汪建紅

（內(nèi)江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，四川省高等學(xué)校果類廢棄物資源化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 內(nèi)江 641199)

桂花是原產(chǎn)于我國(guó)的一種重要的園林花卉，屬木犀科木犀屬。桂花在我國(guó)有悠久的栽培歷史，可追溯到2 500多年前，且分布范圍廣泛，在淮河流域及其以南地區(qū)均有廣泛種植[1-3]。除了很高的觀賞價(jià)值外，桂花在食用及藥用等領(lǐng)域也有較大的利用價(jià)值，桂花的莖、葉、花、根均可入藥，但均未得到充分利用，尤其是桂花葉[4]。桂花葉富含多種功能成分，其中包括具有消炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化等作用的黃酮[5-6]。提取桂花葉中的黃酮，對(duì)提高其利用效率、應(yīng)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值有較大意義。

植物中功能成分的眾多提取方法中，傳統(tǒng)的溶劑直接浸提法[7-8]耗時(shí)長(zhǎng)，且效率較低；酶法[9-11]因?yàn)槊敢资Щ睿崛⌒室资苡绊?；超聲波法[12-14]和微波法[15-16]不適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；內(nèi)部沸騰法[17-19]作為較新的提取方法，主要通過預(yù)先進(jìn)入植物組織內(nèi)部的有機(jī)溶劑發(fā)生沸騰汽化，對(duì)植物組織細(xì)胞壁產(chǎn)生沖擊作用，可加快植物組織內(nèi)外的對(duì)流速度，高效省時(shí)；雙水相萃取法[20-22]則是使提取出的物質(zhì)自動(dòng)在兩相分配純化，可減小提取出的物質(zhì)對(duì)植物組織內(nèi)外對(duì)流通道的影響，保證通道的通暢，提高提取效率，還兼具分離和純化雙重功能，具有條件溫和、不影響提取物活性等優(yōu)點(diǎn)。雙水相輔助內(nèi)部沸騰法可使兩種方法協(xié)同發(fā)揮作用，進(jìn)一步提高提取效率，但尚未見到此法用于桂花葉中黃酮提取的報(bào)道。小分子-無(wú)機(jī)鹽雙水相體系黏度低，純化效果好，溶劑易回收，乙醇-硫酸銨雙水相體系就屬于此類，而且乙醇-硫酸銨雙水相體系為親水性兩相體系，毒性小，綠色環(huán)保，有利于植物有效成分地提取[23-25]。因此本試驗(yàn)選擇乙醇-硫酸銨雙水相體系輔助內(nèi)部沸騰法提取桂花葉中的黃酮，并利用響應(yīng)面模型優(yōu)化提取工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桂花葉：采自內(nèi)江師范學(xué)院校園；95%乙醇、硝酸鋁（均為分析純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司；硫酸銨、亞硝酸鈉、氫氧化鈉（均為分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱鼓風(fēng)干燥箱（CS101-2AB）：重慶試驗(yàn)設(shè)備廠；手提式萬(wàn)能高速粉碎機(jī)（DFT-100）：溫嶺市林大機(jī)械有限公司；電子天平（BSA822）：北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；磁力加熱攪拌器（DF-101S）：鄭州英峪予華儀器有限公司；水循環(huán)多用真空泵（SHB-B95）：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；紫外-可見分光光度計(jì)（T-6）：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考文獻(xiàn)[17，26]方法，繪制濃度為0.008 mg/mL～0.048 mg/mL的黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得出其線性回歸方程為A=14.6C-0.005 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2。

1.3.2 桂花葉黃酮的提取和測(cè)定

桂花葉在60℃左右烘干并粉碎成60目的粉末。利用95%乙醇配制50%乙醇溶液、30%乙醇溶液，放置備用。

參考文獻(xiàn)[17，27-28]方法，稱取1.00 g桂花葉粉末置于100 mL三頸瓶中，加入5 mL 95%乙醇，在30℃下浸泡30 min，然后移到水浴鍋中，在三頸瓶口裝上冷凝管和毛細(xì)管，并用橡膠管將冷凝管上口和真空泵連接好，安裝好裝置后迅速加入40 mL硫酸銨和50%乙醇配制的溶液，并迅速抽真空到系統(tǒng)壓力為0.04 MPa左右，30℃水浴回流一定時(shí)間。冷卻，使用直徑7 cm的布氏漏斗抽濾獲取濾液，將濾液轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，加入30%乙醇溶液定容。

從容量瓶中移取2.00 mL桂花葉提取液到25 mL比色管中，用30%乙醇溶液定容到10 mL。從比色管中取出1.00 mL到另一25 mL比色管中，先后加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL、10%硝酸鋁溶液1 mL、1 mol/L氫氧化鈉溶液6.0 mL，每加入一種試劑都必須搖勻并放置6 min后再加入下一種試劑，然后加入30%乙醇溶液定容到10 mL，在40℃下顯色25 min，顯色后以未經(jīng)顯色的稀釋后的提取液為對(duì)照，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。按照下式計(jì)算桂花葉黃酮的得率。

式中：C為稀釋后提取液中黃酮濃度，mg/mL；B為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積，mL；M為桂花葉質(zhì)量，mg。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

選擇硫酸銨濃度、提取溫度和提取時(shí)間3個(gè)因素作為單因素試驗(yàn)的考察因素，依次考察硫酸銨濃度（0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 g/mL）、提取溫度（40、50、60、70、80 ℃）和提取時(shí)間（10、20、30、40 min）對(duì)桂花葉黃酮得率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，利用Design-Expert 8.05b軟件，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面模型，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，其因素水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面因素水平Table 1 Factor and level of response surface

1.4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本試驗(yàn)中均進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。單因素試驗(yàn)的結(jié)果采用origin 75軟件繪圖。響應(yīng)面模型采用Box-Behnken軟件設(shè)計(jì)，試驗(yàn)結(jié)果采用Design-Expert 8.05b軟件分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 硫酸銨濃度對(duì)桂花葉黃酮得率的影響

黃酮得率隨硫酸銨濃度的變化趨勢(shì)如圖1所示。

圖1 硫酸銨濃度對(duì)黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ammonium sulfate concentration on yield of flavonoid

從圖1可看到，硫酸銨濃度在0.25 g/mL～0.45 g/mL范圍內(nèi)，隨硫酸銨濃度的增大，桂花葉黃酮得率先增大后減小，最大值出現(xiàn)在0.40 g/mL處。這主要是因?yàn)榱蛩徜@的濃度大小會(huì)影響雙水相體系的分相能力，影響乙醇和水在體系上下兩層的分配，硫酸銨濃度越大，體系分相能力越強(qiáng)，上層乙醇濃度就越大，由于黃酮更易溶于乙醇，因此這對(duì)桂花葉黃酮提取是有利的；但硫酸銨濃度過大時(shí)，會(huì)造成硫酸銨和乙醇對(duì)水分子的競(jìng)爭(zhēng)，極性增大，導(dǎo)致上層有機(jī)相的減少，且硫酸銨濃度過大時(shí)，在乙醇作用下部分硫酸銨會(huì)沉淀析出，影響黃酮提取[29-31]。因此，選擇硫酸銨濃度為0.35、0.40、0.45 g/mL進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.2 提取溫度對(duì)桂花葉黃酮得率的影響

桂花葉黃酮得率隨提取溫度的變化趨勢(shì)如圖2所示。

圖2 提取溫度對(duì)黃酮得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on yield of flavonoid

從圖2可看到，隨提取溫度的升高，桂花葉黃酮得率先增大后逐漸降低，最大值出現(xiàn)在50℃處。這是由于溫度升高，內(nèi)部沸騰會(huì)更加劇烈，對(duì)桂花葉細(xì)胞組織的沖擊會(huì)更強(qiáng)，桂花葉細(xì)胞組織內(nèi)外的對(duì)流速度也會(huì)加快；此外，溫度的升高還會(huì)導(dǎo)致分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)的加快，加速雙水相體系的分離，這些作用對(duì)黃酮提取都是有利的；但是溫度過高也會(huì)增加溶劑乙醇的揮發(fā)速度，還會(huì)導(dǎo)致部分提取出的黃酮分解變質(zhì)[17，27，32-33]。因此，選擇提取溫度為40、50、60℃進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)桂花葉黃酮得率的影響

桂花葉黃酮得率隨提取時(shí)間的變化趨勢(shì)如圖3所示。

圖3 提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on yield of flavonoid

從圖3可看到，隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)，桂花葉黃酮得率先逐漸增大后逐漸減少，最大值出現(xiàn)在20 min處。這是由于提取時(shí)間的延長(zhǎng)，會(huì)使黃酮在內(nèi)部沸騰作用下更充分地浸出桂花葉組織并擴(kuò)散到溶液中，有利于黃酮提取；但提取時(shí)間過長(zhǎng)也會(huì)導(dǎo)致更多的黃酮被氧化分解，不利于黃酮提取[17，19，28，33]。因此，選擇提取時(shí)間為10、20、30 min進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

以硫酸銨濃度（A）、提取溫度（B）和提取時(shí)間（C）為因素，以黃酮得率為響應(yīng)值（R），響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果如表2所示。

表2 桂花葉黃酮提取的響應(yīng)面模型及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface model and experimental results on extraction of flavonoid in osmanthus leaves

續(xù)表2 桂花葉黃酮提取的響應(yīng)面模型及試驗(yàn)結(jié)果Continue table 2 Response surface model and experimental results on extraction of flavonoid in osmanthus leaves

根據(jù)表2中的數(shù)據(jù)，利用Design-Expert 8.05b軟件擬合得到的二次回歸方程：R=2.64-0.088A+0.041B+0.034C+0.10AB+0.077AC-0.069BC-0.073A2-0.17B2-0.091C2。

該響應(yīng)面模型的方差分析如表3所示，等高線及響應(yīng)面圖如圖4～圖6所示。

表3 響應(yīng)面模型的方差分析Table 3 Variance analysis of response surface model

圖4 硫酸銨濃度和提取溫度的等高線和響應(yīng)面圖Fig.4 Contour plot and response surface diagram of ammonium sulfate concentration and extraction temperature

圖5 硫酸銨濃度和提取時(shí)間的等高線和響應(yīng)面圖Fig.5 Contour plot and response surface diagram of ammonium sulfate concentration and extraction time

從表3可知該模型的P＜0.001，影響高度顯著，失擬項(xiàng)P=0.565 7，影響不顯著，且該模型R2=0.997 3，R2adj=0.993 7，變異系數(shù)C.V.%為0.48%，較小，信噪比較大，為51.617，說(shuō)明該模型是可靠的、準(zhǔn)確的，可用于桂花葉黃酮提取條件的優(yōu)化。

一次項(xiàng)A（硫酸銨濃度）、B（提取溫度）和C（提取時(shí)間）對(duì)桂花葉中黃酮得率的影響均高度顯著；AB、AC、BC、A2、B2和 C2的影響均達(dá)到了高度顯著的程度。從F值可知，該3個(gè)因素影響的先后順序?yàn)锳＞B＞C。從圖4～圖6可知，等高線均為橢圓形，說(shuō)明硫酸銨濃度、提取溫度和提取時(shí)間兩兩因素間交互作用對(duì)桂花葉黃酮得率的影響均達(dá)到了顯著水平。

圖6 提取溫度和提取時(shí)間的等高線和響應(yīng)面圖Fig.6 Contour plot and response surface diagram of extraction temperature and extraction time

利用Design-Expert 8.05b軟件分析得出，雙水相輔助內(nèi)部沸騰法提取桂花葉中黃酮的最佳提取條件為硫酸銨濃度0.37 g/mL，提取溫度49.26℃，提取時(shí)間19.23 min。為了方便實(shí)際操作，將該條件組合調(diào)整為硫酸銨濃度0.35 g/mL，提取溫度50℃，提取時(shí)間20 min，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得出的黃酮得率分別為2.505%、2.574%和2.522%，平均值為2.534%，與理論預(yù)測(cè)值2.655%相近，說(shuō)明了此模型的可靠性。此外，該平均值高于相同條件下內(nèi)部沸騰法得到的黃酮得率2.180%、雙水相萃取法得到的黃酮得率2.146%和有機(jī)溶劑直接浸提法得到的黃酮得率1.632%，說(shuō)明內(nèi)部沸騰法和雙水相萃取法發(fā)揮了協(xié)同作用，提高了桂花葉中黃酮的得率。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)選擇雙水相輔助內(nèi)部沸騰法用于桂花葉中黃酮的提取，并采用單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面模型優(yōu)化提取工藝條件，得出最佳條件組合為硫酸銨濃度0.35 g/mL，提取溫度50℃，提取時(shí)間20 min，該最佳條件組合下得到的黃酮得率平均值為2.534%。此外，該最佳工藝的黃酮得率均高于相同條件下內(nèi)部沸騰法、雙水相萃取法和有機(jī)溶劑直接浸提法的黃酮得率，說(shuō)明內(nèi)部沸騰法和雙水相萃取法協(xié)同發(fā)揮了作用。