孟晶晶，張志威，周文喜，倪娜，趙汝，李華，王華*

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)與食品學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028043；2.通遼市農(nóng)牧科學(xué)研究所，內(nèi)蒙古 通遼 028015）

蕎麥?zhǔn)寝た剖w麥屬的雙子葉作物，其含有的黃酮類化合物除具有良好的降血壓、降血脂、降血糖功效外還具有抗氧化、增強(qiáng)免疫力等生物活性，在食品、藥品等領(lǐng)域具有良好的開發(fā)前景[1-4]。有研究表明蕎麥的籽粒以及殼、莖、花、葉中均含有黃酮類化合物，其中主要成分為蘆丁，約占黃酮類化合物的70%～90%[5-7]。孫坤坤[8]研究發(fā)現(xiàn)苦蕎麥不同部位的黃酮含量不同，其中多以蕎麥粉和蕎麥殼為原料研究蕎麥中黃酮類化合物的提取[9-12]。目前常用的黃酮類化合物的提取方法主要有微波輔助提取、超聲輔助提取、有機(jī)溶劑提取、水浸提、堿浸提和酶法提取等[13-15]，其中超聲輔助提取因具有溶劑用量少、提取率高且產(chǎn)物不受高溫影響等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用[16-17]。

內(nèi)蒙古通遼市庫倫旗種植蕎麥歷史悠久，其產(chǎn)量約占全國的四分之一，享有“中國蕎麥之鄉(xiāng)”的佳譽(yù)。為進(jìn)一步發(fā)展通遼地區(qū)蕎麥深加工產(chǎn)業(yè)，本文采用Box-Behnken試驗設(shè)計對超聲輔助提取蕎麥總黃酮工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對通遼主要栽培種植的7個蕎麥品種的殼、全麥粉和芽粉總黃酮得率及抗氧化活性進(jìn)行測定，以期為通遼地區(qū)蕎麥深加工提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設(shè)備

蕎麥：大黑三棱、小黑三棱、通蕎1號、赤甜蕎1號、庫倫2號、赤苦蕎1號、珠日河苦蕎7個品種，均為通遼市農(nóng)牧科學(xué)研究所提供。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：合肥博美生物科技有限公司；甲醇、乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉（均為分析純）：天津大茂試劑有限公司。

SA224S電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；H-H26S數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇大地自動化儀器廠；DHG-9203A恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗設(shè)備有限公司；KQ-5200DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；T6紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品總黃酮提取工藝

工藝流程：蕎麥（殼、全粒、芽）→粉碎（過60目篩）→加入乙醇→超聲輔助提取→離心→濃縮。

1.2.2 總黃酮的含量測定及計算

用30%乙醇溶液將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品分別配制成濃度為 0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，在波長510 nm處測定各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到線性回歸方程Y=8.94X-0.002 3，R2=0.996 8。

1.2.3 總黃酮得率的計算

將得到的總黃酮提取液在4000r/min下離心10min，取上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮后用30%乙醇溶液定容至25.0 mL容量瓶、搖勻，即得到濃縮液。取2.0 mL該濃縮液并按標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作方法測定吸光度，按照下列公式計算總黃酮得率。

1.3 體外抗氧化活性測定

DPPH自由基清除率和ABTS+自由基清除率測定分別參照Guedes等[18]的測定方法。

1.4 單因素試驗

單因素試驗和響應(yīng)面優(yōu)化試驗以7個品種中的珠日河苦蕎殼作為試驗材料。

1.4.1 提取溶劑濃度的確定

分別選取乙醇溶液的濃度為30%、40%、50%、60%、70%、80%進(jìn)行提取，并計算總黃酮得率以確定最佳的乙醇濃度。

1.4.2 單因素提取條件的確定

分別考察提取時間（40、60、80、100、120 min）、料液比[1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70（g/mL）]、提取溫度（50、60、70、80、90、100 ℃）及超聲頻率（20、40、60、80、100 kHz）對總黃酮得率的影響。

1.5 Box-Behnken試驗設(shè)計

根據(jù)單因素的試驗結(jié)果，采用Box-Behnken試驗設(shè)計方法，以總黃酮得率為響應(yīng)值，運(yùn)用L9（34）響應(yīng)面分析優(yōu)化提取工藝，其因素水平設(shè)計如表1所示。

表1 Box-Behnken試驗因素水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken test

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Design-Expert8.0、Microsoft Excel 2007和 O-rigin 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并繪圖，單因素試驗、響應(yīng)面優(yōu)化試驗均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 提取溶劑濃度的確定

提取溶劑濃度對總黃酮得率的影響見圖1。

圖1 提取溶劑濃度對總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of extraction solvent concentration on the yield of total flavonoids

從圖1可以看出，當(dāng)使用70%乙醇溶液作為提取溶劑時總黃酮得率最高，為3.50%，乙醇溶液濃度高于70%后得率反而降低，可能是由于隨著乙醇濃度的提高，其它脂溶及醇溶性物質(zhì)與黃酮類物質(zhì)競爭性溶出，導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)溶出減少。這與相關(guān)研究得到的乙醇提取蕎麥黃酮的最佳濃度為65%～80%結(jié)論一致[19]。

2.1.2 提取溫度的確定

提取溫度對總黃酮得率的影響見圖2。

圖2 提取溫度對總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids

由圖2可知，提取溫度低于80℃時，隨著提取溫度的升高總黃酮得率也隨之緩慢增大。這可能是由于溫度的升高加速了分子的運(yùn)動，使總黃酮在乙醇中的溶解度隨著溫度的升高而增大，提取溫度高于80℃后，黃酮類物質(zhì)的活性成分易被破壞，而且乙醇溶劑在高溫下易揮發(fā)損失。因此，選擇提取溫度為70、80、90℃進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.1.3 料液比的確定

料液比對總黃酮得率的影響見圖3。

由圖3可知，料液比為1∶50（g/mL）時，總黃酮得率最高，料液比過低或過高均會使總黃酮得率降低，故選擇料液比為 1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）進(jìn)行后續(xù)試驗。

圖3 料液比對總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of material-to-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids

2.1.4 超聲頻率的確定

超聲頻率對總黃酮得率的影響見圖4。

圖4 超聲頻率對總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of supersonic frequency on the extraction rate of total flavonoids

由圖4可以得出，當(dāng)超聲頻率由20 kHz增大到100 kHz時，總黃酮得率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當(dāng)超聲頻率為60 kHz時，總黃酮得率最高，可達(dá)4.44%，故選擇超聲頻率40、60、80 kHz進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.1.5 提取時間的確定

提取時間對總黃酮得率的影響見圖5。

圖5 提取時間對總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the extraction rate of total flavonoids

從圖5可以看出，提取時間在40 min～80 min，總黃酮得率呈上升趨勢且上升幅度較大，在80 min時總黃酮得率達(dá)到最大值5.18%。提取時間超過80 min后總黃酮得率下降，可能是因為提取時間較長造成總黃酮的部分分解。因此選擇提取時間60、80、100 min進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化蕎麥總黃酮提取工藝

2.2.1 優(yōu)化蕎麥總黃酮提取工藝的響應(yīng)面試驗及方差分析

蕎麥總黃酮提取工藝優(yōu)化的Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 The design and results of Box-Behnken response surface test

通過Design-Expert8.0軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，得到多元二次回歸方程：Y=4.29+0.21A+0.33B+0.19C+0.29D+0.027AB-0.010AC-0.24AD+0.20BC-0.33BD+0.48CD-0.39A2-0.44B2-0.31C2-0.25D2。

蕎麥總黃酮提取工藝優(yōu)化方差分析結(jié)果見表3。

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

由表 3 可以看出，A、B、C、D、AD、BD、CD、A2、B2、C2、D2對總黃酮得率的影響顯著，各因素影響總黃酮得率的先后順序為料液比＞超聲頻率＞提取時間＞提取溫度?；貧w模型P＜0.000 1，表明該模型極顯著；同時，回歸模型的失擬項不顯著（P＞0.05），R2Adj=93.34%，說明93.34%的數(shù)據(jù)都可以用該回歸模型解釋。

2.2.2 兩因素交互作用影響提取工藝的響應(yīng)面分析

提取時間、料液比、提取溫度和超聲頻率兩兩交互作用對總黃酮得率的影響結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，料液比與超聲頻率交互作用、提取溫度與超聲頻率交互作用、提取時間與超聲頻率交互作用的曲面都有極大值，坡面較陡峭，且等高線圖均呈橢圓形，說明這3組交互作用對蕎麥總黃酮得率的影響顯著，這與表3顯著性分析結(jié)果一致。

圖6 各因素交互作用對總黃酮得率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 The response surface of interaction factors onextraction yield of total flavonoids

2.3 驗證試驗

經(jīng)Design-Expert8.0軟件預(yù)測可得最優(yōu)提取工藝為料液比 1∶50（g/mL），提取時間 85.5 min，提取溫度85.2℃，超聲頻率72 kHz，此時總黃酮得率為4.92%?？紤]到實(shí)際操作方便，調(diào)整最優(yōu)提取工藝參數(shù)為料液比 1∶50（g/mL），提取時間 86 min，提取溫度 85 ℃，超聲頻率72 kHz。為了檢驗回歸模型預(yù)測的可靠性，在預(yù)測條件下重復(fù)試驗，得到總黃酮得率為4.94%，測定值與預(yù)測值之間的相對誤差為0.02%，與預(yù)測值基本一致。

2.4 樣品總黃酮得率及抗氧化活性分析

對通遼市常年種植的7個蕎麥品種的殼粉、全麥粉和芽粉中的總黃酮按照最優(yōu)工藝提取并對比，其結(jié)果如表4所示。

表4 最優(yōu)提取工藝總黃酮得率及抗氧化活性測定Table 4 Determination of total flavonoid yield and antioxidant activity of optimal extraction process

由表4可知，經(jīng)最優(yōu)提取工藝得到的總黃酮對DPPH、ABTS+自由基均具有較好的清除作用，其清除率呈劑量依賴關(guān)系，即自由基清除率隨著總黃酮得率的提高而增大，其中珠日河苦蕎芽粉的總黃酮得率最高，優(yōu)化后可達(dá)（5.13±0.08）%，其DPPH自由基清除率可達(dá)（94.79±2.58）%、ABTS+自由基清除率可達(dá)（96.92±2.58）%。從測定結(jié)果可以得到7個品種中以珠日河苦蕎芽粉黃酮的抗氧化能力較強(qiáng)，與石磊等[20]研究的苦蕎芽粉中黃酮含量高于籽粒的結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本文采用Box-Behnken試驗設(shè)計，選擇提取時間（A）、料液比（B）、提取溫度（C）與超聲頻率（D）進(jìn)行L9（34）的響應(yīng)面分析對超聲輔助提取蕎麥總黃酮工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)提取工藝：以70%的乙醇溶液作為提取溶劑，料液比 1∶50（g/mL），提取時間為 86 min，提取溫度為85℃和超聲頻率為72 kHz，此時理論總黃酮得率最高為4.92%與實(shí)際結(jié)果4.94%基本一致，相對誤差僅為0.02%。采用最優(yōu)工藝對通遼市主要種植的7個蕎麥品種的黃酮進(jìn)行提取并測定黃酮的DPPH自由基清除率和ABTS+自由基清除率，得到7個品種中以珠日河苦蕎芽粉的總黃酮得率最高，為（5.13±0.08）%，其DPPH、ABTS+自由基清除率分別可達(dá)（94.79±2.58）%和（96.92±2.58）%。