游慶紅，陳梅琳，趙增東，李彥良，鄧永智，周孟婷，尹秀蓮*，羅楚平

（1.淮陰工學(xué)院化工學(xué)院，江蘇 淮安 223003；2.淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇 淮安 223003）

機(jī)體的氧化應(yīng)激是許多疾病如糖尿病、癌癥和炎癥疾病的誘因，此外，脂質(zhì)氧化會(huì)引起很多食物的變質(zhì)[1-2]。自由基介導(dǎo)的氧化應(yīng)激、脂質(zhì)氧化得到廣泛關(guān)注，尋找可以顯著抑制氧化反應(yīng)的抗氧化劑成為研究的熱點(diǎn)[3-4]。由于一些合成抗氧化劑，如丁基羥基苯甲醚、丁基羥基甲苯、沒食子酸丙酯和叔丁基對(duì)苯二酚過量添加會(huì)產(chǎn)生毒副作用，開發(fā)安全有效的天然抗氧化劑具有重要的研究意義[5-6]。Tironi等[7]研究了莧菜蛋白抗氧化肽在植物油熱氧化過程中的抗氧化作用，將抗氧化肽以10%的濃度分散在油中，結(jié)果表明抗氧化肽對(duì)油有高溫?zé)岱€(wěn)的作用。石麗梅等[8]研究了玉米抗氧化肽對(duì)中式香腸氧化穩(wěn)定性的影響，將玉米抗氧化肽拌入原料制備香腸，結(jié)果表明2%玉米肽的抗氧化性要顯著高于0.01%丁基羥基茴香醚。

抗氧化肽一般由2個(gè)～20個(gè)氨基酸組成，能夠延緩或防止食物系統(tǒng)中的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化，并保護(hù)身體免受與炎癥、癌癥和衰老等疾病相關(guān)的氧化損傷[9-10]。多肽及蛋白質(zhì)酶解物具有低致敏性、高活性、易吸收和安全等特點(diǎn)，相較于蛋白質(zhì)更有益于人體健康[11]?？寡趸耐ǔ４嬖谟跓o活性或活性較低的大分子蛋白中，可以通過蛋白酶的酶解制備[12]。酶法制備抗氧化肽反應(yīng)條件溫和、制備效率高，是目前常用的方法[13]。

草菇（Volvariella volvacea），又名麻菇、蘭花菇等[14-15]，草菇的味道鮮嫩可口、含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和活性物質(zhì)。近年來，國內(nèi)外對(duì)草菇研究主要集中在其多糖的提取純化與生物活性等方面[16]，而對(duì)草菇蛋白的研究較少，每100g草菇含蛋白質(zhì)2.68g，其蛋白質(zhì)含有18種氨基酸，其中必需氨基酸占40.47%～44.47%[17-18]。草菇蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白質(zhì)資源，可以作為優(yōu)良的抗氧化肽制備原料，本研究以草菇為原料，提取制備草菇蛋白，篩選酶解制備草菇蛋白抗氧化肽的最適酶，并采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，為酶解草菇蛋白制備抗氧化肽的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)，也為日后的進(jìn)一步深入研究提供方向和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

草菇：市售；木瓜蛋白酶（酶活100 U/mg），中性蛋白酶（酶活 200 U/mg）、堿性蛋白酶（酶活 200 U/mg）、胃蛋白酶（酶活250 U/mg）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：sigma 公司；2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2，2-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、FeSO4、H2O2、水楊酸、鐵氰化鉀：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

Q-250B高速多功能粉碎機(jī)：上海冰都電器有限公司；YB-FD-1冷凍干燥機(jī)：上海億倍實(shí)業(yè)有限公司；D-8紫外可見分光光度計(jì)：南京菲勒儀器有限公司；FA1004N電子天平：上海菁華科技儀器有限公司；5418小型臺(tái)式高速離心機(jī)：德國艾本德公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 草菇蛋白粉的制備

將草菇55℃低溫干燥8 h，粉碎成粗粉，過40目篩。稱取5 g草菇粉，加50 mL去離子水，用0.5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH8.0，充分混合均勻，于轉(zhuǎn)速8 000 r/min下離心15 min，取上清液，用HCl調(diào)pH4.5，靜置10 min使蛋白初步沉降，于8 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心20 min。將濕蛋白取出，進(jìn)行冷凍干燥，得草菇蛋白粉。

1.2.2 蛋白酶篩選

分別采用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和胃蛋白酶進(jìn)行酶解試驗(yàn)。設(shè)定酶解的反應(yīng)條件為料液比 1∶10（g/mL），加酶量均為 5 000 U/g，酶解時(shí)間 6 h，并調(diào)節(jié)pH值及溫度為各蛋白酶水解最適條件。分別于酶解 10、30、60、120、180、240、300、360 min 取樣，沸水加熱5 min對(duì)蛋白酶滅活，冷卻后測(cè)定酶解溶液的DPPH自由基清除率，篩選出最佳蛋白酶。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

1.2.3.1 酶濃度對(duì)制備抗氧化肽的影響

固定底物濃度為4%，pH6.0，酶解時(shí)間120 min，酶解溫度55℃，以DPPH自由基清除率為指標(biāo)，選取木瓜蛋白酶濃度0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%，考察酶濃度對(duì)酶解草菇蛋白制備抗氧化肽的影響。

1.2.3.2 酶解溫度對(duì)制備抗氧化肽的影響

固定底物濃度為4%，pH6.0，酶解時(shí)間120 min，酶濃度1.0%，以DPPH自由基清除率為指標(biāo)，選取酶解溫度為 40、45、50、55、60 ℃，考察酶解溫度對(duì)酶解草菇蛋白制備抗氧化肽的影響。

1.2.3.3 酶解時(shí)間對(duì)制備抗氧化肽的影響

固定底物濃度為4%，pH6.0，酶解溫度50℃，酶濃度1.0%，以DPPH自由基清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取酶解時(shí)間為 60、120、180、240、300 min，考察酶解時(shí)間對(duì)草菇蛋白制備抗氧化肽的影響。

1.2.3.4 底物濃度對(duì)制備抗氧化肽的影響

固定pH6.0，酶解溫度55℃，酶濃度1.0%，酶解時(shí)間180 min，以DPPH自由基清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取底物濃度為1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%，考察底物濃度對(duì)酶解草菇蛋白制備抗氧化肽的影響。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的響應(yīng)面分析方法，以酶濃度、底物濃度、酶解溫度及酶解時(shí)間為自變量，DPPH自由基清除率為響應(yīng)值，對(duì)酶解工藝進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。各因素水平及編碼見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 Levels and process variables used for response surface analysis

1.2.5 DPPH自由基清除率試驗(yàn)

參照J(rèn)ang等[19]的方法，并稍作改動(dòng)。取2 mL酶解液于試管中，加1 mL 0.2 mmoL/L DPPH溶液，劇烈振蕩搖勻，放置在暗處反應(yīng)30 min，用紫外分光光度計(jì)在517 nm測(cè)定吸光度為A1；移取1 mL乙醇溶液和2 mL酶解液混合搖勻測(cè)得吸光度為A2；移取2 mL乙醇溶液和1 mL DPPH為A3；2 mL水與2 mL乙醇混合溶液調(diào)零。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下。

1.2.6 羥基自由基清除率

參照Zhang等[20]的方法測(cè)定。配制8 mmol/L的FeSO4溶液、20 mmol/L的H2O2及3 mmol/L水楊酸。取0.335 mL樣品與8 mmol/L FeSO40.1 mL、水楊酸0.335 mL及H2O20.08 mL混勻，37℃保溫30 min后流水冷卻，加入蒸餾水0.15 mL，5 000×g離心10 min，取上清液于510 nm波長處測(cè)定吸光值，分別以蒸餾水代替樣品和H2O2溶液作為空白組和對(duì)照組。羥基自由基清除率計(jì)算公式如下。

式中：A0為空白組吸光值；A1為樣品組凈吸光值。

1.2.7 還原能力的測(cè)定

取待測(cè)樣品溶液，加入pH6.6、濃度0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液2.5 mL和1%鐵氰化鉀溶液3.0 mL，50℃水浴加熱20 min，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，5 000×g離心10 min，取上清液3 mL，加入蒸餾水3 mL混合，加入0.1%的FeCl3溶液0.5 mL，混勻，25℃靜置15 min，以去離子水代替樣品溶液作為空白，在700 nm波長下測(cè)定吸光度[21]。

1.2.8 ABTS+自由基清除能力

分別取5 mL 7.4 mmol/L ABTS溶液和3.6 mmol/L過硫酸鉀溶液，混合均勻，25℃避光反應(yīng)12 h，得到ABTS+自由基儲(chǔ)備液。取樣品液0.4 mL于試管中，加入3.6 mL ABTS儲(chǔ)備液，25℃避光反應(yīng)6 min，于734 nm處測(cè)定吸光值，以去離子水替代樣品做空白對(duì)照。ABTS+自由基清除率計(jì)算公式如下[22]。

ABTS+自由基清除率/%=[A0-（A1-A2）]/A0×100

式中：A0為空白對(duì)照吸光值；A1為樣品與ABTS反應(yīng)后吸光值；A2為樣品自身的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（n=3），采用origin pro 8.0和Design-expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的篩選

不同酶處理對(duì)DPPH自由基清除率的影響的試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 不同酶處理對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effect of different enzyme treatment on DPPH free radicals scavenging rate

由圖1可知，4種蛋白酶對(duì)產(chǎn)物DPPH自由基清除率的影響差異較大，中性蛋白酶與木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物抗氧化活性較強(qiáng)，其中木瓜蛋白酶在酶解180min時(shí)，DPPH自由基清除率可達(dá)到約80%，隨著水解的繼續(xù)進(jìn)行，DPPH自由基清除率緩慢下降。堿性蛋白酶與胃蛋白酶水解產(chǎn)物DPPH自由基清除率較低，隨水解時(shí)間延長呈緩慢上升的趨勢(shì)，當(dāng)水解時(shí)間達(dá)到240min后，DPPH自由基清除率基本趨于恒定。以DPPH自由基清除率為指標(biāo)，本試驗(yàn)選擇有最高清除率的木瓜蛋白酶為最佳酶。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 酶濃度對(duì)制備抗氧化肽的影響

木瓜蛋白酶濃度對(duì)酶解草菇蛋白制備抗氧化肽的影響結(jié)果見圖2。

圖2 酶濃度對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effect of enzyme concentration on DPPH free radicals scavenging rate

由圖2可知，酶濃度在0.4%～1.0%時(shí)，DPPH自由基清除率迅速上升，酶濃度為1.0%時(shí)，清除率達(dá)到80.62%。當(dāng)酶濃度在1.0%～1.2%時(shí)，清除率下降。其原因可能是在一定濃度范圍內(nèi)，隨著酶濃度逐漸增加，底物蛋白水解越充分，生成的抗氧化肽量越多，但隨著酶濃度的進(jìn)一步增加，部分抗氧化肽會(huì)被過度水解成不具有抗氧化活性的更短小的肽或氨基酸，使酶解液對(duì)DPPH自由基的清除率降低。選取酶濃度1.0%較適宜。

2.2.2 酶解溫度對(duì)制備抗氧化肽的影響

酶解溫度對(duì)酶解草菇蛋白制備抗氧化肽的影響結(jié)果見圖3。

圖3 酶解溫度對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effect of different enzymolysis temperature on DPPH free radicals scavenging rate

由圖3可知，在酶解溫度在40℃～55℃時(shí)，DPPH自由基清除率隨溫度升高而增加；在55℃時(shí)清除率達(dá)到80.22%。當(dāng)酶解溫度在55℃～60℃時(shí)，清除率下降。可能是溫度較低時(shí)，隨著溫度逐漸升高，酶活性逐漸增強(qiáng)，酶解速率逐漸加快，達(dá)到酶最適溫度時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)到最大值。但當(dāng)酶解溫度超過了酶的最適溫度時(shí)，過高的溫度會(huì)使得酶的活性會(huì)逐漸下降，甚至是失活，導(dǎo)致酶解產(chǎn)物含量降低，清除率下降。選取50℃為較適宜的酶解溫度。

2.2.3 酶解時(shí)間對(duì)制備抗氧化肽的影響

酶解時(shí)間對(duì)酶解草菇蛋白制備抗氧化肽的影響結(jié)果見圖4。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on DPPH free radicals scavenging rate

由圖4可知，在酶解時(shí)間在60 min～180 min時(shí)，DPPH自由基清除率隨時(shí)間的延長而增加，180 min時(shí)的清除率為81.15%；而后，隨著酶解時(shí)間的延長，清除率下降。在一定范圍內(nèi)，隨著酶解時(shí)間的增加，抗氧化肽產(chǎn)量增加，DPPH自由基清除率增加，但隨著時(shí)間進(jìn)一步增加，部分抗氧化肽被進(jìn)一步水解，生成不具有抗氧化活性的短肽或氨基酸，DPPH自由基清除率也隨之降低。因此，酶解時(shí)間為180 min較合適。

2.2.4 底物濃度對(duì)制備抗氧化肽的影響

底物濃度對(duì)酶解草菇蛋白制備抗氧化肽的影響結(jié)果見圖5。

圖5 底物濃度對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effect of substrate concentration on DPPH free radicals scavenging rate

由圖5可知，在底物濃度小于3.0%時(shí)，DPPH自由基清除率隨底物濃度增加而迅速增加；當(dāng)?shù)孜餄舛仍?.0%～5.0%時(shí)，清除率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。在底物濃度較低時(shí)，濃度的增加可以加大底物和酶結(jié)合的概率，促進(jìn)反應(yīng)速率，但隨著底物濃度進(jìn)一步增加，反應(yīng)體系的黏度增加，會(huì)影響酶和底物間的接觸和有效反應(yīng)，因此，DPPH自由基清除率隨底物濃度的增加呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)。底物濃度為3.0%較合適。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)與結(jié)果分析

響應(yīng)面分析的結(jié)果如表2所示。方差分析的結(jié)果如表3所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值Table 2 Response surface design and response value

表3 響應(yīng)面模型方差分析Table 3 ANOVA of response surface model

試驗(yàn)結(jié)果采用Design-Expert 8.0.5軟件的ANOVA程序進(jìn)行二次回歸分析，DPPH自由基清除率標(biāo)準(zhǔn)回歸方程：Y=82.39600+0.74750A+0.68750B-1.58500C-1.635 00D+2.500 00×10-3AB-2.220 45×10-16AC+5.55112×10-17BC+1.110 22×10-16CD-4.121 33A2-2.241 33B2-4.560 08C2+1.164 92D2。

從表3可以看出，該二次方程模型具有顯著性差異（P＜0.000 1），回歸方程失擬度 P=1.000 0＞0.05，失擬檢驗(yàn)不顯著，說明該二次回歸模型擬合度良好，試驗(yàn)誤差??；相關(guān)系數(shù)R2為0.9977，說明試測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間有高度的相關(guān)性[23-24]。校正決定系數(shù)R2Adj為0.995 4，說明該模型能解釋99.54%響應(yīng)值的變化。該模型可信度高，可作為進(jìn)一步分析的依據(jù)。其相關(guān)各因素皆為十分顯著（P＜0.01），但交互影響均不顯著。根據(jù)所得模型可繪制出相應(yīng)的響應(yīng)面分析圖及等高線圖，見圖6。

圖6 各因素交互作用的響應(yīng)曲面和等高線Fig.6 Response surface plot and contour plot of interaction of various factors

響應(yīng)曲面坡度和等高線圖的形狀及緊密程度反映了條件變化時(shí)對(duì)響應(yīng)值影響的靈敏程度，曲線越彎曲說明研究因素對(duì)結(jié)果影響越大，等高線呈圓形說明交互作用不顯著。由圖6可以看出，酶濃度（A）、底物濃度（B）、酶解溫度（C）三者兩兩交互作用的響應(yīng)面坡度變化較陡，等高線為圓形，說明三者對(duì)DPPH自由基清除率有顯著影響，但交互作用不顯著。酶解時(shí)間（D）與酶濃度（A）、底物濃度（B）、酶解溫度（C）的交互響應(yīng)面圖及等高線圖可以看出，酶解時(shí)間對(duì)應(yīng)的響應(yīng)面曲線及等高線變化相對(duì)陡峭，可以推知酶解時(shí)間對(duì)DPPH清除率的影響作用大于其他3個(gè)因素的影響。

由圖6可知，酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH清除率隨著酶濃度（A）、底物濃度（B）、酶解溫度（C）、酶解時(shí)間（D）的增加呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)。通過二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型解逆矩陣，得出酶解草菇蛋白制備抗氧化肽的最佳工藝條件為酶濃度1.01%、底物濃度2.08%、酶解溫度54.13℃、酶解時(shí)間180.63 min，其預(yù)測(cè)的最大清除率為85.42%。

考慮實(shí)際操作方便，將最佳工藝修正為酶濃度1.0%、底物濃度2.0%、酶解溫度55℃、酶解時(shí)間180 min，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果所得抗氧化肽的DPPH清除率為85.16%，與預(yù)測(cè)值85.42%相近。所以，采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的木瓜蛋白酶酶解草菇蛋白制備抗氧化肽的工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

2.4 抗氧化活性研究

以優(yōu)化所得最佳工藝制備抗氧化肽，對(duì)其DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率、還原能力、

ABTS+自由基清除率等進(jìn)行測(cè)定并與同濃度VC進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見圖7。

圖7 抗氧化肽抗氧化活性Fig.7 Antioxidant activity of the antioxidant peptide

由圖7可知，DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率、還原能力、ABTS+自由基清除率都隨著樣品濃度的增加而增加。抗氧化肽的羥基自由基清除率、ABTS+自由基清除率相對(duì)較弱，最高分別為71.2%和68.3%，都低于同等濃度的VC相應(yīng)的抗氧化活性；在濃度為15 mg/mL時(shí)，抗氧化肽的DPPH自由基清除率、還原力與同等濃度的VC相應(yīng)的抗氧化活性相近，表明草菇木瓜蛋白酶水解得到的抗氧化肽具有較好的抗氧化活性。裴云成等[25]采用堿性蛋白酶酶解制備的杏鮑菇柄抗氧化肽的還原力與羥基自由基清除率分別為0.43和47.28%，均低于同等濃度VC的還原力（0.72）和羥基自由基清除率（86.97%），與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。

3 結(jié)論

以DPPH自由基清除率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定酶解草菇蛋白制備抗氧化肽的最佳蛋白酶為木瓜蛋白酶。根據(jù)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)的結(jié)果，采用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化工藝參數(shù)，獲得最佳酶解條件為酶濃度1.0%、底物濃度2.0%、酶解溫度55℃、酶解時(shí)間180 min，所得的DPPH自由基清除率為85.16%。對(duì)最佳工藝所得抗氧化肽DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率、還原能力、ABTS+自由基清除率進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明草菇木瓜蛋白酶水解得到的抗氧化肽具有較好的抗氧化活性。