杜 佳 劉真真 朱慧琪

甲狀腺癌是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌惡性腫瘤，是近年發(fā)病率升高最快的惡性腫瘤；甲狀腺癌起源于不同來(lái)源的甲狀腺細(xì)胞，根據(jù)病理類(lèi)型可分為乳頭狀癌、濾泡狀癌、未分化癌和髓樣癌，其中乳頭狀癌具有典型的乳頭狀結(jié)構(gòu)，常轉(zhuǎn)移到局部淋巴結(jié)[1,2]。微小RNA(MicroRNA，miRNA)作為一種新型的小分子標(biāo)記物，受到了廣泛的關(guān)注，許多證據(jù)表明miRNA參與了人類(lèi)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3]。研究[4-6]指出，miR-150、miR-374通過(guò)抑制細(xì)胞增殖參與腫瘤發(fā)生；miR-451與腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移等過(guò)程聯(lián)系緊密。目前尚未有研究將三者在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)情況進(jìn)行對(duì)比，本研究測(cè)定miR-150、miR-451和miR-374在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)情況，評(píng)估其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，希望為患者治療方案的選擇、甲狀腺癌的發(fā)展機(jī)制提供數(shù)據(jù)參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年12月至2020年12月甲狀腺癌根治術(shù)中留取的存檔蠟塊和癌旁正常組織(距病變部位>5 cm處，且證實(shí)為無(wú)癌浸潤(rùn))石蠟標(biāo)本104例，男性19例，女性85例，年齡38～63歲，平均(50.94±5.23)歲；術(shù)前血清促甲狀腺激素水平(2.37±0.98)μIU/ml；腫瘤直徑(1.03±0.33)cm；TNM分期：Ⅱ期51例、Ⅲ期39例、Ⅳ期14例；病灶數(shù)量：?jiǎn)尾≡?8例、多病灶52例；頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例。

1.2 納入、排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①行甲狀腺癌根治手術(shù)；②經(jīng)細(xì)胞學(xué)及組織學(xué)病理確診為甲狀腺乳頭狀癌患者；③有完整的臨床檢查資料；④經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，患者自愿參與本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有其他惡性腫瘤者；②合并嚴(yán)重感染及出血者；③合并血液系統(tǒng)疾病或傳染病等；④合并肝臟轉(zhuǎn)移、病毒性肝炎者；⑤孕婦或妊娠患者；⑥合并精神障礙；⑦合并嚴(yán)重心肝腎功能障礙者。

1.3 qPCR檢測(cè)[7]

收集全部研究對(duì)象存檔蠟塊中的甲狀腺組織100 mg，在液氮保護(hù)下研磨，與1 ml TRIzoI、200 μl氯仿混合后進(jìn)行離心，通常RNA分布于上層無(wú)色水相中；取上層液進(jìn)行RNA沉淀，管底出現(xiàn)白色沉淀，將獲得的白色沉淀進(jìn)行洗滌和溶解，DU800型分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度及純度；隨即進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將獲得的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-20 ℃的冰箱中。qPCR技術(shù)檢測(cè)中miR-150、miR-451和miR-374水平，Real-time qPCR引物合成由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司提供，PCR引物序列中miR-150、miR-451和miR-374引物分別為：上游引物5'-ACACTCCAGGTGGGTCTCCCAATTCAGTTGAGGACTGG-3',5'-ATTGCACTTGTCTCGGTCTG-3',5'-CTCCAGAGTTATAATACAAC-3'；下游引物5'-TGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCACTGG-3',5'-CTCAACTGGTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTTACAG-3',5'-CACTTATCAGGGCACAGA-3'。內(nèi)參照基因?yàn)閁6 RNA。嚴(yán)格按照Access RT-PCR System試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。由SDS軟件計(jì)算每個(gè)樣品和內(nèi)參的Ct值，△Ct=Ct目標(biāo)基因-Ct內(nèi)參基因，受試者miRNA的相對(duì)表達(dá)水平=2-△△Ct。

1.4 觀察指標(biāo)

①miR-150、miR-451和miR-374在甲狀腺癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)；②收集104例甲狀腺乳頭狀癌患者臨床資料，包括年齡、性別、病灶數(shù)量、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、被膜侵犯及腫瘤直徑情況，分析miR-150、miR-451和miR-37表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系；③miR-150、miR-451和miR-37的相關(guān)性分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 miR-150、miR-451及miR-374在甲狀腺乳頭狀癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)

miR-150、miR-451及miR-374在甲狀腺乳頭狀癌組織中的相對(duì)表達(dá)量均顯著低于癌旁組織(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 miR-150、miR-451及miR-374在甲狀腺乳頭狀癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)

2.2 miR-150、miR-451及miR-374表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

TNM分期為T(mén)3～4期、合并被膜侵犯的甲狀腺乳頭狀癌組織miR-150、miR-451及miR-374表達(dá)均顯著低于T2期、未合并被膜侵犯的癌組織，合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺乳頭狀癌組織中miR-451表達(dá)均顯著低于未合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織(P<0.05)；甲狀腺乳頭狀癌組織中miR-150、miR-451及miR-374表達(dá)與性別、年齡、病灶數(shù)量、腫瘤直徑未見(jiàn)明顯相關(guān)性(P>0.05)，如表2。

表2 miR-150、miR-451及miR-374表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 miR-150、miR-451及miR-374的相關(guān)性分析

甲狀腺乳頭狀癌組織中miR-150的表達(dá)與miR-451、miR-374表達(dá)均呈顯著正相關(guān)，miR-451與miR-374相對(duì)表達(dá)量呈顯著正相關(guān)性(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 miR-150、miR-451及miR-374的相關(guān)性分析

3 討論

甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，主流觀點(diǎn)認(rèn)為[8-9]該病是一個(gè)多階段、多基因調(diào)控的過(guò)程，如基因調(diào)控、機(jī)體免疫、淋巴和腫瘤血管生成等。mi-RNA是一類(lèi)非編碼單鏈小分子，參與多種疾病過(guò)程，同時(shí)調(diào)控細(xì)胞分化、免疫應(yīng)答等多種過(guò)程，存在于易提取的外周血循環(huán)系統(tǒng)中，對(duì)于疾病的無(wú)創(chuàng)診斷、評(píng)估患者預(yù)后的應(yīng)用中有很大潛力[10-12]。

有研究稱(chēng)[13]miR-150一般作為抑癌基因調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖，大腸癌患者血清中miR-150表達(dá)明顯下調(diào)，可靶向調(diào)控膠質(zhì)細(xì)胞弱化大腸癌的細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力。本研究中，miR-150在甲狀腺乳頭狀癌組織中的相對(duì)表達(dá)量顯著低于癌旁組織，且與甲狀腺乳頭狀癌被膜侵犯、TNM分期密切相關(guān)，甲狀腺被膜的侵犯與甲狀腺細(xì)胞外基質(zhì)抑制甲狀腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的作用減弱，腫瘤侵襲甲狀腺包膜致密淋巴結(jié)網(wǎng)有關(guān)，將提升腫瘤的侵襲性，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵步驟，以上結(jié)果提示miR-150參與調(diào)節(jié)甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)展。李霞等[14]的研究對(duì)在乳腺癌組織中發(fā)現(xiàn)miR-374呈高表達(dá)，且能調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。這與本研機(jī)結(jié)論不一致，本研究中，與癌旁組織相較，miR-374在甲狀腺乳頭狀癌組織中下調(diào)，與患者被膜侵犯、TNM分期密切相關(guān)，提示miR-374參與了甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)展，考慮是因?yàn)閙iR-374在不同腫瘤細(xì)胞中的作用不相同，導(dǎo)致在乳腺癌細(xì)胞、甲狀腺乳頭狀癌組織中呈現(xiàn)相反的變化趨勢(shì)。

無(wú)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌惡性程度較低，但合并頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌侵襲性更強(qiáng)，可顯著影響患者的預(yù)后和術(shù)后生存率，目前常規(guī)的超聲和CT檢查對(duì)判定是否合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在局限性，如果能從血液中提取出穩(wěn)定、特異、靈敏的生物學(xué)指標(biāo)，有助于能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，對(duì)于甲狀腺癌患者手術(shù)方式的選擇而言，具有重要的臨床意義。miR-451位于第17號(hào)染色體著絲粒附近，其序列完全保守，形成過(guò)程中直接由AGO蛋白質(zhì)剪切成熟而不經(jīng)過(guò)核糖核酸內(nèi)切酶，被證實(shí)在多種惡性腫瘤中呈負(fù)表達(dá)[15]。本研究表明，miR-451在甲狀腺乳頭狀癌組織中的相對(duì)表達(dá)量顯著低于癌旁組織，且與甲狀腺乳頭狀癌被膜侵犯、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)，提示miR-451在判斷甲狀腺乳頭狀癌患者是否合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中具有一定的應(yīng)用潛力，考慮原因：miR-451可能通過(guò)下調(diào)靶基因MIF、MMP-9，或抑制AMPK通路，實(shí)現(xiàn)對(duì)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)的調(diào)控，促進(jìn)疾病進(jìn)展。值得注意的是，miR-150、miR-451及miR-374在癌組織中的表達(dá)水平呈正相關(guān)，考慮與三者對(duì)甲狀腺乳頭狀癌增殖、生長(zhǎng)的調(diào)控作用相關(guān)，但目前miR-150、miR-451及miR-374的內(nèi)在聯(lián)系尚未明確，有待基礎(chǔ)性研究進(jìn)行闡明。

綜上所述，miR-150、miR-451及miR-374在甲狀腺乳頭狀癌組織中的異常表達(dá)，三者均與臨床分期密切相關(guān)，其中miR-451的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有顯著相關(guān)性，由此推測(cè)，三者與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生過(guò)程相關(guān)，miR-451可以用于預(yù)測(cè)患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。但本研究屬于回顧性研究，樣本容量有限，有待開(kāi)展大樣本、前瞻性研究，探究甲狀腺乳頭狀癌患者體內(nèi)miR-150、miR-451及miR-374表達(dá)情況。