高云龍，徐夢豪，王晨瑩，趙祥忠*

（1.齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）食品科學與工程學院，山東 濟南 250353；2.山東中碩海洋科技有限公司，山東 日照 276800）

冰島刺參（Cucumaria frondosa）屬棘皮動物門（Echinodermata）海參綱（Holothurcidea）枝手目（Dendrochirotida）瓜參科（Cucumariidae）海洋動物[1]，主要分布在冰島、挪威及俄羅斯等國家附近海域[2]。冰島刺參富含蛋白質、多糖、三萜糖苷、脂類等[3-8]活性物質，具有抗癌、抗炎、降血糖、抗衰老和免疫調節(jié)等[9-14]多種功能活性。冰島刺參內臟團（含性腺、消化道、胃囊等）富含蛋白質、氨基酸、脂質等[15]，由于缺乏深層次的研究和利用，冰島刺參內臟團在冰島刺參初級加工過程中多被當作下腳料處理，不僅無法有效提高冰島刺參的附加值，而且會造成資源的嚴重浪費。

常用的蛋白質提取方法有堿溶酸沉法、酶解法、超聲波輔助提取法等[16]。堿溶酸沉法操作簡單、成本較低，但其提取率也相對較低[17]；酶解法提取效率高，但酶制劑成本較高，不適用于工業(yè)化生產[18]；而超聲波輔助提取法具有提取周期短、提取充分、提取率高等優(yōu)點，可作為一種有效的蛋白質提取技術[19]。本文采用超聲波輔助提取冰島刺參內臟團蛋白質，通過單因素試驗與Box-Benhnken試驗設計，確定超聲波輔助提取冰島刺參內臟團蛋白質的最佳工藝，并對在最佳工藝條件下提取出的蛋白質進行氨基酸分析，評價其營養(yǎng)價值，為冰島刺參內臟團蛋白質進一步開發(fā)與利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

冰島刺參內臟團（含性腺、消化道、胃囊等）：山東中碩海洋科技有限公司。

牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、考馬斯亮藍G250：北京索萊寶科技有限公司；氫氧化鈉：上海麥克林生化科技有限公司；鹽酸：煙臺遠東精細化工有限公司。以上化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

1000Y型多功能粉碎機：永康市鉑歐五金制品有限公司；DHG-9030A型電熱鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；KQ-100DE型超聲波清洗機：昆山市超聲儀器有限公司；TG16-WS型臺式高速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；UV-9000型紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；SCIENTZ-18N型真空冷凍干燥機：寧波新芝生物科技股份有限公司；Rapid N型快速定氮儀：艾力蒙塔貿易（上海）有限公司；L-8900型高速氨基酸分析儀：日本日立有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

取適量冰島刺參內臟團凍品于真空冷凍干燥機，冷凍干燥48 h后取出，經粉碎機粉碎，并通過亞臨界萃取技術脫除油脂，后置于60℃電熱鼓風干燥箱干燥至恒重，過80目篩，得冰島刺參內臟團脫脂粉。

1.3.2 冰島刺參內臟團蛋白質的提取

取適量脫脂粉，按一定料液比加入蒸餾水，調節(jié)pH值至10，設置超聲功率為50 W，超聲溫度為40℃，超聲輔助提取60 min；待冷卻至25℃后，5 000 r/min離心10 min，過濾，收集上清液，測定上清液中蛋白質含量；然后調節(jié)上清液pH值至3.0，靜置30 min沉淀蛋白質，5 000 r/min離心10 min，保留沉淀，水洗3次沉淀脫去無機鹽等雜質，加水復溶后調pH值至中性，離心取上清液，經冷凍干燥后，即得冰島刺參內臟團蛋白質，儲存于4℃冰箱中備用。

上清液中蛋白質含量的測定：按照柳蔭等[20]的方法測定上清液中蛋白質的含量。蛋白質提取率按下列公式計算。

式中：M1為上清液中蛋白質含量，g；M2為樣品中蛋白質總含量，g。

1.3.3 單因素試驗

在冰島刺參內臟團蛋白質提取工藝中，固定提取條件：pH 值為 10、超聲功率為 50 W、料液比為 1∶25（g/mL）、超聲溫度為40℃、超聲時間為60 min；分別對pH值（8、9、10、11、12、13）、料液比[1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50（g/mL）]、超聲功率（50、60、70、80、90、100 W）、超聲溫度（20、30、40、50、60、70 ℃）、超聲時間（10、20、30、40、50、60 min）5 個因素進行單因素試驗，考察各因素對蛋白質提取率的影響。

1.3.4 響應面優(yōu)化試驗

在單因素試驗基礎上，運用Design-Expert 11軟件，依據Box-Behnken試驗設計原理，選擇pH值、料液比、超聲溫度、超聲時間4個因素為響應面優(yōu)化試驗中的關鍵因素，以冰島刺參內臟團蛋白質提取率為響應值，設計四因素三水平的響應面優(yōu)化試驗。響應面試驗因素與水平編碼見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.3.5 氨基酸分析

參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》對冰島刺參內臟團蛋白質氨基酸的組成及含量進行測定。

1.3.6 數據處理

采用IBM SPSS Statistics 21軟件對單因素試驗結果進行顯著性差異分析；采用Origin 8.0軟件作圖；采用Design-Expert 11軟件進行響應面試驗設計及優(yōu)化分析；所有試驗均重復3次，試驗數據以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 牛血清白蛋白標準曲線

以牛血清白蛋白質量濃度（mg/mL）為橫坐標（x），吸光度（A）為縱坐標（y），繪制得到的標準曲線見圖1。

圖1 蛋白質標準曲線Fig.1 Protein standard curve

由標準曲線得到線性回歸方程：y=7.9317x+0.0195，R2=0.998 1，表明在質量濃度為0～0.10 mg/mL時，BSA標準溶液的質量濃度與吸光度線性關系良好。

2.2 單因素試驗結果分析

2.2.1 pH值對冰島刺參內臟團蛋白質提取率的影響

pH值對蛋白質提取率的影響見圖2。

由圖2可知，當溶液pH值處于8～11范圍內時，蛋白質提取率隨pH值的升高顯著上升（P＜0.05），這主要是因為在一定堿性環(huán)境下，pH值越高，溶液中蛋白質分子間的氫鍵越容易被破壞，從而減小蛋白質分子間的相互作用力，促進蛋白質與水分子結合，提高蛋白質的溶解度，從而使提取率增加；當pH值為11時，蛋白質提取率達到最大值81.35%；當pH值大于11時，蛋白質提取率顯著下降（P＜0.05），這可能是因為pH值過高容易使蛋白質發(fā)生變性，導致蛋白質出現脫氨、脫羧反應，產生沉淀，使蛋白質提取率降低，而且在高pH值條件下，冰島刺參內臟團蛋白質的顏色會因發(fā)生美拉德反應而加深，并且伴有刺鼻異味產生。綜上，pH值選取10、11、12進行優(yōu)化試驗。

圖2 pH值對蛋白質提取率的影響Fig.2 The effect of pH value on protein extraction rate

2.2.2料液比對冰島刺參內臟團蛋白質提取率的影響

料液比對蛋白質提取率的影響見圖3。

圖3 料液比對蛋白質提取率的影響Fig.3 The effect of material-to-liquid ratio on protein extraction rate

由圖3可知，隨著溶劑用量的增加，蛋白質提取率呈先上升后下降的趨勢。料液比從1∶25（g/mL）變至1∶40（g/mL），蛋白質提取率顯著上升（P＜0.05），當溶劑用量較小時，脫脂粉未完全溶解，溶液較為黏稠，不利于蛋白質溶出，而隨著溶劑用量的增加，溶質體系分布更加均勻，有利于蛋白質的充分溶解，蛋白質提取率增大；料液比達到1∶40（g/mL），蛋白質提取率達到最大值76.45%；當溶劑用量繼續(xù)增加，蛋白質提取率顯著下降（P＜0.05），這是因為在蛋白質含量一定的情況下，水分將蛋白質全部溶解后會溶解其他物質，導致蛋白質提取率下降。綜上，料液比選取1∶35、1∶40、1∶45（g/mL）進行優(yōu)化試驗。

2.2.3 超聲功率對冰島刺參內臟團蛋白質提取率的影響

超聲功率對蛋白質提取率的影響見圖4。

圖4 超聲功率對蛋白質提取率的影響Fig.4 The effect of ultrasonic power on protein extraction rate

由圖4可知，當超聲功率在50 W～80 W之間逐漸增加時，蛋白質提取率緩慢升高；當超聲功率為80 W時，蛋白質提取率達到最大值68.17%；當超聲功率大于80 W時，蛋白質提取率緩慢降低，但差異不顯著（P＞0.05）。這可能是因為當超聲功率從50 W增加到80 W時，海參內臟團細胞破碎，會使更多堿液滲透到細胞中，從而提高蛋白質提取率，但當超聲功率較大時，溫度上升，容易導致蛋白質變性，致使提取率降低。綜上，超聲功率選取80 W較為合適。

2.2.4 超聲溫度對冰島刺參內臟團蛋白質提取率的影響

超聲溫度對蛋白質提取率的影響見圖5。

圖5 超聲溫度對蛋白質提取率的影響Fig.5 The effect of ultrasonic temperature on protein extraction rate

由圖5可知，隨著超聲溫度的增加，蛋白質提取率呈先上升后下降的趨勢。當超聲溫度在20℃～60℃之間逐漸升高時，蛋白質提取率顯著增大（P＜0.05），這主要是因為溫度升高有利于蛋白質從細胞結構中溶出，增加其在水中的溶解度；當超聲溫度為60℃時，蛋白質的提取率達到最大值78.53%；繼續(xù)提高超聲溫度，蛋白質提取率顯著下降（P＜0.05），這是由于超聲溫度繼續(xù)上升，容易導致蛋白變性，氮溶解指數開始下降，從而降低了提取率。綜上，超聲溫度選取50、60、70℃進行優(yōu)化試驗。

2.2.5 超聲時間對冰島刺參內臟團蛋白質提取率的影響

超聲時間對蛋白質提取率的影響見圖6。

圖6 超聲時間對蛋白質提取率的影響Fig.6 The effect of ultrasound time on protein extraction rate

由圖6可知，當超聲時間為10 min～30 min時，蛋白質提取率隨超聲時間延長顯著增大（P＜0.05），這可能是因為在超聲空化效應的作用下，蛋白結構被破壞，使蛋白質在提取過程中更容易溶出，提取率增加；當超聲時間繼續(xù)延長時，提取率變化不顯著（P＞0.05），這可能是因為超聲時間過長，大部分蛋白質已被溶解出來，提取率變化趨于平緩。綜合考慮能耗成本問題，超聲時間選用20、30、40 min進行后續(xù)試驗。

2.3 響應面優(yōu)化試驗結果分析

2.3.1 響應面試驗設計及結果

綜合單因素試驗結果，以pH值、料液比、超聲溫度、超聲時間4個單因素為自變量，以蛋白質提取率為響應值，按照中心組合設計響應面試驗，試驗方案與結果見表2。

2.3.2 回歸模型的建立及方差分析

利用Design-Expert 11軟件對表2的試驗結果進行回歸分析，得到二次多項回歸方程：

表2 響應面試驗方案與結果Table 2 Design and results of response surface analysis test

Y=81.78+3.85A+1.43B-1.52C+3.50D+2.71AB+0.23AC-2.03AD-2.17BC-0.96BD+0.60CD-4.65A2-4.21B2-4.47C2-1.83D2。

對回歸模型進行方差分析，結果見表3。

由表3可知，模型P＜0.000 1，表示該模型極顯著；失擬項P=0.637 8＞0.05，不顯著，說明模型擬合程度好；模型相關系數R2=0.985 5，校正系數R2Adj=0.971 1，說明試驗結果與模型預測結果一致性良好，模型可靠，可用于冰島刺參內臟團蛋白質提取率的分析和預測。由F值可知，各因素對冰島刺參內臟團蛋白質提取率影響的主次順序為A pH值＞D超聲時間＞C超聲溫度＞B料液比。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of the regression model

2.3.3各因素交互作用分析

各因素交互作用對蛋白質提取率的影響的響應面圖和等高線圖見圖7～圖12。

圖7 pH值與料液比交互作用對蛋白質提取率的影響Fig.7 Effect of interaction between pH value and material-to-liquid ratio on protein extraction rate

圖8 pH值與超聲溫度交互作用對蛋白質提取率的影響Fig.8 The effect of interaction between pH value and ultrasonic temperature on protein extraction rate

圖9 pH值與超聲時間交互作用對蛋白質提取率的影響Fig.9 The effect of interaction between pH value and ultrasound time on protein extraction rate

圖10 料液比和超聲溫度交互作用對蛋白質提取率的影響Fig.10 The effect of the interaction of material-to-liquid ratio and ultrasonic temperature on protein extraction rate

圖11 料液比和超聲時間交互作用對蛋白質提取率的影響Fig.11 The effect of the interaction between the material-to-liquid ratio and the ultrasonic time on the protein extraction rate

圖12 超聲溫度和超聲時間交互作用對蛋白質提取率的影響Fig.12 The influence of the interaction of ultrasound temperature and ultrasound time on protein extraction rate

由圖7～圖12可知，pH值與料液比、pH值與超聲時間、料液比與超聲溫度、料液比與超聲時間的交互作用的響應曲面均較陡峭且等高線為橢圓形，說明這4個交互作用對蛋白質提取率的影響較大；圖8中等高線接近圓形，圖12中響應曲面較平緩，說明pH值與超聲溫度、超聲溫度與超聲時間的交互作用對蛋白質提取率的影響較小，與方差分析結果一致。

2.3.4 最佳工藝條件驗證試驗

利用Design-Expert 11軟件對響應面試驗結果進行分析，得到冰島刺參內臟團蛋白質提取的最佳工藝條件為 pH11.18，料液比 1∶40.8（g/mL），超聲溫度 57.6℃，超聲時間38.04 min，預測蛋白質提取率為83.81%。在最佳工藝條件下進行驗證試驗，為方便操作，將最佳工藝條件調整為 pH11.2，料液比 1∶41（g/mL），超聲溫度57.6℃，超聲時間38 min。進行3次驗證試驗，得到的蛋白質提取率均值為（82.87±0.12）%，與模型預測值的相對誤差為1.12%，說明模型與試驗結果相符，能夠較好地優(yōu)化冰島刺參內臟團蛋白質提取的工藝條件。

2.4 氨基酸分析

對冰島刺參內臟團蛋白質氨基酸的組成及含量進行測定，其結果見表4。

由表4可知，冰島刺參內臟團蛋白質中富含17種氨基酸，其中人體必需氨基酸含量占氨基酸總量的39.06%，亮氨酸和蘇氨酸含量最高，分別占氨基酸總量的7.86%和6.45%；鮮味氨基酸含量占氨基酸總量的40.89%，藥效氨基酸含量占氨基酸總量的64.30%；氨基酸分析結果表明，冰島刺參內臟團蛋白質氨基酸種類豐富，具有重要的食用價值，同時鮮味氨基酸含量較高，可作為鮮味復合調味品的重要原料。

表4 冰島刺參內臟團蛋白質的氨基酸組成及含量Table 4 Amino acid composition and content of visceral mass protein of Cucumaria frondosa

3 結論

本研究通過單因素試驗結合響應面法優(yōu)化得到超聲波輔助提取冰島刺參內臟團蛋白質的最佳工藝為 pH11.2，料液比 1∶41（g/mL），超聲溫度 57.6 ℃，超聲時間38 min，超聲功率80 W。在最優(yōu)條件下冰島刺參內臟團蛋白質提取率為（82.87±0.12）%，與預測值83.81%接近。此外，氨基酸分析表明，冰島刺參內臟團蛋白質中必需氨基酸、鮮味氨基酸和藥效氨基酸含量豐富，分別占氨基酸總量的39.06%、40.89%和64.30%，營養(yǎng)價值較高，是動物蛋白質的良好來源。對冰島刺參加工副產物內臟團蛋白提取的研究，有利于合理利用資源，提高冰島刺參的綜合利用價值，為冰島刺參深加工產業(yè)的發(fā)展提供技術參考。