劉慶普，陳燕，謝彩俠，雷敬衛(wèi)，馮衛(wèi)生，鄭曉珂*

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.河南省中藥質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046；3.河南省中藥開(kāi)發(fā)工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046）

代謝綜合征（metabolic syndrome，MS）是多種代謝異常在機(jī)體內(nèi)集結(jié)的病理狀態(tài)，是主要包括肥胖、糖脂代謝紊亂、炎癥和高血壓等多種危險(xiǎn)因素的臨床癥候群[1-3]。代謝綜合征已經(jīng)成為一個(gè)全球性的健康問(wèn)題，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康，而代謝綜合征也是心血管疾病和糖尿病的高危因素[4]。

果糖是一種常見(jiàn)的天然單糖，廣泛存在于蜂蜜、水果、谷物及塊莖類(lèi)蔬菜中。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們生活方式逐漸改變，含糖飲料等的消費(fèi)量大幅增長(zhǎng)[5]，高果糖玉米糖漿因其價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，大量應(yīng)用于含糖飲料和食品[6]。人們大量攝入含有高果糖玉米糖漿的食品，導(dǎo)致果糖攝入量增加，而高果糖攝入已經(jīng)成為代謝綜合征的重要病因之一[7-8]。臨床上，應(yīng)用中醫(yī)藥防治代謝綜合征具有一定優(yōu)勢(shì)，且“藥食同源”食物具有天然安全性，因此，從“藥食同源”食物中尋找預(yù)防和治療代謝綜合征的物質(zhì)是一條可靠之路。

桑葉為?？浦参锷＃∕orus alba L.）的干燥葉，桑葉于2002年被衛(wèi)生部列入《按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材物質(zhì)目錄》，即“藥食同源”。現(xiàn)代研究表明桑葉具有多種藥理作用，如降血糖、降血脂、防癌、通便利尿和抗炎等[9-12]。同時(shí)，也有越來(lái)越多的研究表明桑葉中的生物堿類(lèi)化合物是桑葉諸多藥理作用的關(guān)鍵成分[13]，但關(guān)于桑葉生物堿（mulberry leaf alkaloids，MLA）對(duì)高果糖飲食所致代謝綜合征糖脂代謝紊亂的改善作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究建立了高果糖誘導(dǎo)的代謝綜合征小鼠模型，探討MLA對(duì)高果糖代謝綜合征小鼠糖脂代謝紊亂的改善作用，為桑葉防治高果糖代謝綜合征及相關(guān)功能食品的研究與開(kāi)發(fā)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SPF級(jí)雄性ICR小鼠（60只，體重18 g～22 g）：北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016～0006，單籠單只喂養(yǎng)，飼養(yǎng)室溫度（24±2）℃，濕度約60%，12 h光照/12 h黑暗交替。

果糖（食品級(jí)）：山東西王糖業(yè)有限公司；鹽酸吡格列酮（片）：成都迪康藥業(yè)有限公司；水合氯醛（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；多聚甲醛固定液（中性）：武漢賽維爾生物科技有限公司；葡萄糖（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total Cholesterol，TC）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（cereal third transaminase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒：南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒：武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；MLA（總生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80.81%，硅鎢酸沉淀法[14]）：河南省中藥質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心制備。

1.2 儀器與設(shè)備

快速檢測(cè)血糖儀、血糖試紙：江蘇魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司；iMARK酶標(biāo)儀：伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)艾本德公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物試驗(yàn)

雄性ICR小鼠60只，體重18 g～22 g，正常飼養(yǎng)1周后被隨機(jī)分為 6組（n=10）：正常對(duì)照組（NC）給予正常飲食和飲水；模型組（HF）給予正常飲食和30%果糖飲水；MLA低劑量組（MLA-40）給予正常飲食和30%果糖飲水，并灌胃MLA[40 mg/（kg·d）]；MLA中劑量組（MLA-80）給予正常飲食和30%果糖飲水，并灌胃MLA[80 mg/（kg·d）]；MLA高劑量組（MLA-160）給予正常飲食和30%果糖飲水，并灌胃MLA[160 mg/（kg·d）]；吡格列酮組（pioglitazone，Pio）給予正常飲食和30%果糖飲水，并灌胃鹽酸吡格列酮[4 mg/（kg·d）]。實(shí)驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行16周，實(shí)驗(yàn)完成后，所有動(dòng)物禁食12 h，以水合氯醛麻醉，摘眼球取血，在4℃條件下，3 000 r/min離心15 min，取血清用于血清生化指標(biāo)的檢測(cè)；迅速解剖取出肝臟，以生理鹽水沖洗干凈后，取一部分肝臟置于4%多聚甲醛固定液中，用于病理學(xué)檢測(cè)。

1.3.2 口服糖耐量試驗(yàn)

在實(shí)驗(yàn)的第16周，動(dòng)物禁食不禁水12 h，空腹時(shí)取尾尖血，用血糖儀測(cè)定空腹血糖，記為Glu0′，而后小鼠接受灌胃給予葡萄糖溶液（2 g/kg），在 30、60、90min和120 min測(cè)量小鼠血糖，分別記為Glu30′、Glu60′、Glu90′、Glu120′，并計(jì)算曲線下面積（area under the cure，AUC）作統(tǒng)計(jì)分析，AUC計(jì)算公式如下：

1.3.3 血清相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

小鼠血清中 TG、TC、ALT、AST、SOD 和 MDA 的檢測(cè)均采用商業(yè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，具體實(shí)驗(yàn)操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.4 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，H&E）染色

用于蘇木精-伊紅染色的肝組織在4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，制成厚度為5 μm的標(biāo)本，然后用蘇木精-伊紅試劑進(jìn)行染色。

1.3.5 炎癥因子的檢測(cè)

TNF-α、IL-1β和IL-6均使用商業(yè)ELISA試劑盒測(cè)定，具體實(shí)驗(yàn)操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析（oneway ANOVA）評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，然后進(jìn)行Dunnett’s posthoc檢驗(yàn)。p＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 MLA對(duì)高果糖代謝綜合征小鼠體重的影響

MLA對(duì)高果糖代謝綜合征小鼠體重的影響如表1所示。

表1 MLA對(duì)高果糖代謝綜合征小鼠體重的影響（n=10）Table 1 Effect of MLA on body weight of metabolic syndrome mice induced by high fructose（n=10）

與NC組相比，HF組小鼠的體重顯著升高（p＜0.05），吡格列酮（Pio）能顯著地降低高果糖飲食誘導(dǎo)代謝綜合征小鼠的體重（p＜0.05），給予MLA干預(yù)后，MLA-40組小鼠的體重與HF組相比無(wú)明顯變化，MLA-80組小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)體重與HF組相比雖有降低趨勢(shì)，卻無(wú)顯著性差異（p＞0.05），但其體重增加量與HF組相比有顯著性的降低（p＜0.05），而MLA-160組小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)體重和體重增加量與HF組相比有顯著性降低。這表明MLA對(duì)高果糖喂養(yǎng)導(dǎo)致小鼠體重增加有抑制作用。

2.2 MLA對(duì)高果糖代謝綜合征小鼠糖代謝的影響

各組小鼠的葡萄糖耐量測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 MLA對(duì)高果糖代謝綜合征小鼠口服葡萄糖耐量的影響（n=10）Table 2 Effect of MLA on oral glucose tolerance of metabolic syndrome mice induced by high fructose（n=10）

各組小鼠的空腹血糖和葡萄糖耐量曲線下面積測(cè)試統(tǒng)計(jì)如圖1所示。

圖1 MLA對(duì)高果糖代謝綜合征小鼠空腹血糖和葡萄糖耐量曲線下面積的影響（n=10）Fig.1 Effect of MLA on fasting blood-glucose and area under the oral glucose tolerance curve of metabolic syndrome mice induced by high fructose（n=10）

由圖1可知，經(jīng)過(guò)16周高果糖喂養(yǎng)后，HF組小鼠空腹血糖與NC組相比有升高趨勢(shì)，無(wú)顯著性差異，但其葡萄糖耐量曲線下面積高度顯著升高（p＜0.001），說(shuō)明HF組小鼠對(duì)葡萄糖的耐受能力出現(xiàn)了明顯的下降。經(jīng)過(guò)MLA的干預(yù)后，小鼠的空腹血糖與HF組相比有降低趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異；然而，與HF組相比，MLA三個(gè)劑量干預(yù)的小鼠葡萄糖耐量曲線下面積均高度顯著降低（p＜0.001），說(shuō)明小鼠的葡萄糖的耐受能力明顯提升。這表明MLA可以改善高果糖飲食導(dǎo)致的小鼠糖代謝紊亂。

2.3 MLA對(duì)高果糖代謝綜合征小鼠血脂影響

MLA對(duì)高果糖代謝綜合征小鼠血脂影響如圖2所示。

由圖2可知，HF組小鼠的TG和TC水平與NC組相比高度顯著升高（p＜0.001），說(shuō)明高果糖喂養(yǎng)的小鼠出現(xiàn)血脂異常，脂代謝紊亂；經(jīng)過(guò)MLA干預(yù)后，MLA三個(gè)劑量均可顯著降低高果糖喂養(yǎng)小鼠的TG水平，MLA-80、MLA-160可以顯著降低血清TC水平，MLA-40的血清TC水平與HF組相比雖無(wú)顯著性差異，但也有降低的趨勢(shì)。這表明MLA可以改善長(zhǎng)期高果糖喂養(yǎng)小鼠的血脂異常。

圖2 MLA對(duì)高果糖代謝綜合征小鼠血脂的影響（n=10）Fig.2 Effect of MLA on blood lipid of metabolic syndrome mice induced by high fructose（n=10）

2.4 MLA對(duì)高果糖代謝綜合征小鼠肝功能的影響

為探討MLA對(duì)高果糖飲食誘導(dǎo)的代謝綜合征小鼠肝功能的影響，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了小鼠的血清AST和ALT，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，與NC組小鼠相比，HF組小鼠經(jīng)過(guò)16周的高果糖飲食后血清中的AST和ALT均高度顯著升高，表明高果糖飲食已經(jīng)導(dǎo)致小鼠的肝功能受損；MLA-80、MLA-160均可有效地阻止血清AST和ALT的升高，MLA-40組小鼠的血清AST和ALT水平與HF組相比雖無(wú)顯著性差異，但也有一定的降低趨勢(shì)。這表明MLA能夠改善高果糖飲食導(dǎo)致的肝功能損傷。

圖3 MLA對(duì)高果糖代謝綜合征小鼠肝功能的影響（n=10）Fig.3 Effect of MLA on liver function of metabolic syndrome mice induced by high fructose（n=10）

2.5 MLA對(duì)高果糖代謝綜合征小鼠肝臟組織病理形態(tài)的影響

MLA對(duì)高果糖代謝綜合征小鼠肝臟組織病理形態(tài)（H&E）的影響如圖4所示。

圖4 MLA對(duì)高果糖代謝綜合征小鼠肝臟組織病理形態(tài)（H&E）的影響Fig.4 Effect of MLA on pathological morphology of liver tissue of metabolic syndrome mice induced by high fructose

由圖4可知，對(duì)各組小鼠進(jìn)行H&E染色分析，結(jié)果顯示，NC組小鼠肝組織靜脈分布均勻，周?chē)渭?xì)胞排列整齊緊密，呈放射狀，未見(jiàn)空泡。經(jīng)過(guò)16周高果糖飲食后，HF組小鼠的肝臟細(xì)胞明顯腫脹，靜脈周?chē)?xì)胞排列較亂，并有大量的空泡形成，這表明高果糖飲食損傷了小鼠的肝臟組織結(jié)構(gòu)，給予MLA干預(yù)后，MLA-40組小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)仍然存在明顯損傷；MLA-80組小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)可見(jiàn)少量損傷，相比于HF組明顯減少；MLA-160組小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)中幾乎看不到損傷。這表明MLA對(duì)高果糖飲食小鼠肝臟的組織結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用。

2.6 MLA對(duì)高果糖代謝綜合征小鼠血清中SOD和MDA的影響

MLA對(duì)高果糖代謝綜合征小鼠血清中SOD和MDA的影響如圖5所示。

圖5 MLA對(duì)高果糖代謝綜合征小鼠血清SOD和MDA的影響（n=10）Fig.5 Effect of MLA on serum SOD and MDA of metabolic syndrome mice induced by high fructose（n=10）

由圖5可知，HF組血清中SOD的活力相較于NC組出現(xiàn)高度顯著性下降（p＜0.001），經(jīng)過(guò)MLA的干預(yù)后，三個(gè)劑量組小鼠的血清SOD活力均有高度顯著回升（p＜0.001）；與NC組相比，HF組小鼠的血清MDA水平高度顯著升高（p＜0.001），經(jīng)過(guò)MLA的干預(yù)后，MLA-80、MLA-160組小鼠的血清MDA水平與HF組相比極顯著降低（p＜0.001），MLA-40組與HF組相比雖無(wú)顯著性差異，但也有一定的下降趨勢(shì)。這表明長(zhǎng)期高果糖飲食小鼠抗氧化能力下降，而MLA可以提高長(zhǎng)期高果糖飲食小鼠的抗氧化能力。

2.7 MLA對(duì)高果糖代謝綜合征小鼠炎癥因子的影響

為進(jìn)一步探索MLA改善高果糖代謝綜合征小鼠糖脂代謝的作用，實(shí)驗(yàn)采用ELISA法測(cè)定了各組小鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，結(jié)果如圖6所示。

圖6 MLA對(duì)高果糖代謝綜合征小鼠血清炎癥因子水平的影響（n=10）Fig.6 Effect of MLA on serum inflammatory factors of metabolic syndrome mice induced by high fructose（n=10）

圖6結(jié)果顯示，與NC組相比，HF組小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6的含量均顯著性升高（TNF-α：p＜0.001；IL-1β：p＜0.001；IL-6：p＜0.01）；與 HF 組相比，MLA-80組和MLA-160組小鼠血清TNF-α水平均有顯著性降低 （MLA-80：p＜0.05；MLA-160：p＜0.01），MLA-40組血清TNF-α水平雖無(wú)顯著性差異，但有一定的降低趨勢(shì)；與HF組相比，MLA-80組和MLA-160組小鼠血清IL-1β水平均有顯著性降低（MLA-80：p＜0.01；MLA-160：p＜0.001），MLA-40 組小鼠血清 IL-1β水平雖無(wú)顯著性差異，但有一定的降低趨勢(shì)。與HF組相比，MLA-80組和MLA-160組小鼠血清IL-6水平均有顯著性降低（MLA-80：p＜0.05；MLA-160：p＜0.01），MLA-40組血清IL-6水平雖無(wú)顯著性差異，但有一定的降低趨勢(shì)。以上結(jié)果表明MLA可以減輕高果糖飲食小鼠的炎癥反應(yīng)。

3 討論與結(jié)論

在本研究中，高果糖喂養(yǎng)16周的小鼠空腹血糖與正常組相比雖無(wú)顯著性差異，但其葡萄糖耐量已明顯受損，這表明高果糖飲食導(dǎo)致了小鼠的糖代謝異常。經(jīng)過(guò)MLA的干預(yù)后，小鼠葡萄糖耐量明顯改善，這表明MLA可以改善高果糖代謝綜合征小鼠的糖代謝紊亂。同時(shí)，高果糖飲食使小鼠的體重明顯增加，血清TC、TG水平顯著升高，說(shuō)明高果糖飲食的小鼠脂代謝也出現(xiàn)異常。長(zhǎng)期的脂代謝異常可導(dǎo)致肝組織受損，AST和ALT就會(huì)被釋放進(jìn)入血液，導(dǎo)致血液中AST和ALT水平升高[15]，在本研究中，高果糖飲食小鼠血清AST和ALT水平明顯升高，這說(shuō)明其肝臟已經(jīng)受到損傷，進(jìn)一步的病理結(jié)果分析顯示高果糖飲食的小鼠肝臟結(jié)構(gòu)出現(xiàn)損傷，這些結(jié)果證明了長(zhǎng)期高果糖飲食可以損傷小鼠的肝臟。而MLA干預(yù)后，高果糖飲食小鼠的體重增長(zhǎng)受到明顯的抑制，TC、TG水平顯著降低，這說(shuō)明MLA具有改善高果糖飲食小鼠脂代謝異常的作用，同時(shí)，經(jīng)MLA干預(yù)后，血清AST和ALT水平明顯降低，肝臟的結(jié)構(gòu)病變得到明顯改善，這些結(jié)果證實(shí)MLA對(duì)肝臟有一定的保護(hù)作用。

在肥胖和糖脂代謝紊亂的情況下，體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，引起氧化應(yīng)激，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物，誘使各種細(xì)胞因子釋放，從而引起機(jī)體的損傷[16]。大量研究表明肝組織的損傷與氧化應(yīng)激密切相關(guān)[17-18]，高果糖飲食引起肝損傷的機(jī)制與果糖可導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷有關(guān)[19-20]，SOD和MDA是反映機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)的重要指標(biāo)[21]，在本研究中，小鼠經(jīng)16周高果糖的喂養(yǎng)后，MDA水平明顯升高，抗氧化酶SOD水平顯著降低，這表明小鼠的抗氧化能力下降且氧化應(yīng)激增強(qiáng)。而MLA可以降低MDA水平，同時(shí)升高抗氧化酶SOD水平。這些結(jié)果表明MLA的肝臟保護(hù)作用與其能夠提升機(jī)體的抗氧化能力，改善高果糖飲食導(dǎo)致的氧化應(yīng)激有關(guān)。

TNF-α、IL-6和IL-1β是由多種炎癥細(xì)胞分泌的炎癥因子，有研究證實(shí)過(guò)量攝入果糖可導(dǎo)致體內(nèi)炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平升高[22]，在本研究中，小鼠經(jīng)16周高果糖喂養(yǎng)后，血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平出現(xiàn)了顯著性升高，這與既往的研究相符[22]，而MLA的干預(yù)可以抑制高果糖飲食導(dǎo)致的TNF-α、IL-6和IL-1β水平升高，表明MLA能夠減輕高果糖飲食導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。TNF-α、IL-6和IL-1β與糖代謝和脂代謝密切相關(guān)，研究表明降低血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平可以改善糖代謝和脂代謝[23-25]。這些結(jié)果表明MLA改善高果糖代謝綜合征小鼠糖脂代謝紊亂可能與其能降低血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，本研究證實(shí)了桑葉生物堿可以改善高果糖代謝綜合征小鼠的糖脂代謝紊亂，保護(hù)肝臟，其作用可能與改善機(jī)體氧化應(yīng)激和減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。桑葉被廣泛用作功能性或醫(yī)用添加劑，本研究可為桑葉防治果糖代謝綜合征及相關(guān)功能食品的研究與開(kāi)發(fā)提供試驗(yàn)依據(jù)。