汪建紅

（內(nèi)江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，四川省高等學(xué)校果類廢棄物資源化重點實驗室，四川 內(nèi)江 641199)

桂花是原產(chǎn)于我國的一種重要的園林花卉，屬木犀科木犀屬。桂花在我國有悠久的栽培歷史，可追溯到2 500多年前，且分布范圍廣泛，在淮河流域及其以南地區(qū)均有廣泛種植[1-3]。除了很高的觀賞價值外，桂花在食用及藥用等領(lǐng)域也有較大的利用價值，桂花的莖、葉、花、根均可入藥，但均未得到充分利用，尤其是桂花葉[4]。桂花葉富含多種功能成分，其中包括具有消炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化等作用的黃酮[5-6]。提取桂花葉中的黃酮，對提高其利用效率、應(yīng)用價值和經(jīng)濟價值有較大意義。

植物中功能成分的眾多提取方法中，傳統(tǒng)的溶劑直接浸提法[7-8]耗時長，且效率較低；酶法[9-11]因為酶易失活，提取效率易受影響；超聲波法[12-14]和微波法[15-16]不適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；內(nèi)部沸騰法[17-19]作為較新的提取方法，主要通過預(yù)先進入植物組織內(nèi)部的有機溶劑發(fā)生沸騰汽化，對植物組織細胞壁產(chǎn)生沖擊作用，可加快植物組織內(nèi)外的對流速度，高效省時；雙水相萃取法[20-22]則是使提取出的物質(zhì)自動在兩相分配純化，可減小提取出的物質(zhì)對植物組織內(nèi)外對流通道的影響，保證通道的通暢，提高提取效率，還兼具分離和純化雙重功能，具有條件溫和、不影響提取物活性等優(yōu)點。雙水相輔助內(nèi)部沸騰法可使兩種方法協(xié)同發(fā)揮作用，進一步提高提取效率，但尚未見到此法用于桂花葉中黃酮提取的報道。小分子-無機鹽雙水相體系黏度低，純化效果好，溶劑易回收，乙醇-硫酸銨雙水相體系就屬于此類，而且乙醇-硫酸銨雙水相體系為親水性兩相體系，毒性小，綠色環(huán)保，有利于植物有效成分地提取[23-25]。因此本試驗選擇乙醇-硫酸銨雙水相體系輔助內(nèi)部沸騰法提取桂花葉中的黃酮，并利用響應(yīng)面模型優(yōu)化提取工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桂花葉：采自內(nèi)江師范學(xué)院校園；95%乙醇、硝酸鋁（均為分析純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司；硫酸銨、亞硝酸鈉、氫氧化鈉（均為分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱鼓風(fēng)干燥箱（CS101-2AB）：重慶試驗設(shè)備廠；手提式萬能高速粉碎機（DFT-100）：溫嶺市林大機械有限公司；電子天平（BSA822）：北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；磁力加熱攪拌器（DF-101S）：鄭州英峪予華儀器有限公司；水循環(huán)多用真空泵（SHB-B95）：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；紫外-可見分光光度計（T-6）：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線的繪制

參考文獻[17，26]方法，繪制濃度為0.008 mg/mL～0.048 mg/mL的黃酮標準曲線，并得出其線性回歸方程為A=14.6C-0.005 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2。

1.3.2 桂花葉黃酮的提取和測定

桂花葉在60℃左右烘干并粉碎成60目的粉末。利用95%乙醇配制50%乙醇溶液、30%乙醇溶液，放置備用。

參考文獻[17，27-28]方法，稱取1.00 g桂花葉粉末置于100 mL三頸瓶中，加入5 mL 95%乙醇，在30℃下浸泡30 min，然后移到水浴鍋中，在三頸瓶口裝上冷凝管和毛細管，并用橡膠管將冷凝管上口和真空泵連接好，安裝好裝置后迅速加入40 mL硫酸銨和50%乙醇配制的溶液，并迅速抽真空到系統(tǒng)壓力為0.04 MPa左右，30℃水浴回流一定時間。冷卻，使用直徑7 cm的布氏漏斗抽濾獲取濾液，將濾液轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，加入30%乙醇溶液定容。

從容量瓶中移取2.00 mL桂花葉提取液到25 mL比色管中，用30%乙醇溶液定容到10 mL。從比色管中取出1.00 mL到另一25 mL比色管中，先后加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL、10%硝酸鋁溶液1 mL、1 mol/L氫氧化鈉溶液6.0 mL，每加入一種試劑都必須搖勻并放置6 min后再加入下一種試劑，然后加入30%乙醇溶液定容到10 mL，在40℃下顯色25 min，顯色后以未經(jīng)顯色的稀釋后的提取液為對照，在510 nm波長處測定其吸光度。按照下式計算桂花葉黃酮的得率。

式中：C為稀釋后提取液中黃酮濃度，mg/mL；B為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積，mL；M為桂花葉質(zhì)量，mg。

1.3.3 單因素試驗

選擇硫酸銨濃度、提取溫度和提取時間3個因素作為單因素試驗的考察因素，依次考察硫酸銨濃度（0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 g/mL）、提取溫度（40、50、60、70、80 ℃）和提取時間（10、20、30、40 min）對桂花葉黃酮得率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，利用Design-Expert 8.05b軟件，采用Box-Behnken設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面模型，進行響應(yīng)面試驗，其因素水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面因素水平Table 1 Factor and level of response surface

1.4 試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本試驗中均進行3次平行試驗，結(jié)果取平均值。單因素試驗的結(jié)果采用origin 75軟件繪圖。響應(yīng)面模型采用Box-Behnken軟件設(shè)計，試驗結(jié)果采用Design-Expert 8.05b軟件分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 硫酸銨濃度對桂花葉黃酮得率的影響

黃酮得率隨硫酸銨濃度的變化趨勢如圖1所示。

圖1 硫酸銨濃度對黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ammonium sulfate concentration on yield of flavonoid

從圖1可看到，硫酸銨濃度在0.25 g/mL～0.45 g/mL范圍內(nèi)，隨硫酸銨濃度的增大，桂花葉黃酮得率先增大后減小，最大值出現(xiàn)在0.40 g/mL處。這主要是因為硫酸銨的濃度大小會影響雙水相體系的分相能力，影響乙醇和水在體系上下兩層的分配，硫酸銨濃度越大，體系分相能力越強，上層乙醇濃度就越大，由于黃酮更易溶于乙醇，因此這對桂花葉黃酮提取是有利的；但硫酸銨濃度過大時，會造成硫酸銨和乙醇對水分子的競爭，極性增大，導(dǎo)致上層有機相的減少，且硫酸銨濃度過大時，在乙醇作用下部分硫酸銨會沉淀析出，影響黃酮提取[29-31]。因此，選擇硫酸銨濃度為0.35、0.40、0.45 g/mL進行響應(yīng)面試驗。

2.1.2 提取溫度對桂花葉黃酮得率的影響

桂花葉黃酮得率隨提取溫度的變化趨勢如圖2所示。

圖2 提取溫度對黃酮得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on yield of flavonoid

從圖2可看到，隨提取溫度的升高，桂花葉黃酮得率先增大后逐漸降低，最大值出現(xiàn)在50℃處。這是由于溫度升高，內(nèi)部沸騰會更加劇烈，對桂花葉細胞組織的沖擊會更強，桂花葉細胞組織內(nèi)外的對流速度也會加快；此外，溫度的升高還會導(dǎo)致分子擴散運動的加快，加速雙水相體系的分離，這些作用對黃酮提取都是有利的；但是溫度過高也會增加溶劑乙醇的揮發(fā)速度，還會導(dǎo)致部分提取出的黃酮分解變質(zhì)[17，27，32-33]。因此，選擇提取溫度為40、50、60℃進行響應(yīng)面試驗。

2.1.3 提取時間對桂花葉黃酮得率的影響

桂花葉黃酮得率隨提取時間的變化趨勢如圖3所示。

圖3 提取時間對黃酮得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on yield of flavonoid

從圖3可看到，隨提取時間的延長，桂花葉黃酮得率先逐漸增大后逐漸減少，最大值出現(xiàn)在20 min處。這是由于提取時間的延長，會使黃酮在內(nèi)部沸騰作用下更充分地浸出桂花葉組織并擴散到溶液中，有利于黃酮提取；但提取時間過長也會導(dǎo)致更多的黃酮被氧化分解，不利于黃酮提取[17，19，28，33]。因此，選擇提取時間為10、20、30 min進行響應(yīng)面試驗。

2.2 響應(yīng)面試驗

以硫酸銨濃度（A）、提取溫度（B）和提取時間（C）為因素，以黃酮得率為響應(yīng)值（R），響應(yīng)面試驗設(shè)計和結(jié)果如表2所示。

表2 桂花葉黃酮提取的響應(yīng)面模型及試驗結(jié)果Table 2 Response surface model and experimental results on extraction of flavonoid in osmanthus leaves

續(xù)表2 桂花葉黃酮提取的響應(yīng)面模型及試驗結(jié)果Continue table 2 Response surface model and experimental results on extraction of flavonoid in osmanthus leaves

根據(jù)表2中的數(shù)據(jù)，利用Design-Expert 8.05b軟件擬合得到的二次回歸方程：R=2.64-0.088A+0.041B+0.034C+0.10AB+0.077AC-0.069BC-0.073A2-0.17B2-0.091C2。

該響應(yīng)面模型的方差分析如表3所示，等高線及響應(yīng)面圖如圖4～圖6所示。

表3 響應(yīng)面模型的方差分析Table 3 Variance analysis of response surface model

圖4 硫酸銨濃度和提取溫度的等高線和響應(yīng)面圖Fig.4 Contour plot and response surface diagram of ammonium sulfate concentration and extraction temperature

圖5 硫酸銨濃度和提取時間的等高線和響應(yīng)面圖Fig.5 Contour plot and response surface diagram of ammonium sulfate concentration and extraction time

從表3可知該模型的P＜0.001，影響高度顯著，失擬項P=0.565 7，影響不顯著，且該模型R2=0.997 3，R2adj=0.993 7，變異系數(shù)C.V.%為0.48%，較小，信噪比較大，為51.617，說明該模型是可靠的、準確的，可用于桂花葉黃酮提取條件的優(yōu)化。

一次項A（硫酸銨濃度）、B（提取溫度）和C（提取時間）對桂花葉中黃酮得率的影響均高度顯著；AB、AC、BC、A2、B2和 C2的影響均達到了高度顯著的程度。從F值可知，該3個因素影響的先后順序為A＞B＞C。從圖4～圖6可知，等高線均為橢圓形，說明硫酸銨濃度、提取溫度和提取時間兩兩因素間交互作用對桂花葉黃酮得率的影響均達到了顯著水平。

圖6 提取溫度和提取時間的等高線和響應(yīng)面圖Fig.6 Contour plot and response surface diagram of extraction temperature and extraction time

利用Design-Expert 8.05b軟件分析得出，雙水相輔助內(nèi)部沸騰法提取桂花葉中黃酮的最佳提取條件為硫酸銨濃度0.37 g/mL，提取溫度49.26℃，提取時間19.23 min。為了方便實際操作，將該條件組合調(diào)整為硫酸銨濃度0.35 g/mL，提取溫度50℃，提取時間20 min，進行3次平行驗證試驗，得出的黃酮得率分別為2.505%、2.574%和2.522%，平均值為2.534%，與理論預(yù)測值2.655%相近，說明了此模型的可靠性。此外，該平均值高于相同條件下內(nèi)部沸騰法得到的黃酮得率2.180%、雙水相萃取法得到的黃酮得率2.146%和有機溶劑直接浸提法得到的黃酮得率1.632%，說明內(nèi)部沸騰法和雙水相萃取法發(fā)揮了協(xié)同作用，提高了桂花葉中黃酮的得率。

3 結(jié)論

本試驗選擇雙水相輔助內(nèi)部沸騰法用于桂花葉中黃酮的提取，并采用單因素試驗及響應(yīng)面模型優(yōu)化提取工藝條件，得出最佳條件組合為硫酸銨濃度0.35 g/mL，提取溫度50℃，提取時間20 min，該最佳條件組合下得到的黃酮得率平均值為2.534%。此外，該最佳工藝的黃酮得率均高于相同條件下內(nèi)部沸騰法、雙水相萃取法和有機溶劑直接浸提法的黃酮得率，說明內(nèi)部沸騰法和雙水相萃取法協(xié)同發(fā)揮了作用。