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        桑葉生物堿對高果糖飲食小鼠糖脂代謝的影響

        2022-03-10 12:56:42劉慶普陳燕謝彩俠雷敬衛(wèi)馮衛(wèi)生鄭曉珂
        食品研究與開發(fā) 2022年4期
        關(guān)鍵詞:果糖桑葉葡萄糖

        劉慶普,陳燕,謝彩俠,雷敬衛(wèi),馮衛(wèi)生,鄭曉珂*

        (1.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,河南 鄭州 450046;2.河南省中藥質(zhì)量控制與評價工程技術(shù)研究中心,河南 鄭州 450046;3.河南省中藥開發(fā)工程技術(shù)研究中心,河南 鄭州 450046)

        代謝綜合征(metabolic syndrome,MS)是多種代謝異常在機(jī)體內(nèi)集結(jié)的病理狀態(tài),是主要包括肥胖、糖脂代謝紊亂、炎癥和高血壓等多種危險因素的臨床癥候群[1-3]。代謝綜合征已經(jīng)成為一個全球性的健康問題,嚴(yán)重威脅著人類的健康,而代謝綜合征也是心血管疾病和糖尿病的高危因素[4]。

        果糖是一種常見的天然單糖,廣泛存在于蜂蜜、水果、谷物及塊莖類蔬菜中。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,人們生活方式逐漸改變,含糖飲料等的消費(fèi)量大幅增長[5],高果糖玉米糖漿因其價格低廉等優(yōu)點(diǎn),大量應(yīng)用于含糖飲料和食品[6]。人們大量攝入含有高果糖玉米糖漿的食品,導(dǎo)致果糖攝入量增加,而高果糖攝入已經(jīng)成為代謝綜合征的重要病因之一[7-8]。臨床上,應(yīng)用中醫(yī)藥防治代謝綜合征具有一定優(yōu)勢,且“藥食同源”食物具有天然安全性,因此,從“藥食同源”食物中尋找預(yù)防和治療代謝綜合征的物質(zhì)是一條可靠之路。

        桑葉為??浦参锷#∕orus alba L.)的干燥葉,桑葉于2002年被衛(wèi)生部列入《按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材物質(zhì)目錄》,即“藥食同源”?,F(xiàn)代研究表明桑葉具有多種藥理作用,如降血糖、降血脂、防癌、通便利尿和抗炎等[9-12]。同時,也有越來越多的研究表明桑葉中的生物堿類化合物是桑葉諸多藥理作用的關(guān)鍵成分[13],但關(guān)于桑葉生物堿(mulberry leaf alkaloids,MLA)對高果糖飲食所致代謝綜合征糖脂代謝紊亂的改善作用尚未見報道。本研究建立了高果糖誘導(dǎo)的代謝綜合征小鼠模型,探討MLA對高果糖代謝綜合征小鼠糖脂代謝紊亂的改善作用,為桑葉防治高果糖代謝綜合征及相關(guān)功能食品的研究與開發(fā)提供試驗依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 動物、材料與試劑

        SPF級雄性ICR小鼠(60只,體重18 g~22 g):北京維通利華實驗動物有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2016~0006,單籠單只喂養(yǎng),飼養(yǎng)室溫度(24±2)℃,濕度約60%,12 h光照/12 h黑暗交替。

        果糖(食品級):山東西王糖業(yè)有限公司;鹽酸吡格列酮(片):成都迪康藥業(yè)有限公司;水合氯醛(分析純):天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;多聚甲醛固定液(中性):武漢賽維爾生物科技有限公司;葡萄糖(分析純):北京索萊寶科技有限公司;甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total Cholesterol,TC)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(cereal third transaminase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase,AST)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒:南京建成生物工程研究所;腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒:武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;MLA(總生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80.81%,硅鎢酸沉淀法[14]):河南省中藥質(zhì)量控制與評價工程技術(shù)研究中心制備。

        1.2 儀器與設(shè)備

        快速檢測血糖儀、血糖試紙:江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司;iMARK酶標(biāo)儀:伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司;高速冷凍離心機(jī):德國艾本德公司。

        1.3 試驗方法

        1.3.1 動物試驗

        雄性ICR小鼠60只,體重18 g~22 g,正常飼養(yǎng)1周后被隨機(jī)分為 6組(n=10):正常對照組(NC)給予正常飲食和飲水;模型組(HF)給予正常飲食和30%果糖飲水;MLA低劑量組(MLA-40)給予正常飲食和30%果糖飲水,并灌胃MLA[40 mg/(kg·d)];MLA中劑量組(MLA-80)給予正常飲食和30%果糖飲水,并灌胃MLA[80 mg/(kg·d)];MLA高劑量組(MLA-160)給予正常飲食和30%果糖飲水,并灌胃MLA[160 mg/(kg·d)];吡格列酮組(pioglitazone,Pio)給予正常飲食和30%果糖飲水,并灌胃鹽酸吡格列酮[4 mg/(kg·d)]。實驗連續(xù)進(jìn)行16周,實驗完成后,所有動物禁食12 h,以水合氯醛麻醉,摘眼球取血,在4℃條件下,3 000 r/min離心15 min,取血清用于血清生化指標(biāo)的檢測;迅速解剖取出肝臟,以生理鹽水沖洗干凈后,取一部分肝臟置于4%多聚甲醛固定液中,用于病理學(xué)檢測。

        1.3.2 口服糖耐量試驗

        在實驗的第16周,動物禁食不禁水12 h,空腹時取尾尖血,用血糖儀測定空腹血糖,記為Glu0′,而后小鼠接受灌胃給予葡萄糖溶液(2 g/kg),在 30、60、90min和120 min測量小鼠血糖,分別記為Glu30′、Glu60′、Glu90′、Glu120′,并計算曲線下面積(area under the cure,AUC)作統(tǒng)計分析,AUC計算公式如下:

        1.3.3 血清相關(guān)指標(biāo)檢測

        小鼠血清中 TG、TC、ALT、AST、SOD 和 MDA 的檢測均采用商業(yè)試劑盒進(jìn)行檢測,具體實驗操作按照說明書進(jìn)行。

        1.3.4 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,H&E)染色

        用于蘇木精-伊紅染色的肝組織在4%多聚甲醛中固定,石蠟包埋,制成厚度為5 μm的標(biāo)本,然后用蘇木精-伊紅試劑進(jìn)行染色。

        1.3.5 炎癥因子的檢測

        TNF-α、IL-1β和IL-6均使用商業(yè)ELISA試劑盒測定,具體實驗操作按照說明書進(jìn)行。

        1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

        使用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析(oneway ANOVA)評估統(tǒng)計學(xué)意義,然后進(jìn)行Dunnett’s posthoc檢驗。p<0.05為顯著性差異。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 MLA對高果糖代謝綜合征小鼠體重的影響

        MLA對高果糖代謝綜合征小鼠體重的影響如表1所示。

        表1 MLA對高果糖代謝綜合征小鼠體重的影響(n=10)Table 1 Effect of MLA on body weight of metabolic syndrome mice induced by high fructose(n=10)

        與NC組相比,HF組小鼠的體重顯著升高(p<0.05),吡格列酮(Pio)能顯著地降低高果糖飲食誘導(dǎo)代謝綜合征小鼠的體重(p<0.05),給予MLA干預(yù)后,MLA-40組小鼠的體重與HF組相比無明顯變化,MLA-80組小鼠實驗結(jié)束時體重與HF組相比雖有降低趨勢,卻無顯著性差異(p>0.05),但其體重增加量與HF組相比有顯著性的降低(p<0.05),而MLA-160組小鼠實驗結(jié)束時體重和體重增加量與HF組相比有顯著性降低。這表明MLA對高果糖喂養(yǎng)導(dǎo)致小鼠體重增加有抑制作用。

        2.2 MLA對高果糖代謝綜合征小鼠糖代謝的影響

        各組小鼠的葡萄糖耐量測試結(jié)果見表2。

        表2 MLA對高果糖代謝綜合征小鼠口服葡萄糖耐量的影響(n=10)Table 2 Effect of MLA on oral glucose tolerance of metabolic syndrome mice induced by high fructose(n=10)

        各組小鼠的空腹血糖和葡萄糖耐量曲線下面積測試統(tǒng)計如圖1所示。

        圖1 MLA對高果糖代謝綜合征小鼠空腹血糖和葡萄糖耐量曲線下面積的影響(n=10)Fig.1 Effect of MLA on fasting blood-glucose and area under the oral glucose tolerance curve of metabolic syndrome mice induced by high fructose(n=10)

        由圖1可知,經(jīng)過16周高果糖喂養(yǎng)后,HF組小鼠空腹血糖與NC組相比有升高趨勢,無顯著性差異,但其葡萄糖耐量曲線下面積高度顯著升高(p<0.001),說明HF組小鼠對葡萄糖的耐受能力出現(xiàn)了明顯的下降。經(jīng)過MLA的干預(yù)后,小鼠的空腹血糖與HF組相比有降低趨勢,但無顯著性差異;然而,與HF組相比,MLA三個劑量干預(yù)的小鼠葡萄糖耐量曲線下面積均高度顯著降低(p<0.001),說明小鼠的葡萄糖的耐受能力明顯提升。這表明MLA可以改善高果糖飲食導(dǎo)致的小鼠糖代謝紊亂。

        2.3 MLA對高果糖代謝綜合征小鼠血脂影響

        MLA對高果糖代謝綜合征小鼠血脂影響如圖2所示。

        由圖2可知,HF組小鼠的TG和TC水平與NC組相比高度顯著升高(p<0.001),說明高果糖喂養(yǎng)的小鼠出現(xiàn)血脂異常,脂代謝紊亂;經(jīng)過MLA干預(yù)后,MLA三個劑量均可顯著降低高果糖喂養(yǎng)小鼠的TG水平,MLA-80、MLA-160可以顯著降低血清TC水平,MLA-40的血清TC水平與HF組相比雖無顯著性差異,但也有降低的趨勢。這表明MLA可以改善長期高果糖喂養(yǎng)小鼠的血脂異常。

        圖2 MLA對高果糖代謝綜合征小鼠血脂的影響(n=10)Fig.2 Effect of MLA on blood lipid of metabolic syndrome mice induced by high fructose(n=10)

        2.4 MLA對高果糖代謝綜合征小鼠肝功能的影響

        為探討MLA對高果糖飲食誘導(dǎo)的代謝綜合征小鼠肝功能的影響,實驗檢測了小鼠的血清AST和ALT,結(jié)果如圖3所示。

        由圖3可知,與NC組小鼠相比,HF組小鼠經(jīng)過16周的高果糖飲食后血清中的AST和ALT均高度顯著升高,表明高果糖飲食已經(jīng)導(dǎo)致小鼠的肝功能受損;MLA-80、MLA-160均可有效地阻止血清AST和ALT的升高,MLA-40組小鼠的血清AST和ALT水平與HF組相比雖無顯著性差異,但也有一定的降低趨勢。這表明MLA能夠改善高果糖飲食導(dǎo)致的肝功能損傷。

        圖3 MLA對高果糖代謝綜合征小鼠肝功能的影響(n=10)Fig.3 Effect of MLA on liver function of metabolic syndrome mice induced by high fructose(n=10)

        2.5 MLA對高果糖代謝綜合征小鼠肝臟組織病理形態(tài)的影響

        MLA對高果糖代謝綜合征小鼠肝臟組織病理形態(tài)(H&E)的影響如圖4所示。

        圖4 MLA對高果糖代謝綜合征小鼠肝臟組織病理形態(tài)(H&E)的影響Fig.4 Effect of MLA on pathological morphology of liver tissue of metabolic syndrome mice induced by high fructose

        由圖4可知,對各組小鼠進(jìn)行H&E染色分析,結(jié)果顯示,NC組小鼠肝組織靜脈分布均勻,周圍肝細(xì)胞排列整齊緊密,呈放射狀,未見空泡。經(jīng)過16周高果糖飲食后,HF組小鼠的肝臟細(xì)胞明顯腫脹,靜脈周圍細(xì)胞排列較亂,并有大量的空泡形成,這表明高果糖飲食損傷了小鼠的肝臟組織結(jié)構(gòu),給予MLA干預(yù)后,MLA-40組小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)仍然存在明顯損傷;MLA-80組小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)可見少量損傷,相比于HF組明顯減少;MLA-160組小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)中幾乎看不到損傷。這表明MLA對高果糖飲食小鼠肝臟的組織結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用。

        2.6 MLA對高果糖代謝綜合征小鼠血清中SOD和MDA的影響

        MLA對高果糖代謝綜合征小鼠血清中SOD和MDA的影響如圖5所示。

        圖5 MLA對高果糖代謝綜合征小鼠血清SOD和MDA的影響(n=10)Fig.5 Effect of MLA on serum SOD and MDA of metabolic syndrome mice induced by high fructose(n=10)

        由圖5可知,HF組血清中SOD的活力相較于NC組出現(xiàn)高度顯著性下降(p<0.001),經(jīng)過MLA的干預(yù)后,三個劑量組小鼠的血清SOD活力均有高度顯著回升(p<0.001);與NC組相比,HF組小鼠的血清MDA水平高度顯著升高(p<0.001),經(jīng)過MLA的干預(yù)后,MLA-80、MLA-160組小鼠的血清MDA水平與HF組相比極顯著降低(p<0.001),MLA-40組與HF組相比雖無顯著性差異,但也有一定的下降趨勢。這表明長期高果糖飲食小鼠抗氧化能力下降,而MLA可以提高長期高果糖飲食小鼠的抗氧化能力。

        2.7 MLA對高果糖代謝綜合征小鼠炎癥因子的影響

        為進(jìn)一步探索MLA改善高果糖代謝綜合征小鼠糖脂代謝的作用,實驗采用ELISA法測定了各組小鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量,結(jié)果如圖6所示。

        圖6 MLA對高果糖代謝綜合征小鼠血清炎癥因子水平的影響(n=10)Fig.6 Effect of MLA on serum inflammatory factors of metabolic syndrome mice induced by high fructose(n=10)

        圖6結(jié)果顯示,與NC組相比,HF組小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6的含量均顯著性升高(TNF-α:p<0.001;IL-1β:p<0.001;IL-6:p<0.01);與 HF 組相比,MLA-80組和MLA-160組小鼠血清TNF-α水平均有顯著性降低 (MLA-80:p<0.05;MLA-160:p<0.01),MLA-40組血清TNF-α水平雖無顯著性差異,但有一定的降低趨勢;與HF組相比,MLA-80組和MLA-160組小鼠血清IL-1β水平均有顯著性降低(MLA-80:p<0.01;MLA-160:p<0.001),MLA-40 組小鼠血清 IL-1β水平雖無顯著性差異,但有一定的降低趨勢。與HF組相比,MLA-80組和MLA-160組小鼠血清IL-6水平均有顯著性降低(MLA-80:p<0.05;MLA-160:p<0.01),MLA-40組血清IL-6水平雖無顯著性差異,但有一定的降低趨勢。以上結(jié)果表明MLA可以減輕高果糖飲食小鼠的炎癥反應(yīng)。

        3 討論與結(jié)論

        在本研究中,高果糖喂養(yǎng)16周的小鼠空腹血糖與正常組相比雖無顯著性差異,但其葡萄糖耐量已明顯受損,這表明高果糖飲食導(dǎo)致了小鼠的糖代謝異常。經(jīng)過MLA的干預(yù)后,小鼠葡萄糖耐量明顯改善,這表明MLA可以改善高果糖代謝綜合征小鼠的糖代謝紊亂。同時,高果糖飲食使小鼠的體重明顯增加,血清TC、TG水平顯著升高,說明高果糖飲食的小鼠脂代謝也出現(xiàn)異常。長期的脂代謝異常可導(dǎo)致肝組織受損,AST和ALT就會被釋放進(jìn)入血液,導(dǎo)致血液中AST和ALT水平升高[15],在本研究中,高果糖飲食小鼠血清AST和ALT水平明顯升高,這說明其肝臟已經(jīng)受到損傷,進(jìn)一步的病理結(jié)果分析顯示高果糖飲食的小鼠肝臟結(jié)構(gòu)出現(xiàn)損傷,這些結(jié)果證明了長期高果糖飲食可以損傷小鼠的肝臟。而MLA干預(yù)后,高果糖飲食小鼠的體重增長受到明顯的抑制,TC、TG水平顯著降低,這說明MLA具有改善高果糖飲食小鼠脂代謝異常的作用,同時,經(jīng)MLA干預(yù)后,血清AST和ALT水平明顯降低,肝臟的結(jié)構(gòu)病變得到明顯改善,這些結(jié)果證實MLA對肝臟有一定的保護(hù)作用。

        在肥胖和糖脂代謝紊亂的情況下,體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡,引起氧化應(yīng)激,產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物,誘使各種細(xì)胞因子釋放,從而引起機(jī)體的損傷[16]。大量研究表明肝組織的損傷與氧化應(yīng)激密切相關(guān)[17-18],高果糖飲食引起肝損傷的機(jī)制與果糖可導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷有關(guān)[19-20],SOD和MDA是反映機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)的重要指標(biāo)[21],在本研究中,小鼠經(jīng)16周高果糖的喂養(yǎng)后,MDA水平明顯升高,抗氧化酶SOD水平顯著降低,這表明小鼠的抗氧化能力下降且氧化應(yīng)激增強(qiáng)。而MLA可以降低MDA水平,同時升高抗氧化酶SOD水平。這些結(jié)果表明MLA的肝臟保護(hù)作用與其能夠提升機(jī)體的抗氧化能力,改善高果糖飲食導(dǎo)致的氧化應(yīng)激有關(guān)。

        TNF-α、IL-6和IL-1β是由多種炎癥細(xì)胞分泌的炎癥因子,有研究證實過量攝入果糖可導(dǎo)致體內(nèi)炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平升高[22],在本研究中,小鼠經(jīng)16周高果糖喂養(yǎng)后,血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平出現(xiàn)了顯著性升高,這與既往的研究相符[22],而MLA的干預(yù)可以抑制高果糖飲食導(dǎo)致的TNF-α、IL-6和IL-1β水平升高,表明MLA能夠減輕高果糖飲食導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。TNF-α、IL-6和IL-1β與糖代謝和脂代謝密切相關(guān),研究表明降低血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平可以改善糖代謝和脂代謝[23-25]。這些結(jié)果表明MLA改善高果糖代謝綜合征小鼠糖脂代謝紊亂可能與其能降低血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。

        綜上所述,本研究證實了桑葉生物堿可以改善高果糖代謝綜合征小鼠的糖脂代謝紊亂,保護(hù)肝臟,其作用可能與改善機(jī)體氧化應(yīng)激和減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。桑葉被廣泛用作功能性或醫(yī)用添加劑,本研究可為桑葉防治果糖代謝綜合征及相關(guān)功能食品的研究與開發(fā)提供試驗依據(jù)。

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