張 淞， 胡曉娟， 徐 煜,3， 徐創(chuàng)文， 楊 鏗， 蘇浩昌， 徐武杰,3， 文國樑， 張建設(shè)， 曹煜成,3*

(1.浙江海洋大學(xué) 國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，浙江 舟山 316022；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300；3.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心，廣東 茂名 525000)

在集約化高密度養(yǎng)殖過程中，殘料、糞便、養(yǎng)殖生物尸體、漁藥等的積累易造成水體氨氮、亞硝酸鹽等有害物質(zhì)含量的升高，導(dǎo)致水質(zhì)惡化[1-3]，從而對(duì)養(yǎng)殖生物產(chǎn)生脅迫或毒害，甚至致其死亡[4-5]。目前，常用去除養(yǎng)殖水體的氨氮、亞硝酸鹽的方法包括物理法、化學(xué)法和生物法[6-7]。其中，生物法一般指利用微生物菌劑去除水體的有害氮素，這種方法具有成本低、無耐藥性、無二次污染、易操作、效果好等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛運(yùn)用[8-10]。硝化菌因其能通過硝化作用將養(yǎng)殖水體中氨氮、亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為硝酸鹽[11-12]，而成為去除水體有害氮素的微生物菌劑之一[13-14]。陳旭等[15]研究了硝化菌對(duì)養(yǎng)殖加州鱸魚的池塘水質(zhì)的影響發(fā)現(xiàn)，硝化菌能夠顯著降低池塘水體中亞硝酸鹽的濃度、減緩水體總氮的上升，以及穩(wěn)定水體pH。胡曉娟等[16]研究結(jié)果顯示，硝化菌XH1對(duì)氨氮和亞硝酸鹽均有顯著的去除效果，對(duì)氨氮、亞硝酸鹽的最高降解率分別達(dá)到97%、68%。Kuhn等[17]用市售硝化菌菌劑產(chǎn)品測定了養(yǎng)殖南美白對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)水體中氨氮、亞硝酸鹽的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加了硝化菌菌劑產(chǎn)品的水體中氨氮、亞硝酸鹽的含量顯著低于對(duì)照組。紅球菌(Rhodococcussp.)是湖泊、海洋等水體中常見的微生物，因其能有效降解多種化合物，常被應(yīng)用于生物脫硫、工業(yè)污水處理等[18-19]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)了紅球菌的硝化功能，具有應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的前景。王淼等[20]研究結(jié)果顯示，嗜吡啶紅球菌(Rhodococcuspyridinovorans)P1-2對(duì)養(yǎng)殖羅非魚水體中的氨氮去除率最高能達(dá)到94%以上。田雅潔等[21]報(bào)道了玫瑰紅紅球菌XH2不僅對(duì)各環(huán)境因子具有良好的適應(yīng)性，還能顯著降解水體中的氨氮濃度，證實(shí)了其硝化作用與活菌數(shù)呈正比。由此可見，細(xì)菌數(shù)量的提高是保證其硝化作用的前提。硝化菌的菌株特性和功能效果是前人關(guān)注的焦點(diǎn)，而由硝化菌菌株到菌劑產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化過程中，菌株生產(chǎn)工藝的優(yōu)化是研發(fā)硝化菌菌劑產(chǎn)品的重要環(huán)節(jié)。曹煜成等[22]從對(duì)蝦養(yǎng)殖尾水中篩選出一株硝化菌——赤紅球菌(Rhodococcusruber)HDRR2Y，經(jīng)證實(shí)該菌株環(huán)境適應(yīng)性良好，在鹽度10～40、溫度20～40 ℃、pH 6～8條件下，該菌株對(duì)養(yǎng)殖水體中的無機(jī)氮具有顯著的降解效果，其中對(duì)氨氮的最高降解率可達(dá)98.8%，有潛力成為硝化菌菌劑的備選菌株。本研究選擇赤紅球菌HDRR2Y作為研究對(duì)象，采用響應(yīng)面分析法對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳發(fā)酵參數(shù)，擬提高赤紅球菌HDRR2Y的活菌數(shù)，為硝化菌菌劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 硝化菌——赤紅球菌(Rhodococcusruber)HDRR2Y由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所提供，該菌種保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC NO：M2019009)，并申請發(fā)明專利，申請?zhí)枮?02010159584.2。

1.1.2 培養(yǎng)基 發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：C2H3NaO2·3(H2O) 3.0，酵母膏1.8，MgSO40.2，KH2PO40.5，CaCl20.5，NaCl 9.0，MnSO40.025，F(xiàn)eSO40.05，C5H9NO40.002。

1.1.3 主要儀器及設(shè)備 超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1FD，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；三層全溫振蕩培養(yǎng)箱(ZQZY-88CV，上海知楚儀器有限公司)；pH計(jì)(PHB-3，上海三信儀表廠)；立式壓力蒸汽滅菌鍋(LDZX-50KBS，上海申安醫(yī)療器械廠)；恒溫培養(yǎng)箱(BPC-150F，上海一恒科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 單因素實(shí)驗(yàn) 分別用不同的碳源(葡萄糖、糖蜜、麩皮、可溶性淀粉、乙酸鈉∶葡萄糖∶糖蜜=3∶1∶1，質(zhì)量比)替換發(fā)酵培養(yǎng)基中的乙酸鈉，其余成分相同，篩選出活菌數(shù)最高的碳源培養(yǎng)基。再分別用不同氮源(蛋白胨、氯化銨、豆粕、酵母膏∶蛋白胨∶氯化銨=1∶1∶1，質(zhì)量比)替換碳源培養(yǎng)基中的酵母膏，其余成分相同，篩選出活菌數(shù)最高的氮源培養(yǎng)基。碳、氮源培養(yǎng)基初始接種量均為1%(體積分?jǐn)?shù))，30 ℃、200 r/min 培養(yǎng)36 h，各培養(yǎng)基的活菌數(shù)通過平板菌落計(jì)數(shù)法[23]計(jì)算。

1.2.2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn) 搖瓶培養(yǎng)中影響微生物生長的重要因素有溫度、pH、轉(zhuǎn)速、接種活菌數(shù)、裝液量[24]，赤紅球菌HDRR2Y來源于海水養(yǎng)殖尾水，鹽度對(duì)菌株生長同樣起重要作用，因此選定碳源、氮源、溫度、pH、轉(zhuǎn)速、鹽度、接種活菌數(shù)、裝液量8個(gè)因素進(jìn)行Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明[22]，赤紅球菌HDRR2Y在溫度20～30 ℃、pH 7～8、轉(zhuǎn)速150～225 r/min、鹽度15～30、接種活菌數(shù)(1×104)～(3×104) cfu/mL、裝液量40%～60%的條件范圍均有較好的生長，以此確定響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中各因素的最低、最高水平。該實(shí)驗(yàn)在Design Expert 11軟件中進(jìn)行設(shè)計(jì)，赤紅球菌HDRR2Y的活菌數(shù)為響應(yīng)值，從碳、氮源等8個(gè)因素中篩選出顯著影響活菌數(shù)的因素。

1.2.3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn) 在Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的變化方向及步長取決于顯著因素的正負(fù)效應(yīng)，確定最大值響應(yīng)區(qū)域與水平，構(gòu)建擬合方程。

1.2.4 Box-Behnken實(shí)驗(yàn) 在Design Expert 11軟件中對(duì)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三因素三水平設(shè)計(jì)，試驗(yàn)由5個(gè)中心實(shí)驗(yàn)及12個(gè)析因?qū)嶒?yàn)組成，共17個(gè)組合，以此得出回歸方程及理論最高活菌數(shù)。

1.2.5 搖瓶驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 采用搖瓶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)得出的回歸方程及理論最高活菌數(shù)的合理性。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 20.0檢驗(yàn)單因素實(shí)驗(yàn)組內(nèi)各培養(yǎng)基活菌數(shù)的差異性。采用Design-Expert 11對(duì)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)以及Box-Behnken實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

通過單因素實(shí)驗(yàn)，測試了不同碳源、氮源對(duì)赤紅球菌HDRR2Y的影響。由圖1a可知，乙酸鈉組(So)活菌數(shù)最高，培養(yǎng)36 h后的活菌數(shù)為1.8×108cfu/mL，顯著高于另外5組(P<0.05)，因此，選擇乙酸鈉作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源。以酵母膏+蛋白胨+氯化銨組(Y+Pe+A)做氮源，培養(yǎng)36 h時(shí)活菌數(shù)最高，可達(dá)3.37×108cfu/mL，顯著高于另外3組(P<0.05)(圖1b)。因此，選擇酵母膏∶蛋白胨∶氯化銨=1∶1∶1(質(zhì)量比)作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 不同碳源(a)、氮源(b)對(duì)赤紅球菌HDRR2Y活菌數(shù)的影響Fig.1 Effect of different carbon sources (a) and nitrogen sources (b) on the amount of Rhodococcus ruber HDRR2YB:麩皮；St:可溶性淀粉；So:乙酸鈉；G:葡萄糖；M:糖蜜；So+G+M:乙酸鈉+葡萄糖+糖蜜；Y+Pe+A:酵母膏+蛋白胨+氯化銨；Sm:豆粕；Y:酵母膏；Pe:蛋白胨。字母相同與不同分別表示差異顯著(P<0.05)與不顯著(P>0.05)B: bran; St: starch; So: sodium acetate; G: glucose; M: molasses; So+G+M: sodium acetate+glucose+molasses;Y+Pe+A: yeast extract+peptone+ammonium chloride; Sm: soybean meal; Y: yeast; Pe: peptone. The same letters and different letters in figure 1 indicate significant differences (P<0.05) and insignificant differences(P>0.05), respectively

2.2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果 8個(gè)影響因素對(duì)赤紅球菌HDRR2Y活菌數(shù)的影響順序?yàn)橐宜徕c>溫度>(酵母膏+蛋白胨+氯化銨)>接種活菌數(shù)>pH>裝液量>轉(zhuǎn)速>鹽度。其中，乙酸鈉、溫度、酵母膏+蛋白胨+氯化銨對(duì)赤紅球菌HDRR2Y的活菌數(shù)影響顯著(P<0.05)，其他5個(gè)因素對(duì)赤紅球菌HDRR2Y的活菌數(shù)影響不顯著(P>0.05)(表1)。因此，選擇乙酸鈉、溫度、酵母膏+蛋白胨+氯化銨三個(gè)因素進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與多元回歸分析

2.2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果 赤紅球菌HDRR2Y的活菌數(shù)隨乙酸鈉、酵母膏+蛋白胨+氯化銨、溫度逐步增加呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，當(dāng)乙酸鈉質(zhì)量濃度6 g/L, 酵母膏+蛋白胨+氯化銨質(zhì)量濃度4.6 g/L，溫度30 ℃時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到最大值，以此為基礎(chǔ)進(jìn)行Box-Behnken實(shí)驗(yàn)(表2)。

表2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2.3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3、表4，以此為基礎(chǔ)進(jìn)行回歸分析，得到關(guān)于乙酸鈉(A)、酵母膏+蛋白胨+氯化銨(B)和溫度(C)的二次回歸方程:Y=16.02-0.66A+0.80B-0.50C+0.60AB+1.56AC-0.26BC-2.42A2-2.08B2-2.15C2，表5顯示回歸模型達(dá)到了極顯著水平(P<0.001)，說明該模型可信度高。判定系數(shù)R2為0.983 8(R2>0.9)，失擬項(xiàng)為0.497 7(P>0.05)，進(jìn)一步說明模型擬合且可靠。實(shí)驗(yàn)變量乙酸鈉(A)、酵母膏+蛋白胨+氯化銨(B)、溫度(C)的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)均對(duì)赤紅球菌HDRR2Y的活菌數(shù)影響顯著，乙酸鈉(A)與酵母膏+蛋白胨+氯化銨(B)的交互作用對(duì)赤紅球菌HDRR2Y的活菌數(shù)影響顯著，乙酸鈉(A)和溫度(C) 的交互作用對(duì)赤紅球菌HDRR2Y的活菌數(shù)影響同樣顯著，說明三個(gè)變量間有比較大的交互作用。Box-Behnken實(shí)驗(yàn)的曲面圖的曲面開口向上與向下分別代表響應(yīng)值存在極大值與極小值；等高線圖的等高線呈橢圓形與圓形分別表示各因素間的交互作用對(duì)響應(yīng)值影響顯著與不顯著[25]。乙酸鈉用量與酵母膏+蛋白胨+氯化銨用量對(duì)赤紅球菌HDRR2Y活菌數(shù)的影響見圖2，曲面開口向下且曲線陡峭、等高線橢圓形表明乙酸鈉用量與酵母膏+蛋白胨+氯化銨用量的交互效應(yīng)顯著。乙酸鈉用量與溫度對(duì)赤紅球菌HDRR2Y活菌數(shù)的影響見圖3，曲面開口向下且曲線陡峭、等高線橢圓形表明乙酸鈉用量與溫度的交互效應(yīng)顯著。酵母膏+蛋白胨+氯化銨用量與溫度對(duì)赤紅球菌HDRR2Y活菌數(shù)的影響見圖4，等高線圓形表明酵母膏+蛋白胨+氯化銨用量與溫度的交互效應(yīng)不顯著，說明赤紅球菌HDRR2Y攝取酵母膏+蛋白胨+氯化銨中的營養(yǎng)物質(zhì)受溫度影響較小。

表3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素及與水平設(shè)計(jì)

表4 Box-Behnken設(shè)計(jì)及結(jié)果

表5 回歸分析結(jié)果

2.3 搖瓶驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

經(jīng)過回歸分析，最終得出赤紅球菌HDRR2Y的最佳發(fā)酵培養(yǎng)參數(shù)分別為乙酸鈉5.48 g/L、酵母膏+蛋白胨+氯化銨4.96 g/L、溫度29.24 ℃、pH 7.0、轉(zhuǎn)速200 r/min、MgSO40.2 g/L、KH2PO40.5 g/L、NaCl 9 g/L、CaCl20.5 g/L、MnSO40.025 g/L、FeSO40.05 g/L、C5H9NO40.002 g/L、裝液量40%(體積分?jǐn)?shù))、接種活菌數(shù)1×104cfu/mL、培養(yǎng)時(shí)間36 h。在該條件下，通過回歸分析得出的理論活菌數(shù)為1.62×109cfu/mL，通過搖瓶驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到的實(shí)際活菌數(shù)為1.54×109cfu/mL，兩者之間無顯著性差異(P>0.05)，但遠(yuǎn)高于未經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化前的活菌數(shù)(1.8×108cfu/mL)(P<0.01)。

圖2 乙酸鈉和酵母膏+蛋白胨+氯化銨對(duì)赤紅球菌HDRR2Y活菌數(shù)作用的響應(yīng)面分析曲面和等高線圖Fig.2 Response surface analysis surface plot and contour plot of the effect of sodium acetate and yeast extract+peptone+ammonium chloride on the amount of Rhodococcus ruber HDRR2Y

圖3 乙酸鈉和溫度對(duì)赤紅球菌HDRR2Y活菌數(shù)作用的響應(yīng)面分析曲面和等高線圖Fig.3 Response surface analysis surface plot and contour plot of the effect of sodium acetate and temperature on the amount of Rhodococcus ruber HDRR2Y

圖4 酵母膏+蛋白胨+氯化銨和溫度對(duì)赤紅球菌HDRR2Y活菌數(shù)作用的響應(yīng)面分析曲面和等高線圖Fig.4 Response surface analysis surface plot and contour plot of the effect of yeast extract+peptone+ammonium chloride and temperature on the amount of Rhodococcus ruber HDRR2Y

3 討 論

響應(yīng)面分析法是應(yīng)用廣泛的微生物發(fā)酵培養(yǎng)參數(shù)優(yōu)化方法之一，可顯著提高微生物活菌數(shù)。Mazzucotelli等[26]通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化了蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis)的發(fā)酵培養(yǎng)參數(shù)，提高了其產(chǎn)量；馬樂等[27]采用響應(yīng)面法對(duì)蠟狀芽胞桿菌(Bacilluscereus)Km121的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，活菌數(shù)提高了35.2%；孫文等[28]通過單因素實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)將短短芽胞桿菌(Brevibacillusbrevis)ch2-22的芽胞量提高了3.7倍。本研究通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化獲得赤紅球菌HDRR2Y的最優(yōu)培養(yǎng)基配方，培養(yǎng)36 h活菌數(shù)由1.8×108cfu/mL顯著提高到1.54×109cfu/mL。

碳源是微生物進(jìn)行生命活動(dòng)所需能量的來源，也是構(gòu)成微生物細(xì)胞及其代謝產(chǎn)物的碳素來源[29]。氮源是微生物細(xì)胞中酶、核酸、蛋白質(zhì)等以及微生物代謝產(chǎn)物的氮素來源[30]。微生物對(duì)各種碳源及氮源需求廣泛，其新陳代謝能力與碳、氮源的種類關(guān)聯(lián)很大，因此，選擇合適的碳、氮源能有效提高其活菌數(shù)[31]。本研究從赤紅球菌的生理生化特性出發(fā)，通過單因素實(shí)驗(yàn)篩選得到了更利于赤紅球菌HDRR2Y生長的碳源(乙酸鈉)及氮源(酵母膏+蛋白胨+氯化銨)。乙酸鈉是常用的碳源，屬于小分子有機(jī)物，易于被微生物利用，且便宜易得[32]。因此使用乙酸鈉作為碳源可以縮短赤紅球菌生長的時(shí)間。酵母膏、蛋白胨是常用的有機(jī)氮源，酵母膏同時(shí)含有有機(jī)氮化合物和碳水化合物，為微生物提供碳、氮源以及生長因子等[33]；蛋白胨是將明膠、肉、酪素等水解濃縮、干燥后制作而成的粉末，富含各類氨基酸及多肽等營養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進(jìn)細(xì)胞生長[34]；氯化銨是常用的無機(jī)氮源，為大宗商品，價(jià)格低廉，適合工業(yè)化生產(chǎn)[35]。研究表明，有機(jī)氮源與無機(jī)氮源同時(shí)使用比單獨(dú)使用更有利于微生物的生長[36]。本研究以酵母膏+蛋白胨+氯化銨組合為氮源的活菌數(shù)顯著高于單種氮源組的活菌數(shù)，兩者結(jié)論相符。由最陡爬坡實(shí)驗(yàn)可知，溫度也是影響微生物活菌數(shù)的顯著因素，溫度會(huì)影響代謝反應(yīng)的結(jié)果，同時(shí)會(huì)影響微生物的生理活動(dòng)[37]。田雅潔等[21]研究顯示玫瑰紅紅球菌XH2在30 ℃時(shí)活菌數(shù)達(dá)到最高，同時(shí)對(duì)水體氨氮降解率達(dá)到100%；本研究中最適溫度為29.24 ℃，與田雅潔等[21]的研究結(jié)果基本一致。

本研究對(duì)赤紅球菌HDRR2Y培養(yǎng)基碳、氮源和培養(yǎng)溫度進(jìn)行了響應(yīng)面分析，最終得到菌株最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)參數(shù)。經(jīng)優(yōu)化后，赤紅球菌HDRR2Y發(fā)酵36 h的活菌數(shù)達(dá)到1.54×109cfu/mL，比優(yōu)化前活菌數(shù)提高了近10倍，為硝化菌菌劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供相關(guān)數(shù)據(jù)參考。