陳林林，楊茜瑤，范天驕，張佳欣，鄭鳳鳴，辛嘉英，2

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150028；2.中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所羰基合成與選擇氧化國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730000）

抗壞血酸（ascorbic acid，AA），即維生素C是人體必需的營養(yǎng)素之一，具有強(qiáng)還原性、酸性[1]及鈍化金屬離子的作用，在食品中可作為抗氧化劑、營養(yǎng)強(qiáng)化劑和防腐劑的酸度調(diào)節(jié)劑。在果蔬制品中，抗壞血酸可防止食品發(fā)生褪色和變色[2]，并可作為風(fēng)味穩(wěn)定劑，抑制風(fēng)味劣變。因此抗壞血酸含量的高低是果蔬及其制品的重要質(zhì)量指標(biāo)。目前，抗壞血酸的測定方法主要有熒光光度分析法、2，6-二氯靛酚鈉鹽滴定法、2，4-二硝基苯肼比較法、高效液相色譜法、超高液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、電化學(xué)法、光譜法、動力學(xué)光度法、熒光法等[3-10]。Zhao等[11]制備了一種新型的羥基磷灰石/還原氧化石墨烯/納米金（hydroxyapatite/reduced grapheneoxide/Au nanoparticles，HAP/rGO/AuNPs） 修飾電極用于抗壞血酸的電化學(xué)檢測。此電極的最低檢出限為3.39 μmol/L。黃彬銅等[12]采用等離子體增強(qiáng)化學(xué)氣相沉積法將碳納米管（carbon nanotubes，CNTs）連接在3D石墨烯泡沫（graphene foam，GF）上，繼而在其表面恒電位上沉積納米金顆粒（Au nanoparticles，AuNPs），構(gòu)成了一種新型的GF/CNTs/AuNPs電極，該電極對多巴胺、尿酸、抗壞血酸等物質(zhì)具有良好的電催化性能。食品中抗壞血酸的檢測研究趨向于簡單、快速、成本低的發(fā)展方向。因此，具有操作簡單、分析快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點的電化學(xué)檢測在抗壞血酸領(lǐng)域日益受到關(guān)注。

本研究將具有比表面積大、吸附性好、表面活性高等特點的AuNPs與由甲烷氧化菌發(fā)酵制得的甲烷氧化菌素（methanobactin，Mb）結(jié)合[13]。利用 Mb 原位還原介導(dǎo)一步合成原位還原Mb/AuNPs，并采用電沉積法成功制備Mb/AuNPs修飾電極。通過循環(huán)伏安法對影響AA在此電極上的電化學(xué)行為因素進(jìn)行考察，建立AA與循壞伏安法（cyclic voltammetry，CV）圖譜中氧化峰電流之間的線性關(guān)系，評價方法的可靠性，實現(xiàn)對果蔬中AA含量的測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲烷氧化菌素：哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院發(fā)酵與生物催化實驗室自制。檸檬果汁、橙汁、干制香菇、山楂罐頭、腌制榨菜：市售；抗壞血酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；氯金酸：阿拉丁試劑（上海）有限公司；檸檬酸鈉：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。試驗所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電化學(xué)工作站（CHI660E）：上海辰華大陸化學(xué)試劑廠；恒溫培養(yǎng)振蕩器（HNY-100B）：天津市歐諾儀器儀表有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R-20）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；紫外-可見分光光度計（UV-2550）：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

將橙汁過濾，濾液稀釋10倍，取稀釋后的濾液備用；將干制香菇研磨成粉末，取10 g放入100 mL容量瓶中，用磷酸鹽（磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉）緩沖溶液（phosphate buffer solution，PBS）（pH7） 定容到刻度，顛倒混勻，避光靜置30 min后過濾，取濾液備用；將山楂罐頭用榨汁機(jī)攪碎，移入離心管中，8 500 r/min離心分離5 min，取上清液備用；將腌制榨菜搗碎混勻，精確稱取10 g置于50 mL容量瓶中，用PBS（pH7）定容，搖勻，超聲20 min后，4 000 r/min離心10 min，取上清液備用。

1.3.2 Mb/AuNPs的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[14]進(jìn)行Mb的制備和分離純化，取分離純化后濃度為0.020 mmol/L的Mb 1 mL與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的氯金酸3 mL溶液混合，在50℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)2 h，制備Mb介導(dǎo)一步合成的Mb/AuNPs納米粒子并通過紫外光譜和紅外光譜進(jìn)行分析。

1.3.3 裸金電極的預(yù)處理

取一個金電極，在制備好的食人魚溶液（70%濃硫酸與30%過氧化氫混合制成）中浸泡5 min取出，用去離子水沖洗幾次，去除表面的食人魚溶液。金電極（φ=3 mm）分別用粒徑為0.25 μm和0.05 μm的氧化鋁懸浮液拋光成鏡面，然后用甲醇和水超聲清洗30 s，從而得到預(yù)處理好的裸金電極。

1.3.4 Mb/AuNPs修飾電極的制備

將預(yù)處理好的裸金電極置于Mb/AuNPs溶液中，采用三電極體系，其中工作電極采用金電極，Ag/AgCl為參比電極，鉑電極為輔助電極。在0～1.0 V電位范圍內(nèi)，以0.1 V/s的掃描速度，循環(huán)伏安掃描圈30圈，即得到Mb/AuNPs修飾電極。

1.3.5 Mb/AuNPs修飾電極檢測抗壞血酸條件的優(yōu)化

將2mL0.01mol/L的抗壞血酸溶液與2mL0.1mol/L的PBS混合，以此溶液作為檢測抗壞血酸的電化學(xué)測定溶液，利用循環(huán)伏安法（電位E為橫坐標(biāo)，峰電流I為縱坐標(biāo)）分析抗壞血酸在該電極的電化學(xué)行為，并考察電沉積圈數(shù)、緩沖溶液種類、體系pH值、緩沖溶液濃度和掃描速度對測定AA的影響。

1.3.5.1 電沉積掃描圈數(shù)的影響

改變電沉積掃描圈數(shù)（n）分別為 10、20、30、40、50，制備出不同的Mb/AuNPs修飾電極，考察不同修飾程度的電極對抗壞血酸體系檢測的影響，以確定最優(yōu)的電沉積掃描圈數(shù)。

1.3.5.2 緩沖溶液種類的影響

在電沉積掃描圈數(shù)為30圈時制備Mb/AuNPs修飾電極，改變緩沖溶液種類分別為PBS、醋酸-醋酸銨緩沖溶液（acetate buffer solution，ABS）、檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖溶液（citrate buffer solution，CBS）。在緩沖溶液濃度為0.1 mol/L、pH7.0的條件下，考察不同緩沖溶液種類對修飾電極測定AA的影響。

1.3.5.3 體系pH值的影響

在電沉積掃描圈數(shù)為30時制備Mb/AuNPs修飾電極，使用PBS作為緩沖溶液，考察緩沖溶液pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 時對修飾電極測定 AA 的影響。

1.3.5.4 緩沖溶液濃度的影響

在電沉積掃描圈數(shù)為30時制備Mb/AuNPs修飾電極，使用pH7.0的PBS作為緩沖溶液，考察PBS濃度分別為 0、0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 mol/L 時對AA 測定的影響。

1.3.5.5 掃描速度的影響

在電沉積掃描圈數(shù)為30時制備Mb/AuNPs修飾電極，使用pH7.0、濃度為0.10 mol/L的PBS作為緩沖溶液，考察循環(huán)伏安法掃描速度分別為10、30、50、70、90、100、110、130、150、200 mV/s時對修飾電極測定 AA的影響。

1.3.6 抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

在電沉積掃描圈數(shù)為30時制備Mb/AuNPs修飾電極，使用pH7.0、濃度為0.10 mol/L的PBS作為緩沖液，循環(huán)伏安法掃描速度為50 mV/s，改變抗壞血酸濃度分別為 0.001、0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030 mol/L，考察Mb/AuNPs電極對不同濃度AA的響應(yīng)性能，根據(jù)AA濃度與氧化峰電流的關(guān)系，繪制得到以AA濃度（CAA）為橫坐標(biāo)，峰電流（I）為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取逐級稀釋的抗壞血酸濃度進(jìn)行檢測，以信噪比為3確定檢出限，以信噪比為10確定定量限[15]。使用同一根Mb/AuNPs電極測定抗壞血酸樣品溶液，重復(fù)測定10次，記錄峰電流相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），考察 Mb/AuNPs修飾電極對抗壞血酸檢測方法的精密度和穩(wěn)定性。

截至2018年半年末，G-SIBs平均資本充足率達(dá)到16.32%，較上年末下降0.15個百分點，剔除新興市場國家G-SIBs(我國四大行)后平均水平為17.19%，較上年末下降0.24個百分點，30家G-SIBs有9家資本充足率較上年上升。我國G-SIBs平均資本充足率14.74%，較G-SIBs平均水平低1.58個百分點，差距較上年有所縮小( 2017年末相差1.8個百分點)，建行和農(nóng)行排名分別上升2位和5位，工行和中行排名分別下滑3位和1位

1.3.7 實際樣品加標(biāo)回收率的測定

分別取10 mL檸檬果汁、橙汁、干制香菇、山楂罐頭和腌制榨菜的濾液，加入到優(yōu)化體系中，在1、5 mg/L和10 mg/L的加標(biāo)量條件下，對AA進(jìn)行加標(biāo)回收率[16]的測定，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對各樣品中的AA含量進(jìn)行測定并計算其回收率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復(fù)3次，不同組的數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0軟件采用Duncan's新復(fù)極差檢驗法進(jìn)行顯著性差異分析，顯著性水平P＜0.05。使用Origin軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Mb/AuNPs的表征

2.1.1 AuNPs紫外光譜掃描

金納米粒子紫外光譜掃描見圖1。

圖1 金納米粒子紫外光譜掃描Fig.1 Gold nanoparticle UV spectrum scanning

由圖1可知，3種修飾物在波長為500 nm～600 nm時出現(xiàn)吸收峰。檸檬酸鈉還原AuNPs、檸檬酸鈉還原AuNPs+Mb、原位還原Mb/AuNPs吸收峰分別在529、530、570 nm處。檸檬酸鈉還原AuNPs最大的吸收峰出現(xiàn)在529 nm處，Mb/AuNPs原位還原后，吸收峰紅移至570nm處，且發(fā)生形變。根據(jù)文獻(xiàn)[13]，以納米金粒子吸光值（surface plasmon resonance，SPR）和 450 nm 處吸光值計算AuNPs粒徑。得出所制備的檸檬酸鈉還原AuNPs、檸檬酸鈉還原Mb/AuNPs、原位還原Mb/AuNPs粒徑分別為 9.4、15.6、25.1 nm，d原位還原Mb/AuNPs＞d檸檬酸鈉還原AuNPs+Mb＞d檸檬酸鈉還原AuNPs。試驗結(jié)果表明，原位還原的 Mb/AuNPs有顯著的吸光效果，且形成的納米粒子不易聚集、性質(zhì)穩(wěn)定。

2.1.2 Mb/AuNPs紅外光譜掃描

Mb、Mb/AuNPs的紅外光譜圖見圖2。

圖2 Mb、Mb/AuNPs的紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectra of Mb and Mb/AuNPs

由圖2可知，Mb和Mb/AuNPs的紅外光譜曲線不同，結(jié)合了納米金的Mb光譜圖有明顯的透光率峰譜帶變化，紅外光譜中觀察到3 400 cm-1處對應(yīng)的O-H的伸縮振動增強(qiáng)，這是因為Mb與AuNPs結(jié)合后極性羥基暴露在納米粒子表面所致；Mb/AuNPs紅外光譜圖中發(fā)現(xiàn)1 020 cm-1處的伸縮振動峰消失，這是因為Au-S鍵的形成；539cm-1處出現(xiàn)二硫鍵的伸縮振動峰也代表了Au-S鍵的形成，由此可知，原位還原Mb/AuNPs納米粒子已形成。

2.2 抗壞血酸在修飾電極上的電化學(xué)行為

有無抗壞血酸的循環(huán)伏安圖譜見圖3。

圖3 修飾電極在有無抗壞血酸溶液體系中的電化學(xué)響應(yīng)Fig.3 Electrochemical response of modified electrode in the system with or without ascorbic acid solution

由圖3可知，在加2 mL 0.01 mol/L AA溶液與未加AA溶液的反應(yīng)體系中的循環(huán)伏安曲線有著明顯區(qū)別（P＜0.05），可以觀察到加入AA的曲線存在一個單一的顯著氧化峰，這表示AA不可逆的氧化反應(yīng)。加入AA后氧化峰電流由1.401×10-6A增加到1.173×10-5A。試驗結(jié)果與Ji等[17]研究AA測定所得的結(jié)果相似，結(jié)果表明Mb/AuNPs修飾電極在體系中對AA有明顯的響應(yīng)信號。可進(jìn)一步優(yōu)化檢測體系條件。

2.2.1 掃描圈數(shù)對抗壞血酸電化學(xué)行為的影響

不同掃描圈數(shù)對抗壞血酸電化學(xué)行為的影響見圖4。

圖4 不同掃描圈數(shù)對抗壞血酸電化學(xué)行為的影響Fig.4 Influence of different scanning circles on the electrochemical behavior of ascorbic acid

由圖4可知，當(dāng)n=30時，所制備的修飾電極測定AA 的氧化峰電流最大（7.110×10-5A）（P＜0.05），這是因為隨著n的增加Mb/AuNPs在電極上形成的膜趨于完整，對AA的響應(yīng)電流逐漸增大；但隨著n的持續(xù)增加，膜厚增加，電子在膜中阻力變大，導(dǎo)致響應(yīng)電流降低。故本論文中掃描圈數(shù)n選擇30。

2.2.2 緩沖溶液種類對抗壞血酸電化學(xué)行為的影響

不同緩沖溶液種類對抗壞血酸電化學(xué)行為的影響見圖5。

圖5 不同緩沖溶液種類對抗壞血酸電化學(xué)行為的影響Fig.5 Influence of different buffer solutions on the electrochemical behavior of ascorbic acid

由圖5中可知，改變緩沖溶液的種類，Mb/AuNPs修飾電極對抗壞血酸的響應(yīng)信號隨之改變，相較于檸檬酸鹽緩沖溶液和醋酸緩沖溶液，氧化峰電流增加最顯著（P＜0.05），其次是檸檬酸鹽緩沖溶液，醋酸緩沖溶液的峰電流響應(yīng)最不明顯，在PBS緩沖溶液中有最顯著的峰電流，這與Chi等[18]研究具有相似的結(jié)果。因此，選擇PBS用于Mb/AuNPs電極對AA測定的后續(xù)研究。

2.2.3 體系pH值對抗壞血酸電化學(xué)行為的影響

不同pH值對抗壞血酸電化學(xué)行為的影響見圖6。

圖6 不同pH值對抗壞血酸電化學(xué)行為的影響Fig.6 Influence of different pH values on the electrochemical behavior of ascorbic acid

由圖 6 可知，在 pH 值分別為 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的PBS中Mb/AuNPs電極的活性隨pH值的變化而改變。隨著檢測體系pH值的變化電催化性能也會發(fā)生變化，因此產(chǎn)生的響應(yīng)電流也隨之變化。當(dāng)pH值由6.0增加到8.0時，氧化峰電流呈先增大后減小趨勢，在pH值為7.0時氧化峰電流達(dá)到最大，為7.154×10-5A（P＜0.05），當(dāng)pH值大于7.0時，氧化峰電流呈下降趨勢。Wang等[19]選用pH7.0的檢測體系得到最高的電流響應(yīng)，與本試驗結(jié)果相似。因此，選擇pH7.0用于Mb/AuNPs電極對AA測定的后續(xù)研究。

2.2.4 緩沖溶液濃度對抗壞血酸電化學(xué)行為的影響

不同濃度PBS對抗壞血酸電化學(xué)行為的影響見圖7。

由圖 7 可知，在濃度為分別 0、0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 mol/L PBS的AA體系中Mb/AuNPs電極的電化學(xué)行為。在添加PBS和未添加PBS的反應(yīng)體系中，循環(huán)伏安曲線存在顯著變化（P＜0.05）。當(dāng)添加PBS時，體系有明顯的電流響應(yīng)（P＜0.05），試驗結(jié)果表明修飾電極檢測AA需要在PBS體系下進(jìn)行，當(dāng)PBS濃度值由0.01mol/L增加到0.20 mol/L時，氧化峰電流呈先增大后減小趨勢，在PBS濃度為0.10 mol/L時氧化峰電流達(dá)到最大，為 7.173×10-5A（P＜0.05），當(dāng)PBS濃度大于0.1 mol/L 時，氧化峰電流出現(xiàn)下降趨勢。0.10 mol/L PBS的AA體系具有最高的電流響應(yīng)，因此，選擇0.10 mol/L PBS的AA體系用于Mb/AuNPs電極檢測AA的后續(xù)研究。

圖7 不同濃度PBS對抗壞血酸電化學(xué)行為的影響Fig.7 Influence of different concentrations of PBS on the electrochemical behavior of ascorbic acid

2.2.5 掃描速度對抗壞血酸電化學(xué)行為的影響

掃描速度（ν）對抗壞血酸電化學(xué)行為的影響見圖8。

圖8 掃描速度對抗壞血酸電化學(xué)行為的影響Fig.8 Influence of scanning speed on electrochemical behavior of ascorbic acid

由圖8a可知，隨著掃描速度的增加，抗壞血酸氧化峰電位略微正移，峰電流也隨之增大。如圖8b所示，峰電流I與掃描速度ν1/2呈良好的線性關(guān)系，線性方程為 I=24.12ν1/2+1.39，R2=0.996，表明 AA 在 Mb/AuNPs電極上的電化學(xué)行為是受擴(kuò)散控制的不可逆反應(yīng)[20]。

2.3 抗壞血酸測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖9。

圖9 抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.9 Standard curve of ascorbic acid

如圖9可知，利用Origin軟件擬合得到抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為I=0.646CAA+0.552，相關(guān)系數(shù)R2=0.994 6，說明在此范圍內(nèi)AA濃度與其峰電流呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，滿足分析要求。采用信噪比（S/N=3）計算其最低檢出限為 1.32×10-6mol/L，定量限為 2.39×10-6mol/L。

2.4 重現(xiàn)性與穩(wěn)定性

使用同一根Mb/AuNPs電極測定抗壞血酸樣品溶液，重復(fù)測定10次，結(jié)果見表1。

由表1可知，平均峰電流為7.094×10-5A，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.94%，表明該電極具有良好的重現(xiàn)性。將制備好的電極在空氣中放置7 d，然后進(jìn)行檢測，峰電流為6.841×10-5A，與平均峰電流相比，下降了3.57%，表明該修飾電極的穩(wěn)定性良好，使用壽命長，可以進(jìn)行實際應(yīng)用。

表1 重現(xiàn)性試驗結(jié)果Table 1 Reproducible test results

2.5 實際樣品分析

取處理后樣品上清液，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對樣品中的抗壞血酸含量進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。

表2 樣品中抗壞血酸的加標(biāo)回收率Table 2 Recovery rate of ascorbic acid in the sample

由表2可知，樣品加標(biāo)回收率為96.3%～105.8%，RSD為1.7%～3.6%，表明該法的準(zhǔn)確度較高，可靠性強(qiáng)。

3 結(jié)論

利用電沉積法成功制備了Mb/AuNPs修飾電極，通過循環(huán)伏安法對抗壞血酸進(jìn)行電化學(xué)分析。結(jié)果表明在電沉積掃描圈數(shù)為30，PBS濃度為0.1 mol/L、pH值為7.0時，該修飾電極在檢測此抗壞血酸體系時得到最高的電化學(xué)信號。該電極制備簡單，檢測效果好，最低檢出限為1.32×10-6mol/L，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.94%，并且該電極具有理想的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性以及較強(qiáng)的抗干擾能力。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對檸檬果汁、橙汁、干制香菇、山楂罐頭和腌制榨菜中的抗壞血酸的含量進(jìn)行了測定，加標(biāo)回收試驗結(jié)果可靠，表明該法準(zhǔn)確度高，可以用于實際樣品的檢測。