王章存，賀志錚，章銀良，安廣杰，張培旗，衛(wèi)夢雅，李秀芳

（鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001）

大豆蛋白資源豐富，具有良好的乳化性、凝膠性、起泡性等功能特性，且其氨基酸營養(yǎng)全面[1-2]，在食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用[3-6]。然而大豆也是聯(lián)合國糧農(nóng)組織認(rèn)定的世界八大類易致敏食物之一[7]，已從大豆蛋白中檢測出38種含有抗原活性的蛋白組分，影響人體的健康，其食用安全問題受到了廣泛關(guān)注。

目前，降解抗原蛋白的方法主要有物理法、化學(xué)法和生物酶解法[8]。其中，酶解法可使大豆蛋白分子水解為小肽和氨基酸分子，使得蛋白質(zhì)發(fā)生變性，從而降低或消除其抗原活性[9]。目前關(guān)于大豆蛋白酶解的研究較多，而且多是對于酶解過程中大豆蛋白亞基與抗原活性變化關(guān)系的研究[10-12]，如通過風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白，既可部分降低其抗原活性，也可改善其功能特性[13-14]；也有研究表明大豆蛋白先經(jīng)分離，再經(jīng)胃蛋白酶水解，可完全消除7S組分中的α-亞基，但最終仍有組分無法進(jìn)一步水解[15]。Zhao等[16]比較了胃蛋白酶和胰蛋白酶水解大豆蛋白的差異，發(fā)現(xiàn)胃蛋白酶無法水解大豆蛋白7S組分的β-亞基。目前的研究大多采用的是單一酶水解，往往都未能完全消除大豆蛋白抗原活性，如堿性蛋白酶水解大豆蛋白會新生成兩條抗酶解肽鏈，其中一條來自β-伴大豆球蛋白中的α-亞基，且殘留較高的抗原活性[14]。據(jù)報(bào)道，先采用風(fēng)味酶水解，再用中性蛋白酶水解β-伴大豆球蛋白時，其抗原活性去除效果比兩種酶單一水解時更好[17]。但多酶聯(lián)合酶解的文獻(xiàn)報(bào)道較少，其規(guī)律性有待深入探索。鑒于此，本文分別選用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶以及雙酶聯(lián)合酶解大豆蛋白，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE） 分析酶解過程中大豆蛋白分子組成變化，用競爭法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）分析酶解物的抗原活性變化，比較不同酶解方式降解大豆蛋白抗原活性的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

低溫脫脂豆粕：河南陽光油脂公司；大豆蛋白（純度為90.2%）：鄭州輕工業(yè)大學(xué)蛋白質(zhì)深加工實(shí)驗(yàn)室自提取[18]；堿性蛋白酶（200 000 U/g）、木瓜蛋白酶（800 000 U/g）、考馬斯亮藍(lán)R-250、低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（分子量范圍11 kDa～180 kDa）：北京索萊寶科技有限公司；N，N，N'，N'-四甲基乙二胺（N，N，N'，N'-tetramethy lethylenediamine，TEMED）、 二 硫 代 蘇 糖 醇（dithiothreitol，DTT）、過硫酸銨（ammonium persulphate，APS）：麥克勞林公司；甘氨酸、十二烷基硫酸鈉、三羥甲基氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）methyl aminomethane，THAM]、丙烯酰胺（acrylamide，Acr）、N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺（N，N'-methylenebisacrylamide，MBA）、溴酚藍(lán)：生工生物工程（上海）公司；大豆7S β-伴球蛋白酶聯(lián)免疫分析試劑盒、大豆11S球蛋白酶聯(lián)免疫分析試劑盒：上海雅吉生物科技公司。

1.2 儀器

DYY-7C型電泳儀、DYCZ-24DN型電泳槽：北京六一儀器廠；TDZ5-WS型低速離心機(jī)、TECAN Genios酶標(biāo)儀：東勝創(chuàng)新生物科技公司；PB-10酸度計(jì)：賽多利斯（上海）貿(mào)易公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆蛋白的酶解

單酶水解方法：取10 g大豆蛋白溶于100 mL去離子水中，調(diào)節(jié)水浴溫度55℃，pH8.0，按照酶與蛋白質(zhì)量比為1∶100加入堿性蛋白酶，設(shè)置酶反應(yīng)時間點(diǎn)（0、10、30、60、90、120 min）進(jìn)行取樣后沸水浴滅活。木瓜蛋白酶的酶解溫度設(shè)為40℃，pH6.0，其他試驗(yàn)步驟相同。

雙酶聯(lián)合水解方法：取10 g大豆蛋白溶于100 mL水中，調(diào)節(jié)溫度55℃，pH8.0，按照酶與蛋白質(zhì)量比為0.5∶100的比例加入堿性蛋白酶，按設(shè)定的反應(yīng)時間點(diǎn)（0、10、30、60 min）取樣并滅酶；反應(yīng)至 60 min 時，調(diào)整水浴溫度為40℃，pH6.0，再按照酶與蛋白質(zhì)量比為0.5∶100的比例加入木瓜蛋白酶，再按設(shè)定的反應(yīng)時間點(diǎn)（70、90、120 min）取樣并沸水浴滅酶 5 min，冷卻至室溫（25℃）。

1.3.2 SDS-PAGE分析

SDS-PAGE分析采用Laemmli系統(tǒng)[19-20]。設(shè)置分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%；酶解物與還原性樣品緩沖液按照體積比1∶1混合均勻后上樣15 μL，Marker上樣5 μL。電泳條件：濃縮膠80 V電泳15 min，分離膠110 V電泳90 min。取出電泳膠片后采用考馬斯亮藍(lán)R-250溶液染色后脫色拍照分析。

1.3.3 抗原活性的分析

分別采用7S和11S試劑盒檢測酶解物的抗原活性。樣品用0.2 mol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液溶解并作梯度稀釋，按照試劑盒說明書的步驟操作。在酶標(biāo)儀上分別測定兩種蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品的OD值，每組樣品平行測定3次，分別建立不同蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，再將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，數(shù)據(jù)采用Origin 8.0軟件處理。以抗原活性剩余率表示酶解效果，計(jì)算公式如下。

式中：A1為酶解樣品的OD值；A0為原蛋白樣品的OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單酶水解大豆蛋白的組分和抗原活性變化

2.1.1 大豆蛋白亞基的變化

大豆蛋白經(jīng)堿性蛋白酶水解不同時間后，通過SDS-PAGE法分析蛋白組分變化，結(jié)果如圖1所示。

圖1 大豆蛋白在堿性蛋白酶水解時分子量變化Fig.1 Changes in molecular weight of soybean protein during alkali protease hydrolysis

從圖1可以看出，水解10 min時，大豆蛋白7S組分中的α′-亞基、α-亞基和β-亞基基本消失；11S組分中的38 kDa的A-亞基含量在10 min時明顯減少，水解90 min時其含量大幅減少，但到反應(yīng)終點(diǎn)時，仍有少部分殘留；21 kDa的B-亞基含量也明顯減少。與此同時，產(chǎn)生了分子量為23 kDa組分及大量分子量小于11 kDa組分，直至反應(yīng)結(jié)束未發(fā)生明顯變化。這表明堿性蛋白酶可以有效消除7S組分的α-亞基和α′-亞基，但是β-亞基和11S組分不能完全被消除。

大豆蛋白經(jīng)木瓜蛋白酶水解不同時間后組分變化結(jié)果如圖2所示。

圖2 大豆蛋白在木瓜蛋白酶水解時分子量變化Fig.2 Changes in molecular weight of soybean protein during papain hydrolysis

由圖2可見，酶解10 min時，大豆蛋白7S組分和11S組分中的A-亞基已基本消失，但新產(chǎn)生多條分子量小于30 kDa的譜帶，且隨酶解時間延長這些譜帶基本不再變化，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗酶解特性[21]。

2.1.2 抗原活性的變化

采用競爭ELISA法分別測定兩種蛋白酶水解過程中大豆蛋白7S組分和11S組分抗原活性變化，結(jié)果如圖3和圖4所示。

圖3 酶解過程中大豆蛋白7S組分抗原活性變化Fig.3 Changes in antigenicity of 7S components of soybean protein during hydrolysis

由圖3和圖4可知，兩種蛋白酶均可降低大豆蛋白抗原活性，而且在開始酶解的前10 min抗原活性降低速率最快，但延長酶解時間后，兩種蛋白質(zhì)組分的抗原活性變化不明顯。同一種蛋白酶水解時，兩種蛋白質(zhì)組分（7S和11S）的抗原活性降低幅度也不一樣。從兩種酶的作用效果可以看出，木瓜蛋白酶去除抗原活性能力強(qiáng)于堿性蛋白酶。但兩種蛋白酶水解過程中，蛋白質(zhì)組分與酶解物抗原活性之間的變化規(guī)律并不完全相同，如酶解30 min時，木瓜蛋白酶酶解物中7S和11S抗原活性剩余率分別降低為48.72%和62.33%，堿性蛋白酶酶解物中7S和11S抗原活性剩余率分別為64.25%和78.41%。之后兩種酶的酶解物抗原活性變化趨于穩(wěn)定。

圖4 酶解過程中大豆蛋白11S組分抗原活性變化Fig.4 Changes in antigenicity of 11S components of soybean protein during hydrolysis

2.2 雙酶聯(lián)合水解大豆蛋白組分和抗原活性變化

由圖1至圖4結(jié)果可知，堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶單獨(dú)水解時，大豆蛋白分子組分和抗原活性變化并沒有達(dá)到理想效果，這可能是由于每一種酶水解位點(diǎn)局限性所致。為此，本文研究了先堿性蛋白酶、后木瓜蛋白酶的雙酶聯(lián)合水解效果。

2.2.1 雙酶聯(lián)合水解過程中大豆蛋白組分變化

雙酶聯(lián)合水解過程不同時間節(jié)點(diǎn)大豆蛋白組分變化結(jié)果如圖5所示。

圖5 堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶聯(lián)合酶解時大豆蛋白組分變化Fig.5 Changes in the composition of soybean protein during sequential enzymolysis with alkali protease and papain

從圖5可以看出，前60 min堿性蛋白酶水解時，大豆蛋白7S的幾個組分α-亞基和α'-亞基明顯減少至消失，而β-亞基和11S組分的A-亞基和B-亞基幾乎沒有變化。與圖1相比，這些譜帶消失較慢，主要原因可能是圖5中堿性蛋白酶添加量較少（是圖1中用量的一半）。

但在60 min加入木瓜蛋白酶后，殘存的7S和11S組分很快消失，而且酶解物中也沒有新產(chǎn)生的抗酶解肽鏈。與單獨(dú)用木瓜蛋白酶水解的結(jié)果（圖2）相比，此時酶解效率更高（而且此時木瓜蛋白酶的添加量只有圖2中的一半）。這些結(jié)果表明，堿性蛋白酶的水解產(chǎn)物更有利于木瓜蛋白酶的水解。

2.2.2 雙酶聯(lián)合水解抗原活性的變化

雙酶聯(lián)合水解過程中的抗原活性變化如圖6所示。

圖6 雙酶酶解過程中大豆蛋白抗原活性剩余率變化Fig.6 Changes in antigenicity residual rate of soybean protein during double enzymatic hydrolysis

從圖6可以看出，酶解60 min時，堿性蛋白酶酶解物中7S和11S抗原活性剩余率分別為60.53%和72.44%；加入木瓜蛋白酶10 min后，抗原活性快速降低，7S和11S抗原活性剩余率分別為31.43%和39.69%，之后隨著酶解時間的延長逐漸趨于穩(wěn)定。與兩種酶單獨(dú)水解、總酶量相同情況下比較，雙酶聯(lián)合酶解效果更好。這可能是由于兩種蛋白酶水解位點(diǎn)的差異所引起的協(xié)同作用效果，即原大豆蛋白分子中含有木瓜蛋白酶難以水解的位點(diǎn)或者存在蛋白質(zhì)分子的空間位阻效應(yīng)，經(jīng)堿性蛋白酶水解后產(chǎn)生的肽鏈中這些障礙消失，從而更容易被木瓜蛋白酶水解為更小的分子，其序列型抗原表位也被破壞，從而進(jìn)一步降低其抗原活性。這種現(xiàn)象在風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶的聯(lián)合酶解中也曾出現(xiàn)[17]。當(dāng)采用3種酶解方式（堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、雙酶聯(lián)合）酶解120 min時，酶解物中7S組分的抗原活性剩余率分別為64.25%、48.79%、28.57%，11S組分的抗原活性剩余率分別為78.43%、62.35%、33.93%。

3 結(jié)論

本文分別采用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶及雙酶聯(lián)合方式水解豆粕大豆蛋白，結(jié)果表明：在單一酶水解過程中，堿性蛋白酶無論在降解大豆蛋白，還是降低抗原活性的能力都較木瓜蛋白酶稍弱，且兩者的水解效果均不理想；而相比于單一酶水解，采用先堿性蛋白酶后木瓜蛋白酶的聯(lián)合方式水解時，大豆蛋白分子的降解和抗原活性降低效果更好，這體現(xiàn)了兩種蛋白酶的協(xié)同效應(yīng)。該研究為探討大豆蛋白加工過程中的抗原活性變化規(guī)律、改善其食用安全性提供新的途徑。