宋璇，王汝華，于建麗，張睿，王志偉，萬守朋，李超，

（1.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2.食品生物技術(shù)教育部工程研究中心（天津科技大學(xué)），天津 300457；3.天津食品集團(tuán)有限公司，天津 300074）

山楂（Crataegus pinnatifida Bunge）栽培歷史久遠(yuǎn)，在我國(guó)已有兩千多年的食用和藥用歷史。山楂葉中含有豐富的黃酮類化合物、三萜類化合物、有機(jī)酸、維生素、生物堿等活性成分，具有極高利用價(jià)值[1-2]。研究表明，山楂葉提取物在調(diào)節(jié)血糖血脂、抗心肌缺血、抗動(dòng)脈粥樣硬化及抗氧化等方面具有特殊功效[3-4]，以牡荊素及其糖苷、金絲桃苷、槲皮素等物質(zhì)為代表的黃酮類化合物為其主要活性成分[5-7]。本研究以山楂葉為研究對(duì)象，利用超聲輔助提取法制備黃酮類化合物，探究其體外抗氧化活性，為山楂葉黃酮（hawthorn leaf flavonoids，HLF）作為食品功能因子的開發(fā)和應(yīng)用提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂葉：天津薊州山區(qū)；蘆丁（HPLC≥98%）、氯化四唑氮藍(lán)（nitroblue-tetrazolium，NBT）、吩嗪硫酸甲酯（phenazine methyl sulfate，PMS）；還原型輔酶Ⅰ二鈉（NADH-Na2）：北京索萊寶科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine ，DPPH）、2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2，2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）、鐵氰化鉀、抗壞血酸（ascorbic acid，VC）、水楊酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無水乙醇：天津市江天化工有限公司，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)（TGL-21）：四川蜀科儀器有限公司；紫外可見分光光度計(jì)（UV-5100B）：上海元析儀器有限公司；酶標(biāo)儀（Multiskan FC）：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；超聲波清洗機(jī)（JP-031）：潔盟清洗設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 HLF的制備

取適量樣品加5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL，放置6 min，隨后與0.4 mL 10%的硝酸鋁溶液混合6 min，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液4 mL，用60%乙醇溶液定容至10 mL，室溫（25℃）下反應(yīng)15 min，測(cè)量OD500。以吸光度為縱坐標(biāo)，黃酮濃度為橫坐標(biāo)，得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.112 9x-0.004 154（R2=0.999）。

將100g低溫烘干山楂葉粉碎，過60目篩。采用超聲輔助提取法，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)（40%、50%、60%、70%、80%、90%）、料液比[1∶2、1∶6、1∶10、1∶14、1∶18（g/mL）]、提取時(shí)間（40、80、120、160、180 min）及提取溫度（20、30、40、50、60℃）為研究對(duì)象，以黃酮提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，提取率計(jì)算公式如下。

式中：Y 為黃酮提取率，%；m1為黃酮質(zhì)量，g；m2為山楂葉質(zhì)量，g。

根據(jù)單因素試驗(yàn)，采用Design-Expert（10.0.7）軟件中的Box-Benhnken Design設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)方案，優(yōu)化提取工藝。試驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 自變量因素水平及編碼Table 1 Factor，level and code of independent variable

1.3.2 AB-8大孔吸附樹脂純化HLF

醇提物于4℃條件下冷藏24 h，再經(jīng)過抽濾除雜、減壓濃縮得到山楂葉粗提物。通過靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)選擇樹脂，并經(jīng)過動(dòng)態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)明確最優(yōu)純化工藝。

1.3.3 HLF的抗氧化活性

參考Oyaizu等[8]的方法，檢測(cè)不同濃度下HLF的總還原力，以“μg/mL VC當(dāng)量”表示。根據(jù)Quaresma等[9]方法探究不同濃度下HLF清除DPPH·的能力；根據(jù)Xu等[10]研究方法，研究不同濃度下HLF清除ABTS+·的能力；參考萬聆[11]試驗(yàn)方法，以NADH/PMS體系評(píng)價(jià)不同濃度下HLF清除O2-·的能力，根據(jù)Wang等[12]方法稍作修改，探究不同濃度下HLF對(duì)于·OH的清除能力。以蘆丁為陽性對(duì)照，空白組以等體積超純水代替樣品，背景組以等體積超純水代替除樣品外其余溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素優(yōu)化

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮提取率的影響

以乙醇體積分?jǐn)?shù)為自變量，黃酮提取率為因變量探究?jī)烧咧g的關(guān)系，試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

如圖1所示，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)提高黃酮提取率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，在60%達(dá)到峰值。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是山楂葉黃酮一般以黃酮苷的形式存在，在一定范圍內(nèi)增加乙醇濃度，可以通過破壞氫鍵和疏水作用力來提高游離黃酮含量[13]，因此選擇60%乙醇為HLF提取劑。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮提取率影響Fig.1 Influence of ethanol volume fraction on extraction yield of flavonoids

2.1.2 料液比對(duì)黃酮提取率的影響

通過改變料液比，探究提取劑用量對(duì)黃酮提取率的影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 料液比對(duì)黃酮提取率影響Fig.2 Influence of material liquid ratio on extraction yield of flavonoids

如圖2所示，在試驗(yàn)中增大提取劑添加量，可以促進(jìn)固液兩相接觸，降低黃酮類化合物溶出阻力，提升傳質(zhì)速率，在料液比為1∶14（g/mL）時(shí)，黃酮提取率達(dá)到最大值，（6.65±0.16）%。此時(shí)若繼續(xù)添加溶劑，不僅會(huì)使細(xì)胞外滲透壓升高，降低黃酮相對(duì)濃度；還會(huì)造成資源浪費(fèi)并增加后續(xù)樣品處理難度，因此選擇1∶14（g/mL）作為最佳料液比。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響

超聲波在液體中傳播會(huì)形成巨大壓力，這種作用力可以破壞植物細(xì)胞壁，使胞內(nèi)有效物質(zhì)快速釋放，因此探究超聲輔助提取時(shí)間是優(yōu)化提取工藝的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，試驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率影響Fig.3 Influence of extracting time on extraction yield of flavonoids

結(jié)合Noyes-Whitney方程[14]和圖3可知，提取時(shí)間為40min～120 min時(shí)，山楂葉黃酮提取率與提取時(shí)間呈正相關(guān)，并在120 min處達(dá)到最大值，隨后提取率隨時(shí)間增大而下降。這說明長(zhǎng)時(shí)間超聲處理會(huì)破壞部分黃酮結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致熱敏組分降解轉(zhuǎn)化，因此選擇120 min為最佳提取時(shí)間。

2.1.4 提取溫度對(duì)黃酮提取率的影響

黃酮提取率隨提取溫度變化趨勢(shì)見圖4。

圖4 提取溫度對(duì)黃酮提取率影響Fig.4 Influence of temperature on extraction yield of flavonoids

如圖4所示，提取溫度在20℃～60℃時(shí)，提取率隨溫度的升高而顯著增大，50℃時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，繼續(xù)升溫黃酮提取率有所下降。適當(dāng)提升溶劑溫度可加速布朗運(yùn)動(dòng)并改變?nèi)苜|(zhì)擴(kuò)散系數(shù)，同時(shí)也可增強(qiáng)植物細(xì)胞壁滲透性、提高黃酮類化合物溶解度。但是，溫度過高會(huì)引發(fā)HLF氧化降解并加速溶劑揮發(fā)，進(jìn)而影響黃酮的提取。因此，本試驗(yàn)選取50℃為最佳提取溫度。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）、提取溫度（D）為自變量，黃酮提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平的Box-Benhnken試驗(yàn)，響應(yīng)面分析結(jié)果見表2。

由表2可知，擬合回歸方程：Y（黃酮提取率）=7.25+0.048A+0.52B-0.093C+0.17D+0.21AB+0.35AC-0.19AD-0.083BC+0.030BD-0.13CD-0.5A2-0.42B2-0.38C2-0.28D2。根據(jù)回歸模型顯著性分析表可以知，模型 P＜0.01，表明模型極顯著；失擬項(xiàng) P=0.055 7＞0.05，說明殘差是由隨機(jī)誤差引起的，模型與實(shí)際數(shù)據(jù)擬合較好。表中一次項(xiàng)P值均小于0.05，表明選取的因素對(duì)響應(yīng)值都具有顯著影響，影響程度為B（料液比）＞D（提取溫度）＞C（提取時(shí)間）＞A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）。交互項(xiàng)AB、AC、AD及 CD的P值均小于0.01，BC小于0.05，表明上述各因素兩兩交互作用顯著且與響應(yīng)值存在非線性關(guān)系；BD大于0.05，表明料液比與提取溫度之間可能不存在復(fù)雜交互作用。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)二階回歸方程顯著性分析Table 2 Analysis of variance for the second-order regression model

該模型相關(guān)系數(shù)R2=0.989 0，R2Adj=0.978 0，說明模型可以擬合98.90%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)并解釋97.80%的響應(yīng)值變化。變異系數(shù)CV=1.16%，信噪比=37.30%，表明模型具有較高的精確度和可靠性，可以應(yīng)用于黃酮提取率的分析和預(yù)測(cè)。

模型中的響應(yīng)面和輪廓線可以表示不同因素對(duì)響應(yīng)值的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 響應(yīng)面因素交互作用3D圖Fig.5 3D diagram of response surface factor interaction

圖5曲面均呈現(xiàn)開口向下的凸面，具有極高值點(diǎn)，該點(diǎn)即為兩因素交互后的最大黃酮提取率。3D圖在底面的投影可表現(xiàn)出兩因素交互影響，其中AB、AC、AD和CD等高線密集且形狀呈現(xiàn)橢圓形，說明上述交互作用均極顯著。由圖5a可知，AB兩因素交互作用極顯著，等高線多交于B軸，表明料液比對(duì)提取率影響更大，與顯著性分析結(jié)果一致。圖5e表示BD兩因素的相互作用關(guān)系，其中等高線稀疏且圖形分散，呈現(xiàn)圓形，證明料液比與提取溫度交互不顯著。曲面圖及等高線圖呈現(xiàn)結(jié)果與模型顯著性分析吻合，表明模型與試驗(yàn)結(jié)果擬合較好，具有可行性和有效性。

通過軟件Design-Expert（10.0.7）進(jìn)行擬合，得到HLF的最佳提取工藝：乙醇體積分?jǐn)?shù)為60.230%，料液比為 1∶16.685（g/mL），提取時(shí)間為 109.885 min，提取溫度為54.011℃，黃酮提取率預(yù)測(cè)值為7.469%?？紤]到可操作性，試驗(yàn)將最優(yōu)提取條件調(diào)整為乙醇體積分?jǐn)?shù) 60%，料液比 1∶17（g/mL），提取時(shí)間 110 min，提取溫度54℃。實(shí)際測(cè)得的黃酮提取率為（7.53±0.15）%，相對(duì)誤差0.22%，與預(yù)測(cè)值基本吻合，說明該模型優(yōu)化參數(shù)可靠，具有參考意義。

2.3 HLF純化

通過樹脂篩選及動(dòng)態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)，明確HLF粗提物純化工藝：樹脂類型為AB-8；上樣量為2 BV，水洗體積為2 BV；除雜（10%乙醇溶液）體積為2 BV；洗脫劑（60%乙醇溶液）體積為4.5 BV。粗提物經(jīng)過冷凍干燥后，固形物中黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（27.25±1.21）%，經(jīng)初步除雜后再通過AB-8的富集，黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高至（85.61±0.72）%，約為純化前的3.14倍。

2.4 HLF體外抗氧化活性

2.4.1 總還原力

試驗(yàn)采用鐵氰化鉀法測(cè)定HLF總還原能力，結(jié)果見圖6。

如圖 6 所示，HLF 濃度在 50 μg/mL～250 μg/mL時(shí)，總還原力隨HLF濃度增大而增大，呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系，不同HLF濃度之間存在顯著性差異，250 μg/mL時(shí)達(dá)到（71.90±1.61）μg/mL VC當(dāng)量。酚羥基可提供氫原子參與氧化還原反應(yīng)，從而促進(jìn)普魯士藍(lán)產(chǎn)生[10]。山楂葉黃酮結(jié)構(gòu)中存在多個(gè)酚羥基，也因此具備較強(qiáng)的總還原力。

圖6 HLF總還原力Fig.6 Total reducing force of HLF

2.4.2 DPPH·清除能力

由于粗提物中蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)也可能參與鐵氰化鉀還原反應(yīng)，所以無法根據(jù)HLF總還原力判斷其自由基清除能力。純化后HLF純度為（85.61±0.72）%，仍含有部分雜質(zhì)，因此探究其與自由基結(jié)合的難易程度有助于綜合評(píng)價(jià)該物質(zhì)抗氧化活性[13]。HLF清除DPPH·能力見圖7。

圖7 HLF的DPPH·清除率Fig.7 DPPH·clearance rate of HLF

如圖7所示，HLF和蘆丁濃度在10μg/mL～100 μg/mL時(shí)，濃度與DPPH·清除率呈正相關(guān)，在100 μg/mL時(shí)，清除率達(dá)到（76.88±4.76）%和（62.47±2.37）%。蘆丁IC50為64.63μg/mL約為HLF（IC50為21.39μg/mL）的3.02倍，由此可見，HLF具有較好的清除DPPH·能力。

2.4.3 ABTS+·清除能力

HLF 和蘆丁濃度在 10 μg/mL～100 μg/mL 時(shí)，與ABTS+·清除率呈正相關(guān)，試驗(yàn)結(jié)果見圖8。

如圖8所示，當(dāng)HLF濃度為100 μg/mL時(shí)，清除率達(dá)到最大值，（94.73±1.36）%。在相同濃度下，HLF 與陽性對(duì)照作用效果接近，IC50分別為25.87 μg/mL及25.16 μg/mL，并未出現(xiàn)顯著性差異。研究表明，大部分黃酮類化合物可在較低濃度下呈現(xiàn)出極強(qiáng)的自由基清除能力，HLF可以通過提供電子、淬滅自由基并形成穩(wěn)定的類黃酮中間體來終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[15]。

圖8 HLF的ABTS+·清除率Fig.8 ABTS+·clearance rate of HLF

2.4.4 ·OH清除能力

通過水楊酸法對(duì)HLF和蘆丁結(jié)合·OH活性進(jìn)行探究，試驗(yàn)結(jié)果見圖9。

圖9 HLF的·OH清除率Fig.9·OH clearance rate of HLF

如圖9所示，隨著HLF和蘆丁濃度增大，體系里·OH不斷減少，當(dāng)濃度為100 μg/mL時(shí)，清除率分別達(dá)到（91.10±4.64）%和（70.42±2.74）%。對(duì)比達(dá)到相同清除率兩者所用劑量可知，HLF（IC50為 23.75 μg/mL）的·OH清除能力要優(yōu)于蘆?。↖C50為59.74 μg/mL）。烏欖葉黃酮在清除·OH試驗(yàn)中IC50為54 μg/mL約為HLF的2倍[16]，杜仲葉黃酮在濃度為100 μg/mL時(shí)，抑制率為75%，作用效果低于HLF[17]。黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)與組成決定其抗氧化活性[18]，山楂葉黃酮富含牡荊素-2″-O-鼠李糖苷和牡荊素-4″-O-葡萄糖苷等活性物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)中存在鄰二酚羥基。由于鄰二酚羥基可與半醌式自由基形成較穩(wěn)定的分子內(nèi)氫鍵，因此HLF表現(xiàn)出較強(qiáng)的·OH清除活性[18-19]。

2.4.5 O2-·清除能力

以NADH/PMS體系評(píng)價(jià)清除O2-·能力，試驗(yàn)結(jié)果見圖10。

圖10 HLF的·清除率Fig.10 O2-·clearance rate of HLF

如圖 10所示，HLF與蘆丁濃度在 10 μg/mL～100 μg/mL時(shí)，以計(jì)量依賴的方式參與O2-·清除反應(yīng)，且 HLF（IC50為 74.72 μg/mL）對(duì)于 O2-·清除能力略低于蘆?。↖C50為 48.09 μg/mL）。當(dāng)濃度較高時(shí)，兩者作用效果接近，表明HLF具有較好的超氧陰離子清除能力。研究表明黃酮類化合物抗氧化活性與B環(huán)上的羥基數(shù)目呈現(xiàn)正相關(guān)，Dong等[20]在櫻桃中獲得6種黃酮單體，其中花青素-3-O-葡萄糖苷B環(huán)上存在2個(gè)羥基，而黃芪甲苷只有1個(gè)，前者清除自由基能力為后者的4倍，由此可見黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)與其抗氧化能力之間存在一定關(guān)系。HLF中含有金絲桃苷、槲皮素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷等活性物質(zhì)，B環(huán)均存在多個(gè)酚羥基，這可能是HLF清除自由基活性的重要依據(jù)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用超聲輔助提取法，以較低功率對(duì)山楂葉進(jìn)行多次提取，通過單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化，將黃酮提取率提高至（7.53±0.15）%。在此基礎(chǔ)上經(jīng)過AB-8大孔樹脂純化，HLF中黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到（85.61±0.72）%，較純化前提高了58.36%。隨后對(duì)山楂葉黃酮抗氧化活性進(jìn)行探究，通過比較總還原力及4種自由基清除作用可知，HLF對(duì)于 DPPH·、ABTS+·及·OH清除效果最好，O2-·效果略差。HLF作為高效、安全、無毒害作用的天然植物提取物，對(duì)于新型抗氧化劑及保健食品的開發(fā)具有重要意義。