黃 中，梁依依

百躍羊乳（南寧）有限公司，廣西南寧530105

0 引言

肌醇，別名肌糖、環(huán)己六醇、纖維醇，化學(xué)式（CHOH）6，廣泛分布在動(dòng)植物體內(nèi)，是動(dòng)植物和微生物的生長(zhǎng)因子[1]；可由玉米浸泡液中提取，具有類似維生素B1和生物素的作用，可使脂肪很快轉(zhuǎn)化為熱能而被消耗，有效預(yù)防在人體內(nèi)特別是心血管內(nèi)的沉積[2]?！禛B 14880—1994 食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》實(shí)施后，肌醇常作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，加入保健食品、嬰幼兒配方乳粉和兒童調(diào)制乳粉中。《GB 14880—2012 食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中調(diào)制乳粉肌醇添加要求為210~250 mg/kg，《GB 10765—2021 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰兒配方食品》《GB 10766—2021 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)較大嬰兒配方食品》《GB 10767—2021 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)幼兒配方食品》中肌醇限量為1.0~9.6 mg/100 kJ。目前，檢測(cè)食品中肌醇含量的國(guó)標(biāo)法有氣相色譜法、微生物法、化學(xué)法。除國(guó)標(biāo)法外，部分學(xué)者還開(kāi)發(fā)了液相色譜法[3]、氣質(zhì)聯(lián)用法[4]、液質(zhì)聯(lián)用法[5，6]、離子色譜法[7]、毛細(xì)管電泳法[8]。其中氣相色譜法是利用硅烷化試劑與肌醇衍生反應(yīng)，使肌醇的6 個(gè)羥基均被硅烷化試劑衍生成六（三甲硅氧基）環(huán)己烷，其具有揮發(fā)性，以利于用氣相色譜進(jìn)行定量分析[9]。而國(guó)標(biāo)法-氣相色譜法測(cè)定食品中肌醇含量的方法存在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、離心等操作步驟繁瑣，結(jié)果穩(wěn)定性不高，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)的不足。試驗(yàn)擬在《GB 5009.270—2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中肌醇的測(cè)定》第二法氣相色譜法的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)優(yōu)化前處理步驟和儀器色譜條件，縮減前處理時(shí)間和色譜分析時(shí)間，使檢測(cè)方法更方便、更快速、更精準(zhǔn)、更節(jié)約。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

肌醇標(biāo)準(zhǔn)品，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；正己烷，色譜純，西隴科技股份有限公司，無(wú)水乙醇，色譜純，西隴科技股份有限公司；三甲基氯硅烷、六甲基二硅胺烷，分析純，上海麥克林生化科技有限公司；N，N-二甲基甲酰胺，分析純，西隴科技股份有限公司；0.22 μm微孔濾膜；25 mL帶金屬螺紋蓋的頂空瓶，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.1.2 儀器

超聲波清洗機(jī)：KQ700DE，昆山舒美超聲儀器有限公司；離心機(jī)：TG16-WS，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9240A，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋：常州國(guó)華電器有限公司；氣相色譜儀：7890A，安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 樣品前處理

1.2.1 溶解

稱取1 g樣品于25 mL容量瓶中，加入7.5 mL 40 ℃溫水溶解，超聲20 min。

1.2.2 沉淀

將溶解好后的樣液，用無(wú)水乙醇定容，靜置20 min，轉(zhuǎn)移至50 mL的離心管，以不低于4 000 r/min離心5 min。

1.2.3 衍生與提取

吸取上清夜2.5 mL于頂空瓶中，放至于鼓風(fēng)干燥箱中（103±2）℃烘干2 h。待冷卻后，加入10 mL按8:2:1混合后的N-N二甲基甲酰胺、六甲基二硅胺烷、三甲基氯硅烷，擰緊蓋子超聲5 min后置于（80±5）℃水浴鍋中水浴75 min。每隔20 min取出上下震搖，衍生后加入5 mL正己烷，反復(fù)振蕩提取3 min，靜置分層。在帶有0.22 μm微孔濾膜的注射器中加入少量無(wú)水硫酸鈉，吸取上層清液加入注射器中。棄除1~2 mL濾液后獲取待測(cè)液。

1.3 肌醇標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定液的制備

稱?。?05±1）℃烘干2 h的肌醇標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，加水溶解定容至100 mL。吸取10 mL 1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液移至100 mL的容量瓶中，加入20 mL的水，混勻后加無(wú)水乙醇定容。分別吸取0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL的0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液至頂空瓶中，放至于鼓風(fēng)干燥箱中（103±2）℃烘2 h，其余步驟同1.2.3。

1.4 儀器條件

色譜柱：安捷倫HP-5（填料（5%-苯基）-甲基聚硅氧烷，柱長(zhǎng)30 m，內(nèi)徑0.32 mm，膜厚0.25μm）；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；檢測(cè)器溫度：300 ℃；色譜柱流量：3 mL/min；

分流比：10:1；進(jìn)樣量：1 μL；程序升溫條件：初始120 ℃，以10 ℃/min升至190 ℃，保持8 min；再以40 ℃/min升至240 ℃，保持5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

對(duì)比國(guó)標(biāo)法的制備，本方法將中間液的濃度提高了10 倍，以減少加入頂空瓶中標(biāo)準(zhǔn)工作液的量，加快干燥的時(shí)間。將肌醇含量0.02 mg、0.04 mg、0.08 mg、0.10 mg、0.12 mg作為橫坐標(biāo)，檢測(cè)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制出肌醇含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得線性關(guān)系y=511.81x+0.2074，其相關(guān)系數(shù)0.9996，表明在0.02~0.12 mg范圍內(nèi)具有良好的線性，滿足對(duì)肌醇的定量分析檢測(cè)（圖1）。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 前處理優(yōu)化對(duì)肌醇測(cè)定的影響

對(duì)比國(guó)標(biāo)法的前處理，直接干燥代替旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，樣品定容體積和吸取上清液的體積減少1/2。在控制干燥時(shí)間的同時(shí)，也為了在大批量的試驗(yàn)中控制乙醇在鼓風(fēng)干燥箱的揮發(fā)量，確保試驗(yàn)的安全性。帶有無(wú)水硫酸鈉的注射器過(guò)濾除水方式代替帶有無(wú)水硫酸鈉的離心管，減去離心管離心除水的步驟，對(duì)用優(yōu)化后的前處理與國(guó)標(biāo)前處理分別進(jìn)行分析，分別對(duì)3 個(gè)樣品用國(guó)標(biāo)法與本方法進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果如表1所示，相對(duì)偏差分別為4.5%、1.5%、1.2%。前處理改變后減少了試劑用量，提高了檢測(cè)效率，同時(shí)保證了結(jié)果與國(guó)標(biāo)法的一致性。

表1 國(guó)標(biāo)法與本方法的肌醇測(cè)定對(duì)比結(jié)果

2.3 色譜條件對(duì)肌醇測(cè)定的影響

國(guó)標(biāo)法程序升溫單次運(yùn)行63 min，本試驗(yàn)使用HP-5的氣相色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)，優(yōu)化了升溫程序，該法具有良好的重線性及分離度。如圖2所示，單次進(jìn)樣僅21.25 min，減少了樣品檢測(cè)的分析時(shí)間。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)液與樣品液色譜圖

2.4 兩種不同的處理方式對(duì)肌醇測(cè)定的影響

為了探討樣品在不去除蛋白質(zhì)的情況下直接進(jìn)行干燥衍生對(duì)肌醇測(cè)定的影響。稱取1 g樣品按1.2-1.4的方法處理進(jìn)行3 個(gè)平行測(cè)試，另稱取0.2 g于頂空瓶中，放置于鼓風(fēng)干燥箱中（103±2）℃烘2 h，衍生提取測(cè)定同1.2-1.4步驟。結(jié)果如表2所示，未經(jīng)沉淀蛋白處理的結(jié)果平均值與沉淀處理的相對(duì)偏差為2.34，但未經(jīng)沉淀處理的結(jié)果穩(wěn)定性不高，RSD值為8.05%。該處理方式對(duì)樣品的均勻性、稱樣準(zhǔn)確度、人員操作有比較大的要求。

表2 試驗(yàn)經(jīng)沉淀蛋白處理與未經(jīng)沉淀蛋白的結(jié)果對(duì)比

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 精密度測(cè)試

分別對(duì)2 個(gè)不同含量的樣品按1.2-1.4方法處理的6 個(gè)平行樣進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果如表3顯示，2 個(gè)不同樣品進(jìn)行6 平行測(cè)試后，變異系數(shù)分別為2.47、0.43，均小于3.8。符合實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)的要求。

表3 樣品精密度測(cè)試的分析結(jié)果

2.5.2 加標(biāo)回收率的測(cè)試

對(duì)已知的樣品稱取1 g，分別加入0.2 mL、0.5 mL、1 mL濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，按1.2-1.4方法處理，每個(gè)梯度進(jìn)行3 個(gè)水平測(cè)試。結(jié)果如表4所示，加標(biāo)回收率分別為100.3%、97.8%、95.1%，均在95%~105%范圍內(nèi)。符合實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)的要求。9 個(gè)樣品的加標(biāo)回收率相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.55%，說(shuō)明本方法具有良好的準(zhǔn)確性和可靠性。

表4 加標(biāo)回收率的分析結(jié)果

3 結(jié)論

與國(guó)標(biāo)對(duì)比，對(duì)樣品的溶解、標(biāo)品配制、干燥衍生、色譜條件進(jìn)行了改變，試樣液經(jīng)過(guò)氣相色譜分析。結(jié)果顯示，0~ 0.12 mg含量范圍，相關(guān)線性R=0.9996，線性良好。樣品的三梯度加標(biāo)回收率分別為100.3%、97.8%、95.1%，RSD為2.55%。色譜條件優(yōu)化后進(jìn)樣測(cè)試時(shí)間由63 min縮短至21.5 min。前處理方法縮減了旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、離心脫水的步驟，很大程度上縮短檢驗(yàn)時(shí)間、減少乙醇試劑用量、降低檢驗(yàn)成本及前處理過(guò)程對(duì)檢驗(yàn)員的危害。有利于大批量的試樣處理，同時(shí)保證檢驗(yàn)的精密度、準(zhǔn)確度不受影響。