白茹玥，高鑫媛，魏金月，李 哲，趙紅玲，唐世英

（承德醫(yī)學院/河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，河北承德 067000）

2020版《中國藥典》規(guī)定，藥用柴胡來源于傘形科植物柴胡Bupleurum chinensis DC.和狹葉柴胡Bpleurum scorzonerifolium Wild.的干燥根，具有和解表里，疏肝解郁，升舉升陽之功效[1]。柴胡中主要含有皂苷、黃酮、揮發(fā)油等成分，其主要生物活性成分和藥效成分是柴胡皂苷（saikosaponins）[2-4]。在已提取出的皂苷成分中，柴胡皂苷a、c和d三種皂苷成分含量較高[3]。《中國藥典》中只規(guī)定了柴胡皂苷a、d作為檢測指標，然而因柴胡皂苷c具有保肝、抗癌、免疫調節(jié)等作用[5]，故本文也加入檢測指標中。

目前，我國使用的含柴胡的中成藥品種超過500個，各品種的組方和柴胡用量差異較大[6]。此外，由于各地用藥習慣不同而導致市場流通使用的的柴胡品種良莠不齊，在一定程度上造成柴胡藥材質量的難以控制。不同來源的柴胡其皂苷含量也相差甚遠，有些品類甚至無法檢測出皂苷成分[7]?，F(xiàn)有觀點，普遍認為野生柴胡的皂苷含量比栽培柴胡的皂苷含量高，其中根色偏深的柴胡皂苷含量更高。為探究栽培柴胡和野生柴胡之間的皂苷含量差別及柴胡根色與皂苷含量之間的關系，本研究建立了HPLC檢測柴胡皂苷a、b和c含量方法，分別對不同產(chǎn)地的栽培柴胡及承德當?shù)氐囊吧窈M行皂苷含量測定，并對其根色和皂苷含量進行相關性分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器 賽默飛UltiMate 3000超高效液相色譜儀(美國Thermo Scientific公司)，Supelco Discovery C18（4.6mm×250mm，5Di），超聲波清洗器（SB-5200DT，寧波新芝生物科技股份有限公司），分析天平（SQP，德國Sartorius公司）。

1.1.2 試劑 甲醇、乙腈（均為國產(chǎn)色譜純），氨水（國產(chǎn)分析純），柴胡皂苷a標準品（批號：19103004，HPLC≥98%，成都普菲德生物技術有限公司），柴胡皂苷c標準品（批號：20081202，HPLC≥98%，成都格利普生物科技有限公司），柴胡皂苷d標準品（16121402，HPLC≥98%，成都普菲德生物技術有限公司），超純水。

1.1.3 樣品 在市場購買的不同產(chǎn)地14批北柴胡（編號1～14）以及河北省承德地區(qū)采集的野生北柴胡13批（編號15～27），經(jīng)承德醫(yī)學院趙春穎教授鑒定為傘形科正品北柴胡（Bupleurum chinense DC.），各樣品詳情見表1；根的顏色根據(jù)肉眼分辨，分為黑色根、棕色根、黃色根三種，見圖1。

圖1 樣品根色圖

表1 樣品信息

1.2 實驗方法

1.2.1 標準品溶液制備 分別精密稱定柴胡皂苷a標準品4.012mg、柴胡皂苷d標準品5.660mg、柴胡皂苷c標準品4.120mg于10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻即得柴胡皂苷標準品溶液。

1.2.2 供試品溶液制備 取柴胡藥材粉末（過4號篩）0.500g，置50ml錐形瓶中，加入5%氨水甲醇溶液25ml，密閉，于30℃超聲30min，過濾，用20ml甲醇分兩次潤洗濾渣及錐形瓶，合并濾液，回收溶劑蒸發(fā)至干，殘渣加甲醇溶解，轉移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

1.2.3 色譜條件 流動相：乙腈（A）—水（B），梯度洗脫，洗脫條件詳見表2；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：220nm；進樣量：10μl。在此條件下，3種皂苷分離情況良好。

表2 乙腈-水梯度洗脫表

1.3 方法學考察

1.3.1 穩(wěn)定性考察 精密吸取同一供試品溶液10μl，分別于0、1、2、4、8、12、24h進樣，記錄HPLC色譜圖，柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d的色譜峰相對峰面積RSD 值分別為1.21%、1.43%、1.65%，均小于2%，表明樣品在24h內穩(wěn)定性良好。

1.3.2 精密度考察 精密吸取同一供試品溶液10μl，按1.2.2項方法制備供試品溶液，連續(xù)重復進樣6次，分別記錄3種柴胡皂苷的峰面積，其RSD值分別為0.52%、0.25%、0.84%， 表明該儀器的精密度良好。

1.3.3 線性關系考察 將對照品溶液分別稀釋0.5、0.25、0.125、0.06倍，精密吸取稀釋后的溶液10μl注入HPLC儀進行檢測，記錄峰面積，以對照品質量為橫坐標，峰面積值為縱坐標，繪制標準曲線，其回歸方程見表3。

表3 線性關系表

1.3.4 重復性考察 取同一批次柴胡樣品，按照1.2.2項制備供試品溶液6份，注入HPLC儀進樣檢測，以峰面積計算各成分含量及其RSD值。結果得6份供試品溶液中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、柴胡皂苷c的RSD值分別為1.94%、2.12%、1.87%，說明該方法重復性良好。

1.3.5 加樣回收率考察 分別精密稱取6份同一批次柴胡樣品0.25g，分別加入柴胡皂苷a、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d對照品溶液各100μl，按1.2.2項方法制備供試品溶液，測定柴胡皂苷a、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d的含量，計算平均回收率分別為98.72%、101.28%、101.25%。

2 結果

2.1 標準品測定

根據(jù)上述實驗方法進行柴胡皂苷含量測定，標準品色譜圖見圖2，供試品色譜圖見圖3，詳細結果見表4。

圖2 標準品樣品色譜圖

圖3 供試品樣品色譜圖

2.2 樣品測定

取上述27批柴胡樣品，按1.2.2項方法制備供試品溶液進行測定，計算各個批次柴胡中柴胡皂苷a、d、c的含量（見表4）。可以看出，柴胡皂苷a含量最高的是甘肅康縣的人工栽培北柴胡，含量為0.53%，最低的是河北省承德縣的野生北柴胡，含量僅為0.03%；柴胡皂苷d含量最高的是甘肅渭源的北柴胡，含量為0.99%，最低的是河北省壽王墳鎮(zhèn)的野生北柴胡，含量僅為0.05%；其中大部分野生北柴胡沒有檢測出柴胡皂苷c，栽培北柴胡均檢測出柴胡皂苷c，其中含量最高的是甘肅康縣的北柴胡，含量為0.15%。根據(jù)《中國藥典》規(guī)定，柴胡皂苷a和d總量不得低于0.3%，在上述27批樣品中，柴胡皂苷a、d總和最高的是甘肅渭源縣的栽培北柴胡，含量高達1.51%，最低的是河北省承德縣的野生北柴胡，含量僅為0.07%，不符合藥典規(guī)定的0.3%。其中，甘肅、陜西兩地的栽培柴胡的質量明顯高于河北省承德市周邊采集的野生柴胡，這可能與人工種植技術、柴胡生長年份有關，還需進一步實驗驗證。

表4 27批柴胡3種柴胡皂苷含量（%）

2.3 相關性分析

相關性分析結果詳見圖4。由圖4可知，柴胡皂苷a含量與黃色根和黑色根呈顯著性相關；柴胡皂苷d含量和棕色根和黑色根呈顯著性相關，柴胡皂苷c和根色無相關性。其中黃色根的柴胡皂苷a、柴胡皂苷d含量最高，隨著根色的加深，柴胡皂苷a、d含量逐漸降低，而根色對柴胡皂苷c幾乎無影響。

圖4 根色與柴胡皂苷含量相關性分析

3 討論

2020年版《中國藥典》只規(guī)定了柴胡 Bupleurum chinensis DC.和狹葉柴胡Bpleurum scorzonerifolium Wild.作為藥用柴胡來源，然而中藥藥理學研究發(fā)現(xiàn)，柴胡皂苷c不僅含量較高，還具有抗癌、保肝、提高免疫力的作用[5]。所以，加入柴胡皂苷c作為指標性成分來測定。本研究中共測定27批樣品，分別來自甘肅省、陜西省、山西省、吉林省、河南省、四川省、內蒙古、河北省，分為野生采集和人工栽培兩類。通過實驗發(fā)現(xiàn)，甘肅、陜西兩省栽培北柴胡皂苷含量較高，河北省周邊野生北柴胡含量較低，分析原因可能是地產(chǎn)區(qū)環(huán)境和栽培技術手段對其質量有較大影響，所以導致其皂苷含量不高。

在市場購買中，人們普遍認為野生的、根色深的柴胡入藥效果更好，然而從本實驗檢測結果來看，栽培北柴胡的皂苷含量明顯高于承德地區(qū)野生北柴胡。無論是栽培品種還是野生品種，均是黃色根的柴胡皂苷a、d含量最高。通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量隨根部顏色的加深而逐漸減少，而根色對柴胡皂苷c含量幾乎無影響。根據(jù)徐潔森等[8]對柴胡皂苷生物合成的細胞色素P450酶基因的研究初步確定，細胞色素P450基因可能參與柴胡皂苷生物合成中，本實驗也側面證明了細胞色素對柴胡有效成分皂苷的影響。

通過對柴胡的性狀觀察發(fā)現(xiàn)，人工栽培的柴胡多數(shù)偏黃色，在形態(tài)、皂苷含量上均優(yōu)于野生柴胡?？蛇M行下一步實驗，以驗證其細胞色素P450基因對柴胡皂苷生物合成的影響。也為柴胡質量評價標準提供新依據(jù)。