胡鐵漢,李 程,司原成,陳 波,張 婷,賴 清
(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院,貴州 貴陽 550025;2.貴州省第二人民醫(yī)院中醫(yī)科,貴州 貴陽 550004)
毫針針刺(filiform needling)對腧穴的刺激作用在本質(zhì)上是機(jī)械力刺激[1]。實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)研究證實(shí),毫針針刺作用除了存在神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制外,還存在非神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制[1,2]。由于對腧穴非神經(jīng)組織細(xì)胞如何感受和傳遞針刺機(jī)械力學(xué)信號尚缺乏研究,因此,針刺非神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制還存在諸多未知環(huán)節(jié)。為此課題組前期通過離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn),屏蔽掉神經(jīng)、體液各種環(huán)境因素,從始動環(huán)節(jié)觀察了各種力學(xué)刺激對腧穴筋膜組織成纖維細(xì)胞的影響和力學(xué)信號傳導(dǎo)通路(整合素-細(xì)胞骨架-細(xì)胞效應(yīng))的變化情況[3-5]。但是,活體生物的在體實(shí)際環(huán)境要復(fù)雜得多,因此,本實(shí)驗(yàn)以大鼠腧穴筋膜組織為研究對象,以毫針對腧穴進(jìn)行刺激,在體觀察腧穴筋膜組織CSK 在針刺力學(xué)信號傳導(dǎo)中的變化情況,并以ATP 和PCNA 為效應(yīng)指標(biāo)觀察腧穴筋膜組織能量代謝和細(xì)胞活力的改變情況,觀察細(xì)胞骨架在活體生物腧穴內(nèi)傳導(dǎo)力學(xué)信號時(shí)的變化,旨在為毫針針刺作用機(jī)理提供新的實(shí)驗(yàn)證據(jù),現(xiàn)報(bào)道如下。
1.1 實(shí)驗(yàn)動物 16 只雄性SPF 級SD 大鼠,8 周齡,體重(190±10)g。購自湖南長沙天勤生物技術(shù)有限公司,動物許可證編號:SCXK(湘)2014-0011。實(shí)驗(yàn)方案通過貴州中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會審核。
1.2 主要試劑和藥品 抗actin、vimentin、tubulin、PCNA 抗 體(Abcam;型 號:Ab52614、Ab92547、Ab108342、Ab92522)、EnVision 抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒(Dako,型號:K5007)、水合氯醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;批號:22011026)等。
1.3 主要器材 毫針(蘇州針灸用品有限公司;型號:13052)、電子天平(上海奧豪斯;型號:00000027)、半自動脫水機(jī)(Leica;型號:TP1020)、全自動石蠟包埋機(jī)(Leica;型號:EG1150)、全自動石蠟切片機(jī)(Leica;型號:RM2235)、顯微鏡(Olympus 型號:1*71)、數(shù)碼照相機(jī)(Nikon;型號:DS-Fil)、全自動酶標(biāo)儀(美國寶特公司,型號:ELX808IU-P)。
1.4 方法
1.4.1 動物分組處理 采用隨機(jī)數(shù)字表法將16 只SD大鼠分為空白對照組、毫針針刺組,每組8 只。兩組飼養(yǎng)條件一致,適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后開始實(shí)驗(yàn)。抓取空白對照組各只,用4%的水合氯醛按照4 ml/kg 進(jìn)行麻醉,首次麻醉成功后用脫毛劑以中脘穴為中心3 cm 范圍內(nèi)進(jìn)行脫毛,然后放回盒中飼養(yǎng)。麻醉1 次/d,共3 d。抓取毫針針刺組大鼠麻醉和脫毛成功后,將大鼠仰臥位固定于鼠臺上,然后用30 號1 寸毫針在中脘穴處向胸部平刺,進(jìn)針0.5 cm,以平補(bǔ)平瀉手法按照(60±3)r/min 均勻捻轉(zhuǎn)5 min,捻轉(zhuǎn)幅度在180°~360°,中間留針10 min,然后同樣的手法速率再捻轉(zhuǎn)5 min,留針10 min,共操作3 輪,然后出針,1 次/d,共3 d。
1.4.2 動物取材 第3 天末次操作后,各組大鼠分別繼續(xù)固定進(jìn)行取材。以大鼠中脘穴穴點(diǎn)為中心,用外科剪剪取0.5 cm×0.5 cm 組織塊,切取其中一部分組織塊,迅速放入盛有4%多聚甲醛瓶中固定備測微絲、中間絲、微管和PCNA。另一部分組織塊(約200 mg)立即放入凍存管內(nèi),放入液氮罐中保存,待檢ATP。取材完畢后將大鼠脫頸處死。
1.4.3 免疫組織化學(xué)法檢測細(xì)胞骨架微絲、中間絲、微管和PCNA 表達(dá) 組織塊脫水、透明、浸蠟、包埋和切片(4 μm)后經(jīng)二甲苯脫蠟,梯度酒精至水化,PBS 洗滌;再用pH6.0 的0.01 mol/L 檸檬酸鈉抗原修復(fù)液修復(fù),3%H2O2抑制內(nèi)源性過氧化物酶室溫孵育;加入抗actin、vimentin、tubulin、PCNA 抗體4 ℃孵育過夜;經(jīng)EnVision 抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒(二抗)37 ℃孵育、顯色、復(fù)染、封片后,在顯微鏡下觀察,應(yīng)用Image pro plus6.0 軟件在同等參數(shù)設(shè)置下分別測定微絲、中間絲、微管的積分光密度值(integrated option density,IOD)和陽性區(qū)域面積(area),通過計(jì)算(IOD/area)平均光密度(mean density,MD)反應(yīng)目標(biāo)物質(zhì)的單位面積濃度;PCNA 實(shí)驗(yàn)圖片用直接觀察法計(jì)數(shù)PCNA 陽性細(xì)胞核數(shù)量和圖片中總的細(xì)胞核數(shù)量,PCNA 的陽性百分率=PCNA 細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%,觀察各組的變化。
1.4.4 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測腧穴穴區(qū)組織塊中ATP 的含量 將備存的腧穴穴區(qū)組織塊進(jìn)行勻漿,3000 g×10 min,取上清,在嚴(yán)格按照ATP 的檢測試劑盒的說明及流程進(jìn)行操作,觀察各組腧穴穴區(qū)組織塊中的含量變化。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析,所有數(shù)據(jù)均以()表示,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01 表示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著。
2.1 毫針針刺對腧穴筋膜組織CSK 表達(dá)的影響 針刺組腧穴穴區(qū)局部組織CSK 微絲、微管的表達(dá)低于空白組,統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著(P<0.01);針刺組腧穴穴區(qū)局部組織CSK 中間絲的表達(dá)高于空白組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.203),見表1、圖1。
圖1 兩組微絲、中間絲和微管表達(dá)情況(免疫組化,×400)(續(xù))
表1 針刺對腧穴筋膜組織CSK 微絲、中間絲、微管表達(dá)的影響(,MD)
表1 針刺對腧穴筋膜組織CSK 微絲、中間絲、微管表達(dá)的影響(,MD)
注:與空白組比較,*P<0.01
圖1 兩組微絲、中間絲和微管表達(dá)情況(免疫組化,×400)
2.2 毫針針刺對腧穴穴區(qū)局部組織ATP 含量和PCNA 表達(dá)的影響 針刺組腧穴穴區(qū)局部組織ATP 含量及PCNA 陽性計(jì)數(shù)率均高于空白組,統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著(P<0.01),見表2、圖2。
表2 毫針針刺對腧穴筋膜組織ATP 含量和PCNA 表達(dá)的影響()
表2 毫針針刺對腧穴筋膜組織ATP 含量和PCNA 表達(dá)的影響()
注:與空白組比較,*P<0.01
圖2 兩組PCNA 表達(dá)情況(免疫組化,×400)
力學(xué)微環(huán)境是調(diào)節(jié)生命形態(tài)和功能的重要因素之一[6]?,F(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)研究證實(shí),細(xì)胞能夠感知力的大小和時(shí)域(time scales),并且把機(jī)械刺激轉(zhuǎn)化為化學(xué)響應(yīng),進(jìn)一步影響到細(xì)胞的DNA 轉(zhuǎn)錄、翻譯和表達(dá)[7-9]。目前,關(guān)于細(xì)胞如何將胞外力信號傳遞到胞內(nèi)并且引起細(xì)胞反應(yīng)應(yīng)答的力信號傳導(dǎo)通路目前認(rèn)為主要有3 種途徑:一是力敏感離子通道(stretch-sensitive ion channels),通過力敏感離子通道將力信號轉(zhuǎn)化成跨膜的電信號或胞內(nèi)的化學(xué)信號[10]。針刺作用的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制在闡釋針刺機(jī)械信號的導(dǎo)入和轉(zhuǎn)換時(shí)大多采用這一理論進(jìn)行描述[1,11];二是胞外基質(zhì)和粘連分子,這些胞外基質(zhì)和粘連分子將細(xì)胞和細(xì)胞,胞外和胞內(nèi)聯(lián)系起來,形成一個(gè)整體,并將力信號從胞外傳遞到胞內(nèi),引起細(xì)胞的下游反應(yīng)[12]。在針灸推拿作用的機(jī)制研究中,有研究證實(shí)體外模擬推拿之壓力刺激能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的Integrinβ1、α1、α2、α3、αv表達(dá)量增加,Integrinβ3表達(dá)下降[13];而毫針針刺對SD 大鼠腧穴穴區(qū)筋膜結(jié)締組織integrinβ1和integrinβ3的表達(dá)變化情況呈現(xiàn)不同趨向:中等強(qiáng)度毫針針刺時(shí)腧穴筋膜結(jié)締組織中integrinβ1的表達(dá)增強(qiáng),有顯著差異,然而高強(qiáng)度毫針針刺時(shí)integrinβ1的表達(dá)卻下降。integrinβ3除部分大小血管可見少量表達(dá)外,在腧穴筋膜結(jié)締組織中始終為陰性表達(dá)[14];三是細(xì)胞骨架的重新組建,當(dāng)細(xì)胞受到外界機(jī)械力刺激以后,細(xì)胞骨架在一些調(diào)節(jié)因子作用下解聚重組,并進(jìn)一步引起細(xì)胞反應(yīng)應(yīng)答。其中,針灸學(xué)領(lǐng)域以細(xì)胞骨架變化重組這一機(jī)械力信號傳導(dǎo)途徑的研究尚需深入。
細(xì)胞骨架[15,16]包括微絲、中間絲和微管3 種成分,是維持細(xì)胞形態(tài)功能的支柱性、剛性結(jié)構(gòu),同時(shí)也是許多蛋白激酶附著的位點(diǎn)。微絲由肌動蛋白組成,單個(gè)微絲直觀呈雙股、右手螺旋狀,實(shí)心,在細(xì)胞中成平行、二維、三維分布,處于高動態(tài)平衡狀態(tài),與細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動有密切關(guān)系;中間絲化學(xué)成分復(fù)雜且性質(zhì)較為穩(wěn)定,呈實(shí)心狀,其直徑在微絲和微管之間;微管主要由α、β 兩種微管蛋白組成,呈中空的管狀,它的直徑和微絲、中間絲比較是最大的,也處于高動態(tài)平衡狀,對細(xì)胞起著支撐的作用和參與胞內(nèi)物質(zhì)輸送的作用。細(xì)胞的形態(tài)需要依靠細(xì)胞骨架這些呈網(wǎng)狀的蛋白來維持,同時(shí)細(xì)胞骨架對細(xì)胞的很多重要生命活動如生長、分裂、物質(zhì)運(yùn)輸?shù)纫彩株P(guān)鍵。此外,細(xì)胞骨架[17]是細(xì)胞主要的力學(xué)信號傳導(dǎo)位點(diǎn),可以直接將作用于細(xì)胞表面的應(yīng)力傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)各區(qū)。由此可以推測細(xì)胞骨架在針刺機(jī)械信號細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)過程中也可能發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)中,針刺組腧穴穴區(qū)局部組織CSK 中間絲的表達(dá)高于空白組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.203),而針刺組腧穴穴區(qū)局部組織CSK 微絲、微管的表達(dá)低于空白組,統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著(P<0.01),這說明中間絲的結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)固,不易受到外來因素的干擾,當(dāng)毫針針刺時(shí),中間絲沒有發(fā)生表達(dá)量的變化。微絲、微管由于本身是處于高動態(tài)平衡狀的細(xì)胞結(jié)構(gòu),在毫針針刺這一過程中,針刺機(jī)械力能使微絲、微管原有的動態(tài)平衡遭到打破,部分微絲解聚重構(gòu)趨勢明顯,以適應(yīng)來自針刺的機(jī)械外力刺激和傳導(dǎo)調(diào)整的信號。因此,細(xì)胞骨架中微絲、微管可能是細(xì)胞內(nèi)傳遞針刺機(jī)械刺激的主要力學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
越來越多的證據(jù)顯示[18],線粒體以細(xì)胞骨架蛋白為軌道而得以運(yùn)動,細(xì)胞骨架通過各種非特異性的途徑調(diào)節(jié)線粒體的形態(tài)和功能;而線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和合成ATP 的主要場所,為細(xì)胞的活動提供能量,是細(xì)胞生命活動的控制中心。本實(shí)驗(yàn)中,針刺組腧穴穴區(qū)局部組織ATP 含量高于空白組,統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著(P<0.01),說明針刺可以提高腧穴能量代謝水平,可能激發(fā)針刺效應(yīng)啟動。
另外,細(xì)胞骨架跨核膜聯(lián)系細(xì)胞核,可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)。其中,PCNA 與細(xì)胞DNA 合成關(guān)系密切,在細(xì)胞增殖的啟動上起重要作用,是反映細(xì)胞活力的特征性指標(biāo)[19]。本次研究,針刺組腧穴穴區(qū)局部PCNA 陽性計(jì)數(shù)率均高于空白組,統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著(P<0.01),說明針刺可能可以調(diào)節(jié)腧穴穴區(qū)細(xì)胞核基因和蛋白表達(dá)水平,提高腧穴活力。
綜上所述,毫針針刺時(shí)腧穴筋膜組織成纖維細(xì)胞的細(xì)胞骨架中微絲和微管是主要的細(xì)胞內(nèi)力學(xué)信息傳導(dǎo)通路;通過細(xì)胞骨架通路,腧穴組織能量代謝增強(qiáng)、腧穴細(xì)胞活力增加,這可能是毫針刺激腧穴,激發(fā)針刺治療作用啟動的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)機(jī)理之一。雖然本次研究可能進(jìn)一步揭示針刺作用原理提供了新的思路,但這也還需要更深入地研究進(jìn)一步驗(yàn)證。