量樣品檢測。本試驗最終確定色譜條件：流動相為乙酸+水（0.9 mL+750 mL）∶乙腈=65∶35（體積比）、流速 1 mL/min、柱溫 30℃。

2.2 檢出限和定量限

該方法的最低檢出限為0.013 4 μg/mL，定量限為0.044 6 μg/mL。

2.3 精密度試驗

精密度試驗結(jié)果見表3。

表3 精密度試驗結(jié)果Table 3 Precision test results

由表3可知，白藜蘆醇峰面積的RSD為0.4%，說明該方法精密度較高。

2.4 回收率試驗

樣品加標(biāo)回收率見表4。

由表4可知，白藜蘆醇的平均回收率為86.72%～99.41%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD范圍為0.50%～1.05%。

表4 樣品加標(biāo)回收率Table 4 Recovery rate of samples with added standard

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

根據(jù)1.2.1方法制備不同質(zhì)量濃度的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)工作液，參照1.2.3確定的高效液相色譜條件測定分析記錄峰面積，以其質(zhì)量濃度x（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

圖1 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of resveratrol

圖1結(jié)果表明：白藜蘆醇在線性范圍1 μg/mL～10 μg/mL內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品濃度與峰面積線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=72.777x，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜圖

標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜圖如圖2所示。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of standard and sample

由圖2可知，白藜蘆醇色譜峰分離情況良好，出峰時間保留在9 min左右，普通雞蛋樣品中無目標(biāo)峰。

2.7 試驗雞蛋中白藜蘆醇含量測定

按照1.2.2和1.2.3建立的方法對試驗雞蛋中白藜蘆醇含量進(jìn)行測定，結(jié)果如圖3所示。

圖3 高效液相色譜法檢測蛋黃中白藜蘆醇含量Fig.3 Determination of resveratrol in egg yolk by HPLC

普通雞蛋組和各試驗組蛋清中均未檢測出白藜蘆醇；普通雞蛋組蛋黃中未檢測出白藜蘆醇，1.5 g/kg Res組和3 g/kg Res組蛋黃中均檢測出白藜蘆醇，1.5 g/kg Res組含量為 0.083 μg/g，3 g/kg Res 組含量顯著高于1.5 g/kg Res組（P＜0.05），含量為 0.371 μg/g。

3 討論

3.1 HPLC流動相比例和流速對白藜蘆醇出峰的影響

管錫建等[10]以乙腈-0.1%冰乙酸（20∶80）為流動相，流速：1.6 mL/min，柱溫：25℃，測定葡萄酒中的白藜蘆醇，測定方法準(zhǔn)確、分析時間短，但流速較大，流動相流速是影響保留時間的重要因素之一，當(dāng)流速過大時，容易造成柱壓不穩(wěn)定，出峰時間提前，與雜峰分離不完全；俸靈林等[11]以乙腈-水（20∶80）為流動相，流速：1 mL/min，柱溫：30℃，測定虎杖中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量，分離度好，操作簡便，但出峰時間在25 min左右，不適用于進(jìn)行批量樣品檢測；GB/T 24903—2010《糧油檢驗花生中白藜蘆醇的測定》[12]以乙腈+水+乙酸（250 mL+750 mL+0.9 mL）為流動相，流速0.7 mL/min，柱溫：室溫，對花生中的白藜蘆醇進(jìn)行測定，目標(biāo)物白藜蘆醇出峰時間早，與雜峰分離完全。本試驗對流動相比例、流速及柱溫進(jìn)行了優(yōu)化，確定了流動相：乙酸+水（0.9 mL+750 mL）∶乙腈=65∶35（體積比）、流速：1 mL/min、柱溫：30℃的色譜條件，以該方法測定試驗雞蛋中的白藜蘆醇，出峰時間早，峰型好，與雜峰分離完全。

3.2 樣品中白藜蘆醇的含量測定

目前國內(nèi)外關(guān)于白藜蘆醇含量測定的研究多集中于植物提取、醫(yī)藥護(hù)膚品等方面，對動物產(chǎn)品中白藜蘆醇含量的測定研究未見報道。曹庸等[13]利用HPLC對虎杖中的白藜蘆醇含量進(jìn)行測定，結(jié)果表明虎杖鮮根莖中的白藜蘆醇含量最高，可達(dá)0.157%；向陽等[14]建立HPLC測定不同品種葡萄皮和葡萄籽中白藜蘆醇含量的方法，結(jié)果表明葡萄皮中的白藜蘆醇含量均高于葡萄籽，且同一產(chǎn)地不同品種葡萄中的白藜蘆醇含量也不相同，為保證結(jié)果準(zhǔn)確可靠，在樣品處理過程中應(yīng)避免白藜蘆醇成分的損耗和降解；史先敏等[15]等利用反向高效液相色譜法（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）建立護(hù)膚品中白藜蘆醇含量的測定方法，采用甲醇作為提取試劑，處理成本低、測定方法簡便，可滿足化妝品中白藜蘆醇含量的檢測，便于產(chǎn)品的質(zhì)量控制。本試驗通過在蛋雞基礎(chǔ)飼糧中添加1.5、3 g/kg的白藜蘆醇來獲得試驗雞蛋樣品，結(jié)合白藜蘆醇易溶于有機(jī)溶劑的特性，采用甲醇對試驗雞蛋進(jìn)行預(yù)處理，并優(yōu)化建立HPLC檢測試驗雞蛋中白藜蘆醇含量的方法，操作簡單、重現(xiàn)性好，為白藜蘆醇在動物源性食品中富集的含量測定提供方法參考。

4 結(jié)論

本試驗優(yōu)化建立了一種高效液相色譜法測定雞蛋中白藜蘆醇的分析方法，在色譜條件為流動相：乙酸+水（0.9 mL+750 mL）∶乙腈=65∶35（體積比）、流速：1 mL/min、柱溫：30℃時，可在飼糧添加白藜蘆醇獲得的試驗雞蛋蛋黃中檢測出白藜蘆醇。該方法操作簡單、目標(biāo)物白藜蘆醇出峰時間早，與雜峰分離完全，重現(xiàn)性良好。