高云龍，徐夢(mèng)豪，王晨瑩，趙祥忠*

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250353；2.山東中碩海洋科技有限公司，山東 日照 276800）

冰島刺參（Cucumaria frondosa）屬棘皮動(dòng)物門（Echinodermata）海參綱（Holothurcidea）枝手目（Dendrochirotida）瓜參科（Cucumariidae）海洋動(dòng)物[1]，主要分布在冰島、挪威及俄羅斯等國(guó)家附近海域[2]。冰島刺參富含蛋白質(zhì)、多糖、三萜糖苷、脂類等[3-8]活性物質(zhì)，具有抗癌、抗炎、降血糖、抗衰老和免疫調(diào)節(jié)等[9-14]多種功能活性。冰島刺參內(nèi)臟團(tuán)（含性腺、消化道、胃囊等）富含蛋白質(zhì)、氨基酸、脂質(zhì)等[15]，由于缺乏深層次的研究和利用，冰島刺參內(nèi)臟團(tuán)在冰島刺參初級(jí)加工過(guò)程中多被當(dāng)作下腳料處理，不僅無(wú)法有效提高冰島刺參的附加值，而且會(huì)造成資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。

常用的蛋白質(zhì)提取方法有堿溶酸沉法、酶解法、超聲波輔助提取法等[16]。堿溶酸沉法操作簡(jiǎn)單、成本較低，但其提取率也相對(duì)較低[17]；酶解法提取效率高，但酶制劑成本較高，不適用于工業(yè)化生產(chǎn)[18]；而超聲波輔助提取法具有提取周期短、提取充分、提取率高等優(yōu)點(diǎn)，可作為一種有效的蛋白質(zhì)提取技術(shù)[19]。本文采用超聲波輔助提取冰島刺參內(nèi)臟團(tuán)蛋白質(zhì)，通過(guò)單因素試驗(yàn)與Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定超聲波輔助提取冰島刺參內(nèi)臟團(tuán)蛋白質(zhì)的最佳工藝，并對(duì)在最佳工藝條件下提取出的蛋白質(zhì)進(jìn)行氨基酸分析，評(píng)價(jià)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，為冰島刺參內(nèi)臟團(tuán)蛋白質(zhì)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

冰島刺參內(nèi)臟團(tuán)（含性腺、消化道、胃囊等）：山東中碩海洋科技有限公司。

牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、考馬斯亮藍(lán)G250：北京索萊寶科技有限公司；氫氧化鈉：上海麥克林生化科技有限公司；鹽酸：煙臺(tái)遠(yuǎn)東精細(xì)化工有限公司。以上化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1000Y型多功能粉碎機(jī)：永康市鉑歐五金制品有限公司；DHG-9030A型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；KQ-100DE型超聲波清洗機(jī)：昆山市超聲儀器有限公司；TG16-WS型臺(tái)式高速離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；UV-9000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；SCIENTZ-18N型真空冷凍干燥機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；Rapid N型快速定氮儀：艾力蒙塔貿(mào)易（上海）有限公司；L-8900型高速氨基酸分析儀：日本日立有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

取適量冰島刺參內(nèi)臟團(tuán)凍品于真空冷凍干燥機(jī)，冷凍干燥48 h后取出，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，并通過(guò)亞臨界萃取技術(shù)脫除油脂，后置于60℃電熱鼓風(fēng)干燥箱干燥至恒重，過(guò)80目篩，得冰島刺參內(nèi)臟團(tuán)脫脂粉。

1.3.2 冰島刺參內(nèi)臟團(tuán)蛋白質(zhì)的提取

取適量脫脂粉，按一定料液比加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH值至10，設(shè)置超聲功率為50 W，超聲溫度為40℃，超聲輔助提取60 min；待冷卻至25℃后，5 000 r/min離心10 min，過(guò)濾，收集上清液，測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量；然后調(diào)節(jié)上清液pH值至3.0，靜置30 min沉淀蛋白質(zhì)，5 000 r/min離心10 min，保留沉淀，水洗3次沉淀脫去無(wú)機(jī)鹽等雜質(zhì)，加水復(fù)溶后調(diào)pH值至中性，離心取上清液，經(jīng)冷凍干燥后，即得冰島刺參內(nèi)臟團(tuán)蛋白質(zhì)，儲(chǔ)存于4℃冰箱中備用。

上清液中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：按照柳蔭等[20]的方法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)的含量。蛋白質(zhì)提取率按下列公式計(jì)算。

式中：M1為上清液中蛋白質(zhì)含量，g；M2為樣品中蛋白質(zhì)總含量，g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

在冰島刺參內(nèi)臟團(tuán)蛋白質(zhì)提取工藝中，固定提取條件：pH 值為 10、超聲功率為 50 W、料液比為 1∶25（g/mL）、超聲溫度為40℃、超聲時(shí)間為60 min；分別對(duì)pH值（8、9、10、11、12、13）、料液比[1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50（g/mL）]、超聲功率（50、60、70、80、90、100 W）、超聲溫度（20、30、40、50、60、70 ℃）、超聲時(shí)間（10、20、30、40、50、60 min）5 個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各因素對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用Design-Expert 11軟件，依據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇pH值、料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間4個(gè)因素為響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)中的關(guān)鍵因素，以冰島刺參內(nèi)臟團(tuán)蛋白質(zhì)提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平編碼見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.3.5 氨基酸分析

參照GB 5009.124—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測(cè)定》對(duì)冰島刺參內(nèi)臟團(tuán)蛋白質(zhì)氨基酸的組成及含量進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS Statistics 21軟件對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行顯著性差異分析；采用Origin 8.0軟件作圖；采用Design-Expert 11軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及優(yōu)化分析；所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

以牛血清白蛋白質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（x），吸光度（A）為縱坐標(biāo)（y），繪制得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Protein standard curve

由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到線性回歸方程：y=7.9317x+0.0195，R2=0.998 1，表明在質(zhì)量濃度為0～0.10 mg/mL時(shí)，BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度與吸光度線性關(guān)系良好。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 pH值對(duì)冰島刺參內(nèi)臟團(tuán)蛋白質(zhì)提取率的影響

pH值對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響見(jiàn)圖2。

由圖2可知，當(dāng)溶液pH值處于8～11范圍內(nèi)時(shí)，蛋白質(zhì)提取率隨pH值的升高顯著上升（P＜0.05），這主要是因?yàn)樵谝欢▔A性環(huán)境下，pH值越高，溶液中蛋白質(zhì)分子間的氫鍵越容易被破壞，從而減小蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，促進(jìn)蛋白質(zhì)與水分子結(jié)合，提高蛋白質(zhì)的溶解度，從而使提取率增加；當(dāng)pH值為11時(shí)，蛋白質(zhì)提取率達(dá)到最大值81.35%；當(dāng)pH值大于11時(shí)，蛋白質(zhì)提取率顯著下降（P＜0.05），這可能是因?yàn)閜H值過(guò)高容易使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)出現(xiàn)脫氨、脫羧反應(yīng)，產(chǎn)生沉淀，使蛋白質(zhì)提取率降低，而且在高pH值條件下，冰島刺參內(nèi)臟團(tuán)蛋白質(zhì)的顏色會(huì)因發(fā)生美拉德反應(yīng)而加深，并且伴有刺鼻異味產(chǎn)生。綜上，pH值選取10、11、12進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

圖2 pH值對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.2 The effect of pH value on protein extraction rate

2.2.2料液比對(duì)冰島刺參內(nèi)臟團(tuán)蛋白質(zhì)提取率的影響

料液比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 料液比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.3 The effect of material-to-liquid ratio on protein extraction rate

由圖3可知，隨著溶劑用量的增加，蛋白質(zhì)提取率呈先上升后下降的趨勢(shì)。料液比從1∶25（g/mL）變至1∶40（g/mL），蛋白質(zhì)提取率顯著上升（P＜0.05），當(dāng)溶劑用量較小時(shí)，脫脂粉未完全溶解，溶液較為黏稠，不利于蛋白質(zhì)溶出，而隨著溶劑用量的增加，溶質(zhì)體系分布更加均勻，有利于蛋白質(zhì)的充分溶解，蛋白質(zhì)提取率增大；料液比達(dá)到1∶40（g/mL），蛋白質(zhì)提取率達(dá)到最大值76.45%；當(dāng)溶劑用量繼續(xù)增加，蛋白質(zhì)提取率顯著下降（P＜0.05），這是因?yàn)樵诘鞍踪|(zhì)含量一定的情況下，水分將蛋白質(zhì)全部溶解后會(huì)溶解其他物質(zhì)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)提取率下降。綜上，料液比選取1∶35、1∶40、1∶45（g/mL）進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2.3 超聲功率對(duì)冰島刺參內(nèi)臟團(tuán)蛋白質(zhì)提取率的影響

超聲功率對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 超聲功率對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.4 The effect of ultrasonic power on protein extraction rate

由圖4可知，當(dāng)超聲功率在50 W～80 W之間逐漸增加時(shí)，蛋白質(zhì)提取率緩慢升高；當(dāng)超聲功率為80 W時(shí)，蛋白質(zhì)提取率達(dá)到最大值68.17%；當(dāng)超聲功率大于80 W時(shí)，蛋白質(zhì)提取率緩慢降低，但差異不顯著（P＞0.05）。這可能是因?yàn)楫?dāng)超聲功率從50 W增加到80 W時(shí)，海參內(nèi)臟團(tuán)細(xì)胞破碎，會(huì)使更多堿液滲透到細(xì)胞中，從而提高蛋白質(zhì)提取率，但當(dāng)超聲功率較大時(shí)，溫度上升，容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，致使提取率降低。綜上，超聲功率選取80 W較為合適。

2.2.4 超聲溫度對(duì)冰島刺參內(nèi)臟團(tuán)蛋白質(zhì)提取率的影響

超聲溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 超聲溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.5 The effect of ultrasonic temperature on protein extraction rate

由圖5可知，隨著超聲溫度的增加，蛋白質(zhì)提取率呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)超聲溫度在20℃～60℃之間逐漸升高時(shí)，蛋白質(zhì)提取率顯著增大（P＜0.05），這主要是因?yàn)闇囟壬哂欣诘鞍踪|(zhì)從細(xì)胞結(jié)構(gòu)中溶出，增加其在水中的溶解度；當(dāng)超聲溫度為60℃時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率達(dá)到最大值78.53%；繼續(xù)提高超聲溫度，蛋白質(zhì)提取率顯著下降（P＜0.05），這是由于超聲溫度繼續(xù)上升，容易導(dǎo)致蛋白變性，氮溶解指數(shù)開(kāi)始下降，從而降低了提取率。綜上，超聲溫度選取50、60、70℃進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2.5 超聲時(shí)間對(duì)冰島刺參內(nèi)臟團(tuán)蛋白質(zhì)提取率的影響

超聲時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響見(jiàn)圖6。

圖6 超聲時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.6 The effect of ultrasound time on protein extraction rate

由圖6可知，當(dāng)超聲時(shí)間為10 min～30 min時(shí)，蛋白質(zhì)提取率隨超聲時(shí)間延長(zhǎng)顯著增大（P＜0.05），這可能是因?yàn)樵诔暱栈?yīng)的作用下，蛋白結(jié)構(gòu)被破壞，使蛋白質(zhì)在提取過(guò)程中更容易溶出，提取率增加；當(dāng)超聲時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)，提取率變化不顯著（P＞0.05），這可能是因?yàn)槌晻r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，大部分蛋白質(zhì)已被溶解出來(lái)，提取率變化趨于平緩。綜合考慮能耗成本問(wèn)題，超聲時(shí)間選用20、30、40 min進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以pH值、料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間4個(gè)單因素為自變量，以蛋白質(zhì)提取率為響應(yīng)值，按照中心組合設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)方案與結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.2 回歸模型的建立及方差分析

利用Design-Expert 11軟件對(duì)表2的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到二次多項(xiàng)回歸方程：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface analysis test

Y=81.78+3.85A+1.43B-1.52C+3.50D+2.71AB+0.23AC-2.03AD-2.17BC-0.96BD+0.60CD-4.65A2-4.21B2-4.47C2-1.83D2。

對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，模型P＜0.000 1，表示該模型極顯著；失擬項(xiàng)P=0.637 8＞0.05，不顯著，說(shuō)明模型擬合程度好；模型相關(guān)系數(shù)R2=0.985 5，校正系數(shù)R2Adj=0.971 1，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測(cè)結(jié)果一致性良好，模型可靠，可用于冰島刺參內(nèi)臟團(tuán)蛋白質(zhì)提取率的分析和預(yù)測(cè)。由F值可知，各因素對(duì)冰島刺參內(nèi)臟團(tuán)蛋白質(zhì)提取率影響的主次順序?yàn)锳 pH值＞D超聲時(shí)間＞C超聲溫度＞B料液比。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of the regression model

2.3.3各因素交互作用分析

各因素交互作用對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響的響應(yīng)面圖和等高線圖見(jiàn)圖7～圖12。

圖7 pH值與料液比交互作用對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.7 Effect of interaction between pH value and material-to-liquid ratio on protein extraction rate

圖8 pH值與超聲溫度交互作用對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.8 The effect of interaction between pH value and ultrasonic temperature on protein extraction rate

圖9 pH值與超聲時(shí)間交互作用對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.9 The effect of interaction between pH value and ultrasound time on protein extraction rate

圖10 料液比和超聲溫度交互作用對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.10 The effect of the interaction of material-to-liquid ratio and ultrasonic temperature on protein extraction rate

圖11 料液比和超聲時(shí)間交互作用對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.11 The effect of the interaction between the material-to-liquid ratio and the ultrasonic time on the protein extraction rate

圖12 超聲溫度和超聲時(shí)間交互作用對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.12 The influence of the interaction of ultrasound temperature and ultrasound time on protein extraction rate

由圖7～圖12可知，pH值與料液比、pH值與超聲時(shí)間、料液比與超聲溫度、料液比與超聲時(shí)間的交互作用的響應(yīng)曲面均較陡峭且等高線為橢圓形，說(shuō)明這4個(gè)交互作用對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響較大；圖8中等高線接近圓形，圖12中響應(yīng)曲面較平緩，說(shuō)明pH值與超聲溫度、超聲溫度與超聲時(shí)間的交互作用對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響較小，與方差分析結(jié)果一致。

2.3.4 最佳工藝條件驗(yàn)證試驗(yàn)

利用Design-Expert 11軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到冰島刺參內(nèi)臟團(tuán)蛋白質(zhì)提取的最佳工藝條件為 pH11.18，料液比 1∶40.8（g/mL），超聲溫度 57.6℃，超聲時(shí)間38.04 min，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)提取率為83.81%。在最佳工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，為方便操作，將最佳工藝條件調(diào)整為 pH11.2，料液比 1∶41（g/mL），超聲溫度57.6℃，超聲時(shí)間38 min。進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的蛋白質(zhì)提取率均值為（82.87±0.12）%，與模型預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為1.12%，說(shuō)明模型與試驗(yàn)結(jié)果相符，能夠較好地優(yōu)化冰島刺參內(nèi)臟團(tuán)蛋白質(zhì)提取的工藝條件。

2.4 氨基酸分析

對(duì)冰島刺參內(nèi)臟團(tuán)蛋白質(zhì)氨基酸的組成及含量進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知，冰島刺參內(nèi)臟團(tuán)蛋白質(zhì)中富含17種氨基酸，其中人體必需氨基酸含量占氨基酸總量的39.06%，亮氨酸和蘇氨酸含量最高，分別占氨基酸總量的7.86%和6.45%；鮮味氨基酸含量占氨基酸總量的40.89%，藥效氨基酸含量占氨基酸總量的64.30%；氨基酸分析結(jié)果表明，冰島刺參內(nèi)臟團(tuán)蛋白質(zhì)氨基酸種類豐富，具有重要的食用價(jià)值，同時(shí)鮮味氨基酸含量較高，可作為鮮味復(fù)合調(diào)味品的重要原料。

表4 冰島刺參內(nèi)臟團(tuán)蛋白質(zhì)的氨基酸組成及含量Table 4 Amino acid composition and content of visceral mass protein of Cucumaria frondosa

3 結(jié)論

本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化得到超聲波輔助提取冰島刺參內(nèi)臟團(tuán)蛋白質(zhì)的最佳工藝為 pH11.2，料液比 1∶41（g/mL），超聲溫度 57.6 ℃，超聲時(shí)間38 min，超聲功率80 W。在最優(yōu)條件下冰島刺參內(nèi)臟團(tuán)蛋白質(zhì)提取率為（82.87±0.12）%，與預(yù)測(cè)值83.81%接近。此外，氨基酸分析表明，冰島刺參內(nèi)臟團(tuán)蛋白質(zhì)中必需氨基酸、鮮味氨基酸和藥效氨基酸含量豐富，分別占氨基酸總量的39.06%、40.89%和64.30%，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，是動(dòng)物蛋白質(zhì)的良好來(lái)源。對(duì)冰島刺參加工副產(chǎn)物內(nèi)臟團(tuán)蛋白提取的研究，有利于合理利用資源，提高冰島刺參的綜合利用價(jià)值，為冰島刺參深加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供技術(shù)參考。