楊敏

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)香料研究所，云南 昆明 650201）

香莢蘭，又名香子蘭，系蘭科香莢蘭屬多年生草本植物，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，它是蘭科植物中具有實(shí)用價(jià)值的一種名貴天然香料，由于具有一種沁人心脾的獨(dú)特香氣，被廣泛用于各種食品的加香，素有“食品香料之王”的美譽(yù)[1]。我國(guó)自1960年開(kāi)始引種，現(xiàn)在主要種植于我國(guó)的海南、云南一帶。人工栽培的品種主要有3種：墨西哥香莢蘭（Vanilla planifolia Andrews）、塔希提香莢蘭（Vanilla tahitensis J.W.Moor）、大花香莢蘭（Vanilla pompona Schiede），其中以墨西哥香莢蘭的栽培面積最大。綠色的香莢蘭鮮豆莢經(jīng)發(fā)酵生香等工藝后，形成和諧、優(yōu)雅的特有芳香氣味[2]，可生成250多種芳香成分，形成的獨(dú)特香味是人工合成香料無(wú)法比擬的[3]。香莢蘭的傳統(tǒng)生香方法是通過(guò)殺青、干燥、陳化等一系列處理過(guò)程讓莢果的內(nèi)源酶得以活化并釋放出來(lái)，在一定的條件下由其自身的內(nèi)源酶和外界微生物的共同作用，釋放香氣成分。Leong等[4]利用色譜和光譜技術(shù)從青豆莢中成功地分離和鑒定了香蘭素葡糖苷，這些前體物在加工過(guò)程中經(jīng)植物體內(nèi)酶的作用和一系列的非酶轉(zhuǎn)化后，分解形成具有揮發(fā)性的香氣成分，賦予豆莢令人愉快的香氣，完成生香過(guò)程。研究結(jié)果表明，香莢蘭中揮發(fā)性成分有49種，主要揮發(fā)性成分是香蘭素。殺青和發(fā)酵處理、酶促反應(yīng)在香蘭素的形成過(guò)程中有著重要的作用[5]。香莢蘭產(chǎn)地不同，其微量成分和香氣也不完全一樣，大致可分為波旁型、墨西哥型和塔希提型3種香氣類(lèi)型[6-7]。經(jīng)發(fā)酵生香后的香莢蘭被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品及醫(yī)藥等領(lǐng)域。香蘭素是香莢蘭中最重要的風(fēng)味物質(zhì)，在輕工業(yè)、化學(xué)工業(yè)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上都有廣泛的應(yīng)用，Dignum等[8]報(bào)道香蘭素、愈創(chuàng)木酚等對(duì)香莢蘭整體香氣均有重要影響，香蘭素通常作為食品香料、天然醫(yī)藥和藥物中間體，具有抗菌的功效[9-10]。鄰甲氧基苯酚又名愈創(chuàng)木酚，是一種重要的酚類(lèi)香料，可用來(lái)合成香草醛[11]。在醫(yī)藥上，香莢蘭可作為芳香型神經(jīng)系統(tǒng)興奮劑，有強(qiáng)心、補(bǔ)腦、健胃、驅(qū)風(fēng)作用，可治療虛熱、胃病、風(fēng)濕熱、抑郁等病癥，具有抗癌、抗輻射、抗誘變、抗驚厥等功效[12-14]。香莢蘭提取物中多種揮發(fā)性成分均具有特殊的生物活性，如抗氧化、抗衰老等，因此可應(yīng)用于化妝品行業(yè)中調(diào)配高檔香水，楊慶明等[15]證明香莢蘭可作為抗氧化劑應(yīng)用到多種護(hù)膚品中。本研究對(duì)云南省西雙版納地區(qū)種植的香莢蘭進(jìn)行了傳統(tǒng)生香加工及酶促生香的研究，外加β-葡萄糖苷酶處理青莢促進(jìn)香蘭素糖苷等化合物的分解，加速生香過(guò)程，縮短生香周期，探討酶促生香用于生產(chǎn)中的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

云南香莢蘭豆莢（墨西哥香莢蘭）：云南農(nóng)業(yè)大學(xué)香料研究所種植與保藏；β-葡萄糖苷酶（酶活力5.5U/mg）、香蘭素、香蘭酸、對(duì)羥基苯甲醛、對(duì)羥基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞95%）：美國(guó)sigma公司；甲醇、乙醇、冰醋酸（均為分析純）：阿拉丁公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters510高效液相色譜儀（510泵、millennium2010化學(xué)工作站）、色譜柱 Nova-PakC8（3.9 mm×150 mm×4 μm）、996二極管陣列紫外檢測(cè)器：美國(guó)Waters公司；GZX-9070MBZ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；JA5003N電子分析天平：上海箐海儀器有限公司；CQ250超聲波清洗儀：上海超聲波儀器廠；8002型數(shù)顯恒溫水浴鍋：北京永光明醫(yī)療儀器廠；79-1型磁力加熱攪拌器：常州國(guó)華電器有限公司；RE-2000E旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：西安禾普生物科技有限公司；TG16MW離心機(jī)：湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 香莢蘭生香加工的工藝

選取長(zhǎng)度為18 cm～20 cm的香莢蘭，經(jīng)熱水殺青處理后擦干水，趁熱用毛毯包裹殺青后的香莢蘭進(jìn)行保溫保濕發(fā)酵處理發(fā)汗，經(jīng)β-葡萄糖苷酶處理后在30℃～70℃、相對(duì)濕度（60±10）%和適當(dāng)?shù)臅r(shí)間條件下將香莢蘭放于恒溫發(fā)酵箱中直接進(jìn)行發(fā)酵，然后上架陰干，陳化5個(gè)月后進(jìn)行評(píng)香及檢測(cè)。

傳統(tǒng)工藝流程：香莢蘭→殺青→發(fā)酵→陳化→干燥→成品莢。

優(yōu)化工藝流程：香莢蘭→殺青→酶活化→發(fā)酵→陳化→干燥→成品莢。

1.3.2 香莢蘭生香加工的單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 殺青溫度及時(shí)間的確定

熱水殺青處理以抑制或減弱豆莢組織的生命活力，使豆莢退綠產(chǎn)生褐變，但不影響豆莢內(nèi)的酶活性。分別在 60、65、70、75、80 ℃進(jìn)行殺青，以香蘭素含量為指標(biāo)，篩選最佳的殺青溫度；分別殺青 30、45、60、75、90 s，以香蘭素含量為指標(biāo)，篩選最佳的殺青時(shí)間。

1.3.2.2 發(fā)酵溫度及時(shí)間的確定

豆莢的發(fā)酵過(guò)程是生香加工的重要環(huán)節(jié)，需要一定的溫度和較高的濕度，豆莢中香蘭素含量是在這個(gè)階段產(chǎn)生的。通過(guò)控制酶系反應(yīng)過(guò)程中所需的發(fā)酵溫度、時(shí)間和濕度，使其快速干燥。分別在 30、40、50、60、70℃進(jìn)行發(fā)酵，以香蘭素含量為指標(biāo)，篩選最佳的發(fā)酵溫度；發(fā)酵時(shí)間分別為 24、36、48、60、72 h，以香蘭素含量為指標(biāo)，篩選最佳的發(fā)酵時(shí)間。

1.3.3 香莢蘭生香加工的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以殺青溫度、殺青時(shí)間、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時(shí)間為因素，設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn)，以香蘭素含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of L9（34）orthogonal test

1.3.4 香莢蘭酶促生香的工藝

1.3.4.1 β-葡萄糖苷酶對(duì)香莢蘭豆莢的處理

取100 g豆莢殺青后勻漿，準(zhǔn)確稱(chēng)量10 g勻漿樣品，加入50 U/g的β-葡萄糖苷酶，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系至pH6，同樣條件下制備一個(gè)不加酶的空白對(duì)照樣。樣品置于40℃水浴中反應(yīng)48 h，分別用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇提取8 h，提取物定容至100 mL，待分析。

1.3.4.2 生香工藝的優(yōu)化

香莢蘭豆莢殺青后加入50 U/g的β-葡萄糖苷酶，使β-葡萄糖苷酶對(duì)每克豆莢的處理活性分別為50單位，陳化期每隔2個(gè)月取樣，高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC） 分析豆莢在不同生香階段的有關(guān)成分含量，監(jiān)測(cè)4個(gè)主香成分的含量變化，并對(duì)豆莢的香氣進(jìn)行評(píng)定，確定香莢蘭酶促生香的最佳工藝。

1.3.5 生香樣品的香氣成分分析

樣品的預(yù)處理：取100 g生香香莢蘭豆莢，切為長(zhǎng)0.5 cm～1.0 cm小段，混勻準(zhǔn)確稱(chēng)量10 g，用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇索式提取16 h，提取物定容至100 mL待分析。用HPLC分析傳統(tǒng)生香、酶促生香樣品中主要香氣成分的含量。

1.3.6 外標(biāo)溶液配制及定性定量分析

外標(biāo)溶液配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取香蘭素5.000 0 g、對(duì)羥基苯甲醛0.250 0 g、香蘭酸0.250 0 g、對(duì)羥基苯甲酸0.050 0 g，分別用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶解，并定容至250mL容量瓶中。再用移液管各取5、10、10mL和15mL 4種溶液用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇定容于100 mL容量瓶中，得到4個(gè)標(biāo)樣的外標(biāo)溶液。

定性定量分析：豆莢提取物與標(biāo)準(zhǔn)溶液在同一液相色譜分析條件下進(jìn)行保留時(shí)間及紫外光譜圖對(duì)照，并參照文獻(xiàn)[16-18]完成樣品中4個(gè)待分析成分的定性定量鑒定。取供試液5 μL進(jìn)樣，在254 nm處測(cè)吸收度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=2 100X-377 000，R2=0.999 987外標(biāo)法峰面積定量計(jì)算得到樣品的香蘭素濃度含量，再將結(jié)果換算為百分含量（%）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel2010分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及作圖分析。方差分析時(shí)，P＜0.05或P＜0.01，表示具有顯著性差異，試驗(yàn)結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶促生香工藝的優(yōu)化研究

香莢蘭酶促生香研究是采用外加β-葡萄糖苷酶處理香莢蘭豆莢獲得酶促生香的最佳加工工藝。研究結(jié)果表明，香莢蘭豆莢中β-葡萄糖苷酶的最佳添加量是50 U/g，用β-葡萄糖苷酶處理香莢蘭豆莢2個(gè)月后，高效液相色譜分析豆莢的成分含量，香蘭素含量超過(guò)了3%，另外3個(gè)成分也有不同程度的提高。試驗(yàn)證明外加β-葡萄糖苷酶可以更快更完全地分解香蘭素葡糖苷，β-葡萄糖苷酶對(duì)香莢蘭中香蘭素及有關(guān)成分的形成起了重要作用。陳化6個(gè)月，各樣品表面均附有白色透亮的香蘭素針狀結(jié)晶，外觀品質(zhì)很好，香莢蘭特征香氣突出，香氣濃郁強(qiáng)烈，香蘭素糖苷分解完全，酶處理樣品中香蘭素含量已達(dá)3.085%，酶處理增效結(jié)果十分明顯。因此采用酶促生香工藝加工香莢蘭可促進(jìn)香蘭素葡糖苷等物質(zhì)的分解，縮短香莢蘭生香時(shí)間，提高豆莢中香蘭素的含量及成品莢的質(zhì)量。

2.2 香莢蘭生香加工單因素試驗(yàn)

2.2.1 殺青溫度對(duì)香蘭素含量的影響

殺青溫度對(duì)香蘭素含量的影響見(jiàn)圖1。

圖1 殺青溫度對(duì)香蘭素含量的影響Fig.1 Effects of green-removing temperature on the vanillin content

由圖1可知，當(dāng)殺青溫度在70℃～75℃時(shí)，香蘭素含量隨著殺青溫度的升高而升高，殺青溫度大于75℃時(shí)，香蘭素含量逐漸降低，因此75℃是最佳的殺青溫度。殺青溫度的升高使鮮豆莢失去生理機(jī)能，組織細(xì)胞因膨脹破裂而釋放出細(xì)胞液，此時(shí)適當(dāng)?shù)臏囟燃ぐl(fā)了細(xì)胞液中生物酶的活性。殺青溫度太高，使豆莢中的活性酶受到破壞而影響發(fā)酵，香蘭素含量降低，殺青溫度75℃時(shí)，香蘭素含量最高。

2.2.2 殺青時(shí)間對(duì)香蘭素含量的影響

殺青時(shí)間對(duì)香蘭素含量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 殺青時(shí)間對(duì)香蘭素含量的影響Fig.2 Effects of green-removing time on the vanillin content

由圖2可知，殺青時(shí)間大于30 s時(shí)香蘭素含量逐漸降低，殺青時(shí)間太長(zhǎng)，使豆莢中的活性酶受到破壞而影響發(fā)酵，香蘭素含量降低；殺青時(shí)間不足時(shí)，影響了后期發(fā)酵的酶反應(yīng)，產(chǎn)生的香蘭素含量降低。殺青時(shí)間對(duì)香蘭素含量有顯著的影響，殺青充分時(shí)，豆莢后期發(fā)酵酶反應(yīng)充分，香蘭素含量較高。因此選取30 s作為最佳殺青時(shí)間。殺青30 s時(shí)，成品香莢蘭香氣濃郁，香蘭素含量最高。

2.2.3 發(fā)酵溫度對(duì)香蘭素含量的影響

發(fā)酵溫度對(duì)香蘭素含量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)香蘭素含量的影響Fig.3 Effects of fermentation temperature on the vanillin content

由圖3可知，當(dāng)發(fā)酵溫度在30℃～50℃時(shí)，香蘭素含量隨著發(fā)酵溫度的升高而升高，當(dāng)發(fā)酵溫度大于50℃時(shí)，香蘭素含量逐漸降低。溫度的升高，有利于促進(jìn)酶的反應(yīng)，激發(fā)莢果中酶系催化作用產(chǎn)生良好反應(yīng)生成香蘭素，溫度過(guò)高時(shí)，會(huì)引起有害的酶系反應(yīng)，香蘭素含量降低。試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵溫度為50℃時(shí)，香蘭素含量最高，因此選取50℃作為最佳發(fā)酵溫度。

2.2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)香蘭素含量的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)香蘭素含量的影響見(jiàn)圖4。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)香蘭素含量的影響Fig.4 Effects of fermentation time on the vanillin content

由圖4可知，發(fā)酵時(shí)間在24 h～48 h時(shí)，香蘭素含量隨發(fā)酵時(shí)間的增加而升高，但發(fā)酵時(shí)間超過(guò)48 h后香蘭素含量就降低。發(fā)酵時(shí)間的增加，有利于促進(jìn)酶的反應(yīng)和香蘭素的生成，阻止有害霉菌的產(chǎn)生，發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，會(huì)引起有害的酶系反應(yīng)，不能激發(fā)莢果中酶系催化作用生成香蘭素，香蘭素含量降低。試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵時(shí)間為48 h，香蘭素含量最高，因此選取48 h作為最佳發(fā)酵時(shí)間。

2.3 香莢蘭生香加工的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，采用四因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，研究殺青溫度、殺青時(shí)間、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間4個(gè)因素對(duì)香蘭素含量的影響，優(yōu)化加工工藝參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 3 The variance analysis of orthogonal experiment

由表2可知，影響香蘭素含量的各因素主次順序：A＞C＞B＞D，即殺青溫度的影響最大，其次是發(fā)酵溫度和殺青時(shí)間，發(fā)酵時(shí)間的影響最小。因此，以香蘭素含量為考察指標(biāo)，最佳工藝條件為A2B2C2D3。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 正交試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果Table 4 The result of orthogonal experimental verifies

由表4可知，最終傳統(tǒng)生香加工的最佳工藝條件為A2B2C2D3，即殺青溫度75℃，殺青時(shí)間45 s，發(fā)酵溫度50℃，發(fā)酵時(shí)間48 h。在此最優(yōu)組合條件下，得到香蘭素含量為3.058%。

2.5 香莢蘭酶促生香的研究

2.5.1 酶處理香莢蘭豆莢的分析結(jié)果

標(biāo)樣進(jìn)樣前用0.45 μm的微孔過(guò)濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣分析后，所得各組分峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系,見(jiàn)表5。β-葡萄糖苷酶處理豆莢和空白對(duì)照的液相色譜圖見(jiàn)圖5。香莢蘭豆莢和酶處理過(guò)香莢蘭豆莢中4個(gè)主香成分含量比較見(jiàn)表6。

表5 各組分峰面積與濃度的線性關(guān)系Table 5 The linear relationship of component peak area and concentration

圖5 β-葡萄糖苷酶處理豆莢和空白對(duì)照的液相色譜圖Fig.5 Liquid chromatogram of β-glucosidase-treated pods and blank control

表6 香莢蘭豆莢和酶處理香莢蘭豆莢中4個(gè)主香成分含量比較Table 6 Comparison of the contents of four main aroma components in vanilla beans and enzyme-treated vanilla beans %

香莢蘭豆莢殺青后加入β-葡萄糖苷酶，使β-葡萄糖苷酶對(duì)每克豆莢的處理活性分別為50單位，陳化期每隔2個(gè)月取樣，液相色譜分析有關(guān)成分含量。1995年，Voisine等[19]用HPLC從青莢提取物中分離出香蘭素葡糖苷，并利用核磁共振和紫外線技術(shù)做了定性鑒定，參照他們的研究結(jié)果，可認(rèn)為圖5A中的主成分1即為香蘭素葡糖苷。在外加β-葡萄糖苷酶的作用下，香蘭素葡糖苷色譜峰基本消失，香蘭素色譜峰明顯變大，其它3個(gè)組分色譜峰也有不同程度地提高，顯然β-葡萄糖苷酶對(duì)香莢蘭青莢中糖苷化合物的分解和香蘭素及其它香氣成分的形成起了重要作用。

2.5.2 酶處理香莢蘭陳化期主香化合物含量的變化

酶處理香莢蘭陳化期4個(gè)主香化合物含量的變化見(jiàn)表7。經(jīng)不同生香處理后香莢蘭中主要香味成分含量的比較見(jiàn)表8。云南香莢蘭樣品分析的液相色譜圖見(jiàn)圖6。

表7 酶處理香莢蘭陳化期4個(gè)化合物含量的變化Table 7 Variation of four components in enzyme treated vanilla during its condition

表8 經(jīng)不同生香處理后香莢蘭中主要香味成分含量的比較Table 8 Comparison of main aroma components in vanilla after different curing treatments

圖6 云南香莢蘭樣品分析的液相色譜圖Fig.6 The chromatogram of yunnan vanilla samples

從表7、表8中看出，豆莢在酶生香處理2個(gè)月后，香蘭素含量都大于3%，高于傳統(tǒng)技術(shù)加工的豆莢，另外3個(gè)成分也有不同程度的提高。陳化約4個(gè)月后，各樣品表面均附有白色透亮的香蘭素針狀結(jié)晶，酶處理豆莢的香莢蘭特征香氣突出，色澤均勻，香氣濃郁。在傳統(tǒng)生香加工過(guò)程中，香蘭素的形成主要依賴(lài)豆莢本身所含的葡萄糖苷酶對(duì)其糖苷的作用，但這一分解作用一般都進(jìn)行的不夠完全，而外加β-葡萄糖苷酶處理豆莢可起到促進(jìn)糖苷分解，提高豆莢中香蘭素含量的作用。此外從圖6分析看，所有豆莢的香蘭素糖甙峰均完全消失，可見(jiàn)酶處理的效果十分明顯。

3 結(jié)論

本研究采用殺青、發(fā)酵、干燥、陳化方法對(duì)香莢蘭進(jìn)行傳統(tǒng)生香加工，結(jié)果表明香莢蘭傳統(tǒng)生香加工最佳工藝條件是殺青溫度75℃，殺青時(shí)間45 s，發(fā)酵溫度50℃，發(fā)酵時(shí)間48 h，豆莢加工后柔軟光澤，呈現(xiàn)油亮的褐色外觀，發(fā)酵后的豆莢進(jìn)一步脫去水分陳化5個(gè)月后產(chǎn)生濃郁的香莢蘭特征香氣。同時(shí)采用外加β-葡萄糖苷酶處理香莢蘭豆莢，通過(guò)酶促生香技術(shù)可以使生香反應(yīng)更加完全，且香蘭素等4個(gè)主香成分的含量達(dá)到或超過(guò)傳統(tǒng)生香方法的商品莢，提高了香莢蘭成品莢的質(zhì)量。酶促生香法加工的豆莢具有純正、濃郁的香草香氣，外觀品質(zhì)好，香氣強(qiáng)度大于傳統(tǒng)生香法的商品莢，在香莢蘭豆莢的生產(chǎn)中具有較好的工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用前景。