楊紅文，彭福潤(rùn)

（閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，福建 漳州 363000）

金銀花，又名金藤花，是忍冬科忍冬屬植物的干燥花蕾，有宣散風(fēng)熱、抗菌消炎、免疫調(diào)節(jié)等作用，是傳統(tǒng)的中藥材，是連花清瘟膠囊、金花清感顆粒、雙黃連等多種清火中藥處方的組分。綠原酸為金銀花主要活性成分[1]，綠原酸含量多少是判斷金銀花質(zhì)量好壞的重要指標(biāo)[2]，綠原酸具有降血壓、降血脂、抗菌、抗病毒、抗腫瘤和清除自由基等作用[3-8]，在醫(yī)藥、保健、食品等行業(yè)具有很大的應(yīng)用價(jià)值。

水提法和有機(jī)溶劑浸提法是金銀花中綠原酸提取的兩種傳統(tǒng)方法，前者耗時(shí)長(zhǎng)、效率低、雜質(zhì)多[9]，后者雖然耗時(shí)短、提取率高、雜質(zhì)少，但存在有機(jī)溶劑殘留問(wèn)題[10]。纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分，纖維素酶可以降解植物細(xì)胞壁纖維素，促使活性成分溶出，提高其得率，還能避免水提法的高溫對(duì)活性成分的破壞[11]。本試驗(yàn)首次采用纖維素酶提取金銀花中的綠原酸，在探討纖維素酶添加量、pH值、提取溫度、提取時(shí)間和料液比對(duì)提取率影響的基礎(chǔ)上，采用正交優(yōu)化得出最佳提取工藝，并以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照，采用鐵離子還原法和羥自由基清除試驗(yàn)確定所得金銀花綠原酸提取液的體外抗氧化活性，為金銀花中綠原酸的活性研究及其在醫(yī)藥、食品中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金銀花（產(chǎn)地安徽省蕪湖）：蕪湖市徽福茶葉有限公司；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥98%）：合肥博美生物科技有限公司；纖維素酶（粉末制劑，酶活≥15 000 U/g）、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯乙酸、水楊酸、雙氧水、硫酸亞鐵、抗壞血酸（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

FW100型萬(wàn)能粉碎機(jī)：天津泰斯特儀器有限公司；TP-114型電子分析天平：上海精天電子儀器公司；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國(guó)華電器有限公司；UV-1100PC型紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)：廈門(mén)精藝興業(yè)科技有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水真空泵：河南省予華儀器有限公司；DHG-101-4A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏儀器設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精確稱取5.0 mg綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，置于50 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇溶解并定容至刻度線，再吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別用無(wú)水乙醇稀釋并定容至10 mL，得到 0、2、4、6、8、10mg/L 系列濃度的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)液。以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)328nm下測(cè)定吸光度[12]。以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)液濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程y=0.043 2x+0.001 3，R2=0.999 2。

1.2.2 金銀花綠原酸的提取及含量測(cè)定

將金銀花樣品經(jīng)60℃烘干至恒重后粉碎過(guò)80目篩備用，用電子分析天平準(zhǔn)確稱取1.0 g金銀花粉末，放入50 mL錐形瓶中，加入適量蒸餾水并輕輕攪拌，靜置30 min后加入一定量50℃活化15 min的纖維素酶，調(diào)節(jié)pH值，置于特定溫度的恒溫水浴鍋中提取一定時(shí)間。提取液經(jīng)真空抽濾兩次合并濾液，用蒸餾水定容至100 mL，準(zhǔn)確量取1 mL，用蒸餾水稀釋并定容至50 mL，得到待測(cè)液，于328 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算綠原酸濃度，并按下式計(jì)算綠原酸提取率。

式中：C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的綠原酸濃度，mg/L；N 為稀釋倍數(shù)，50；V 為提取液總體積，0.1 L；M為金銀花粉末質(zhì)量，1 g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)

分別對(duì)提取溫度（30、40、50、60、70 ℃）、提取時(shí)間（30、40、50、60、70 min）、料液比[1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL）]、纖維素酶添加量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、pH 值（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，研究各因素對(duì)金銀花綠原酸提取率的影響，并選擇提取溫度、提取時(shí)間、纖維素酶添加量、pH值進(jìn)行四因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)，確定金銀花綠原酸提取的最佳工藝參數(shù)。

1.2.4 鐵離子還原能力測(cè)定

參考浦躍武等[13]的方法略作修改，將綠原酸提取液減壓蒸發(fā)濃縮后用蒸餾水稀釋制備成0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL濃度梯度，并分別吸取2 mL加入6支試管；再向每支試管分別加入磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH6.6）及1%鐵氰化鉀溶液各2 mL，振蕩混勻并于50℃水浴20 min，置于冰盆中快速冷卻終止反應(yīng)，各加入2 mL 10%三氯乙酸溶液，輕輕振蕩混合均勻，各取2 mL置于6支新試管，再向新試管中分別加入2 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，26℃靜置10 min。以不添加綠原酸提取液的反應(yīng)液為空白對(duì)照調(diào)零，700 nm處測(cè)定吸光值，以維生素C作為對(duì)照。

1.2.5 羥自由基清除率測(cè)定

參考羅敏等[14]的方法略作修改，將制備的0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 綠原酸提取液 2 mL 分別加入6支試管，向每支試管加入硫酸亞鐵溶液（8 mmol/L）和水楊酸-乙醇溶液（8 mmol/L）各2 mL，再各加入2 mL雙氧水（8.8 mmol/L），同時(shí)設(shè)置以蒸餾水替代雙氧水的本底對(duì)照，輕輕振蕩混勻，26℃靜置45 min進(jìn)行羥自由基清除試驗(yàn)，510 nm處測(cè)吸光值，按下式計(jì)算羥自由基清除率。以維生素C作為對(duì)照。

式中：A空白為不添加綠原酸提取液的空白對(duì)照吸光值；A樣品為加不同濃度綠原酸提取液后的吸光值；A本底為蒸餾水替代顯色劑雙氧水的本底對(duì)照吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溫度對(duì)綠原酸提取率的影響

在料液比1∶25（g/mL）、纖維素酶添加量0.3%、pH5.0、提取時(shí)間50 min時(shí)，提取溫度對(duì)綠原酸提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 提取溫度對(duì)綠原酸提取率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the yield of chlorogenic acid

從圖1中可以看出，在30℃～70℃溫度范圍內(nèi)，金銀花綠原酸提取率呈先升后降的趨勢(shì)，在50℃時(shí)提取率最大。提取溫度低于50℃時(shí)，纖維素酶活性隨溫度升高而增加，加速了金銀花細(xì)胞壁纖維素的降解，同時(shí)分子熱運(yùn)動(dòng)加劇及綠原酸溶解度升高，綠原酸溶出加速，提取率升高。當(dāng)提取溫度超過(guò)50℃后，纖維素酶活性下降，金銀花細(xì)胞壁纖維素降解程度減弱，綠原酸溶出減少，且隨著提取溫度進(jìn)一步升高，綠原酸更易被氧化[15]，提取率下降。因此選擇提取溫度40、50、60℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2 提取時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響

在料液比1∶25（g/mL）、纖維素酶添加量0.3%、pH5.0、提取溫度50℃時(shí)，提取時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 提取時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the yield of chlorogenic acid

從圖2中可以看出，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，纖維素酶對(duì)金銀花細(xì)胞壁纖維素分解更加充分，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，綠原酸溶出增多，提取率升高，50 min時(shí)，提取率達(dá)到最高。繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，提取率不升反降，可能是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間提取，金銀花綠原酸溶出基本達(dá)到平臺(tái)期，且長(zhǎng)時(shí)間較高溫提取，綠原酸氧化破壞加劇，使綠原酸提取率下降[16]，也可能是綠原酸在有光條件下更容易分解，導(dǎo)致綠原酸提取率下降[17]。因此選擇提取時(shí)間40、50、60 min進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3 料液比對(duì)綠原酸提取率的影響

在纖維素酶添加量0.3%、pH5.0、提取溫度50℃、提取時(shí)間50 min時(shí)，料液比對(duì)綠原酸提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 料液比對(duì)綠原酸提取率的影響Fig.3 Effect of solid liquid ratio on the yield of chlorogenic acid

從圖3中可以看出，金銀花綠原酸提取率隨溶劑體積增加逐漸增大，料液比1∶30（g/mL）時(shí)提取率達(dá)到最大，之后略有下降。在一定范圍內(nèi)，隨著溶劑體積增加，金銀花中綠原酸溶出增加，提取率上升，液料比達(dá)到1∶30（g/mL）時(shí)，金銀花中綠原酸溶出基本完全，不再隨著溶劑體積增加而更多溶出，反而會(huì)隨著溶劑體積增加，pH值有所上升，導(dǎo)致綠原酸部分水解，提取率略有下降[17]。但整體看，料液比對(duì)綠原酸提取率影響并不明顯，因此選取料液比為1∶30（g/mL），不再進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

2.4 纖維素酶添加量對(duì)綠原酸提取率的影響

在料液比 1∶25（g/mL）、提取溫度 50 ℃時(shí)、pH5.0、提取時(shí)間50 min，纖維素酶添加量分別為金銀花質(zhì)量的0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%時(shí)，探究纖維素酶添加量對(duì)綠原酸提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

從圖4中可以看出，隨著纖維素酶添加量增加，金銀花綠原酸提取率逐漸升高，當(dāng)纖維素酶添加量為0.4%時(shí)提取率達(dá)到38.62 mg/g，之后隨著纖維素酶添加量增加，提取率不再升高。0.4%的纖維素酶添加量對(duì)金銀花細(xì)胞壁纖維素的酶解已基本飽和[18]。因此選擇纖維素酶添加量0.3%、0.4%、0.5%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖4 纖維素酶添加量對(duì)綠原酸提取率的影響Fig.4 Effect of cellulase dosage on the yield of chlorogenic acid

2.5 pH值對(duì)綠原酸提取率的影響

在料液比 1∶25（g/mL）、纖維素酶添加量 0.3%、提取溫度50℃、提取時(shí)間50 min時(shí)，提取液的pH值對(duì)綠原酸提取率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 pH值對(duì)綠原酸提取率的影響Fig.5 Effect of pH value on the yield of chlorogenic acid

從圖5中可以看出，提取最佳pH值為4.5，此時(shí)提取率最高，達(dá)40.02 mg/g，pH值升高或下降，提取率均降低。纖維素酶的最適pH值在5.0左右，而綠原酸在pH3.0時(shí)最穩(wěn)定，分解最少[19]，綜合看來(lái)，pH4.5左右能夠兼顧酶的最大催化活性和綠原酸的穩(wěn)定性。因此選擇pH值為4.0、4.5、5.0進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.6 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1。

從表 1 中可以看出，極差 RC＞RA＞RB＞RD，故影響纖維素酶法提取金銀花中綠原酸的因素次序：纖維素酶添加量＞提取溫度＞提取時(shí)間＞pH值，最優(yōu)提取條件組合為A2B2C2D2，而最優(yōu)組合未出現(xiàn)在正交試驗(yàn)組中，按照最佳組合的提取條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，6次平行驗(yàn)證試驗(yàn)得到綠原酸提取率均值為（40.10±0.34）mg/g，高于正交試驗(yàn)實(shí)際最優(yōu)組合（39.65 mg/g），且重復(fù)性良好，故纖維素酶提取金銀花中綠原酸的最佳組合條件為提取溫度50℃、提取時(shí)間50 min、纖維素酶添加量0.4%、pH4.5。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of orthogonal test

2.7 金銀花綠原酸提取液的鐵離子還原能力

金銀花綠原酸提取液鐵離子還原能力見(jiàn)圖6。

圖6 綠原酸提取液鐵離子還原能力Fig.6 Ferric ion reducing capacity of chlorogenic acid extract

從圖6中可以看出，在質(zhì)量濃度0～0.5 mg/mL范圍內(nèi)，金銀花綠原酸提取液和維生素C均可還原鐵離子形成普魯士藍(lán)，且都呈現(xiàn)劑量效應(yīng)，在相同質(zhì)量濃度下，金銀花綠原酸提取液還原鐵離子的能力比維生素C強(qiáng)。金銀花綠原酸提取液對(duì)鐵離子的強(qiáng)還原性可能和其分子內(nèi)的鄰苯二酚結(jié)構(gòu)更容易提供氫質(zhì)子或電子有關(guān)[20]。

2.8 金銀花綠原酸提取液的羥自由基清除能力

金銀花中綠原酸提取液的羥自由基清除能力見(jiàn)圖7。

圖7 綠原酸提取液對(duì)羥自由基的清除率Fig.7 Hydroxyl radical scavenging rate of chlorogenic acid

從圖7中可以看出，金銀花中綠原酸提取液和維生素C都有較強(qiáng)的羥自由基清除能力，且呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)，但在各質(zhì)量濃度下，金銀花綠原酸提取液的羥自由基清除率均高于維生素C，0.5 mg/mL的綠原酸提取液羥自由基清除率達(dá)44.51%，明顯高于相同濃度維生素C的清除率（28.48%），金銀花提取液的較高的羥自由基清除率也和其鄰苯二酚結(jié)構(gòu)有關(guān)[20]。

3 結(jié)論

纖維素酶法提取金銀花中綠原酸最佳工藝為提取溫度50℃、提取時(shí)間50 min、纖維素酶添加量0.4%、pH4.5，此條件下綠原酸提取率為40.10 mg/g；所得綠原酸提取液對(duì)鐵離子還原能力和羥自由基清除率均高于相同濃度維生素C。