童心

摘 要：環(huán)磷酸腺苷（cAMP）和環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）是體內(nèi)重要的生理活性物質(zhì)，作為“第二信使”的cAMP和cGMP參與血糖調(diào)節(jié)、肝功能等多種生理生化過程的調(diào)節(jié)，具有廣闊的開發(fā)前景及利用價(jià)值。本文對(duì)cAMP和cGMP國內(nèi)外研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，并介紹了cAMP和cGMP提取工藝及檢測(cè)工藝，為進(jìn)一步研究作參考。

關(guān)鍵詞：紅棗;環(huán)磷酸腺苷;環(huán)磷酸鳥苷;提取

Abstract： Cyclic AMP and cyclic GMP are important physiologically active substances in the body， as the "second messenger"， cAMP and cGMP participate in the regulation of blood glucose and liver function， and have broad prospects for development and utilization. In this paper， the research status of cAMP and cGMP at home and abroad was reviewed， and the extraction and determination of cAMP and cGMP were introduced as a reference for further research.

Keywords： jujube; Cyclic AMP; Cyclic GMP; extraction

大棗為鼠李科植物棗的成熟果實(shí)，性溫味甘，原產(chǎn)于我國，具有悠久的栽培歷史。棗中含有豐富的氨基酸、酚類、蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物及環(huán)核苷酸類物質(zhì)。同時(shí)紅棗具有許多中藥成分，是天然的無副作用的良藥，久食具有補(bǔ)氣、益脾胃的功效，是藥用的佳品[1-2]。新疆紅棗栽培面積近50萬hm2，產(chǎn)量達(dá)300萬t[3]，棗產(chǎn)業(yè)已成為新疆經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要支柱產(chǎn)業(yè)之一。

研究表明，cAMP和cGMP是核苷酸的衍生物，是機(jī)體中廣泛存在的一種重要的生物活性物質(zhì)[4]。環(huán)磷酸腺苷（cAMP）在紅棗中的含量為100～600 nmol/g，是一般植物中含量的數(shù)倍，是天然植物中最高的，具有重要的開發(fā)價(jià)值[5]。世界各國的人員對(duì)cAMP和cGMP進(jìn)行了大量的研究，研究顯示cAMP和cGMP在基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成等很多領(lǐng)域起著重要的作用，至少40多種疾病與環(huán)核苷酸密不可分[6]。

本文基于cAMP和cGMP各方面的研究成果，從研究現(xiàn)狀、提取工藝及檢測(cè)方法等方面的內(nèi)容進(jìn)行綜述，為進(jìn)一步開發(fā)和利用提供參考。

1 cAMP和cGMP國內(nèi)外研究現(xiàn)狀

1957年Sutherland在哺乳動(dòng)物的肝臟組織細(xì)胞里發(fā)現(xiàn)了cAMP，1960年哺乳動(dòng)物體內(nèi)cGMP被發(fā)現(xiàn)[7]。隨后人們?cè)谖⑸锖椭参镏邢群髾z測(cè)出了cAMP和cGMP，發(fā)現(xiàn)cAMP和cGMP是生物界中普遍存在的活性物質(zhì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紅棗中的cAMP含量高于其他已測(cè)動(dòng)植物中cAMP的含量[8]。

20世紀(jì)90年代初，劉孟軍等人[9]對(duì)10多種棗和酸棗中cAMP的含量進(jìn)行測(cè)定，研究結(jié)果表明，山西木棗中cAMP的含量最高。在此之后，程偉等人[10]利用超聲復(fù)合膜技術(shù)提取紅棗中的cAMP，加快了提取速度，優(yōu)化了提取工藝。

通過查閱文獻(xiàn)，天然產(chǎn)物中提取cAMP和cGMP還停留在實(shí)驗(yàn)室階段，提取工藝及提取條件都無法達(dá)到大規(guī)模生產(chǎn)的階段，截至目前為止，還沒有從紅棗中提取cAMP和cGMP的工業(yè)化產(chǎn)品。

2 cAMP和cGMP提取工藝

紅棗中含有豐富的cAMP和cGMP，近年來，很多學(xué)者研究了cAMP和cGMP提取及檢測(cè)方法。天然產(chǎn)物最初的提取方法有水浴提取法、浸漬法等，后期由于科技的進(jìn)步及各種新型設(shè)備的出現(xiàn)，逐漸涌現(xiàn)出膜分離技術(shù)、溶劑提取法、超臨界流體萃取技術(shù)及高速逆流色譜分離技術(shù)等新型提取技術(shù)。

2.1 溶劑提取法

根據(jù)提取物各種成分在溶劑中的溶解性，將有效成分從提取物內(nèi)溶解出來的方法叫溶劑提取法。溶劑提取法主要有醇提及水提2種提取方法。不同的提取方法對(duì)樣品有不一樣的提取要求。利用水提法提取的樣品需溶于水且在水中有良好的穩(wěn)定性，不易變質(zhì)，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。水提法中溫度是提取效率的主要影響因素，經(jīng)過研究表明，熱水的提取效果及提取效率優(yōu)于室溫及冷水的提取效果[10]。根據(jù)cAMP和cGMP溶于水的特性，史紅梅[11]通過正交試驗(yàn)確定提取方法為熱水浸提法，料液比1∶10，提取溫度100 ℃，利用熱水對(duì)cAMP進(jìn)行提取，提取后離心分離得到提取液。乙醇浸提法中影響提取效率的主要因素是乙醇的濃度，張明娟[12]在料液比1∶15、超聲時(shí)間15 min的條件下，利用15%乙醇進(jìn)行提取，提取率在46.01～375.61 μg/g。

2.2 物理輔助提取法

物理輔助提取法是指微波輔助萃取及超聲波輔助萃取的方法。微波輔助萃取是指在高頻微波能的作用下，通過微波輻射快速加熱物料，使細(xì)胞壁破裂，從而促進(jìn)有效成分的快速溶出，能使萃取時(shí)間顯著縮短。微波輔助提取的優(yōu)點(diǎn)是樣品無溫度梯度，具有加熱均勻的特點(diǎn)，有效保護(hù)了食品及藥品中的功能性成分，不易糊化、分離容易、且方便后期處理，大大提高了提取效率。崔志強(qiáng)等[13]利用微波輔助萃取法，通過正交試驗(yàn)確定了環(huán)磷酸腺苷最佳提取工藝，處理時(shí)間為3 min、料液比為1∶20、微波功率200 W、浸泡時(shí)間6 h時(shí)，cAMP的提取效果最好。

超聲波萃取是利用其產(chǎn)生的機(jī)械效能對(duì)細(xì)胞壁進(jìn)行破壞，增大物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)頻率和速度，加速溶劑的穿透能力，使目標(biāo)物質(zhì)快速擴(kuò)散從而達(dá)到提取目的。超聲波萃取相比傳統(tǒng)的提取技術(shù)具有縮短萃取時(shí)間、可低溫萃取、工藝簡單、操作方便和不使用萃取劑等優(yōu)點(diǎn)。采用微波或超聲一定程度上可以提高效率，節(jié)約時(shí)間。崔志強(qiáng)等[13]用超聲波萃取法得到最優(yōu)提取工藝條件，浸泡12 h、溫度60 ℃、料液比為1∶12條件下超聲20 min，cAMP的提取率為300.29 μg/g。

2.3 超臨界流體萃取技術(shù)

超臨界流體萃取技術(shù)是近些年出現(xiàn)在提取領(lǐng)域的新技術(shù)，其原理主要是將二氧化碳作為超臨界流體，利用壓力和溫度對(duì)超臨界流體溶解能力的影響而進(jìn)行的提取技術(shù)。此種提取方法具有很多優(yōu)點(diǎn)：①可以進(jìn)行室溫提取，將高沸點(diǎn)、揮發(fā)度低、加熱易分解的物質(zhì)萃取出來;②萃取過程不使用提取劑，無殘留，提取物100%純天然;③萃取效率高、消耗少、節(jié)約成本。但是超臨界流體萃取技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求較高，無法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。孟伊娜等[14]通過超臨界萃取技術(shù)對(duì)干燥中的cAMP進(jìn)行提取，提取率由85%提升至95%以上。在天然產(chǎn)物提取過程中，也常常將微波輔助萃取及超聲波輔助萃取、超臨界流體萃取技術(shù)聯(lián)合使用，以提升紅棗中cAMP和cGMP的提取率。

2.4 酶提取法

酶提取法是指通過酶對(duì)細(xì)胞壁的組成成分進(jìn)行破壞，使有效成分被釋放出來的提取方法。許牡丹等[15]使用酶提取法和超聲輔助提取法相結(jié)合的方法，在超聲波的作用下選取纖維素酶對(duì)cAMP進(jìn)行提取，在最優(yōu)工藝下結(jié)果表明，酶提取法和超聲輔助提取法相結(jié)合的方法提取量為154.3 μg/g，高于單一的水浴法、單一酶法。

2.5 閃式提取法

閃式提取技術(shù)通過高速機(jī)械剪切力和溶劑的共同作用，將植物組織破碎成細(xì)小顆粒，使有效成分滲出，從而達(dá)到提取的目的。王維有等[16]利用閃式提取技術(shù)，提取時(shí)間為40 s，以60%乙醇作為提取溶劑，cAMP提取量為150 μg/g。

3 cAMP和cGMP檢測(cè)方法

現(xiàn)階段檢測(cè)cAMP和cGMP的方法有以下幾種，如蛋白結(jié)合法、高效液相色譜法、薄層色譜法等。最常見的檢測(cè)方法為高效液相色譜檢測(cè)法。

3.1 蛋白質(zhì)結(jié)合法

蛋白質(zhì)結(jié)合法指將一定濃度的磷酸鹽緩沖液與待測(cè)樣或標(biāo)準(zhǔn)液結(jié)合的牛血清白蛋白混合均勻，充分反應(yīng)后在微孔濾膜上進(jìn)行過濾，抽濾完成后利用活性炭吸附技術(shù)，計(jì)數(shù)并得到最終結(jié)果的檢測(cè)方法[17]，此種檢測(cè)方法操作較為復(fù)雜。劉孟軍等[9]使用蛋白結(jié)合法對(duì)植物中的cAMP進(jìn)行研究，對(duì)不同園藝植物、品種和類型的含量進(jìn)行了測(cè)定。蛋白質(zhì)結(jié)合法在實(shí)驗(yàn)中靈敏度高、樣品試用量少是其優(yōu)點(diǎn)，但因其對(duì)試劑要求高且價(jià)格昂貴，而很少被采用。

3.2 薄層色譜法

薄層色譜法是以合適的溶劑作為流動(dòng)相，利用不同成分對(duì)吸附劑的吸附能力的不同，對(duì)混合樣品進(jìn)行分離、鑒定和定量的一種層析分離技術(shù)。薄層色譜法需要被檢測(cè)物的濃度達(dá)到一定劑量才可以使用此檢測(cè)方法，檢測(cè)紅棗中cAMP需要含量達(dá)到30%以上才可以做檢測(cè)。通過極性與非極性溶劑的分離，在紫外分光光度計(jì)下進(jìn)行檢測(cè)。李明等[18]采用TLC以及紫外光譜法對(duì)大棗中cAMP的提取進(jìn)行了研究。

3.3 酶聯(lián)免疫法

酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法，簡稱酶聯(lián)免疫法，或者ELISA法，其原理是讓抗體與酶復(fù)合物結(jié)合，然后通過顯色來進(jìn)行分析檢測(cè)。酶聯(lián)免疫法最大優(yōu)點(diǎn)是保證細(xì)胞完整性的情況下，對(duì)細(xì)胞中cAMP和cGMP含量進(jìn)行檢測(cè)。其主要原理是在不同cAMP和cGMP的濃度下，熒光強(qiáng)度存在差異[19]。

3.4 高效液相色譜法

高效液相色譜法是指以液體為流動(dòng)相，將不同極性的緩沖液、單一溶劑等通過高壓輸送系統(tǒng)泵入色譜柱內(nèi)，經(jīng)色譜柱分離后送入檢測(cè)器中進(jìn)行分析檢測(cè)。高效液相色譜法由于分離效能高、檢測(cè)速度快、靈敏度高、分析速度快、樣品不被破壞及可重復(fù)使用等特點(diǎn)，是cAMP和cGMP最常使用的檢測(cè)方法。蒲云峰等[20]通過高效液相色譜法建立了cAMP的測(cè)定方法：選用C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），以18%甲醇和82% 0.02 mol/L磷酸二氫鉀為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長260 nm，灰棗中cAMP含量高。通過此種方法建立的定量分析，準(zhǔn)確性與重復(fù)性好。另外，還有通過液質(zhì)連用設(shè)備來檢測(cè)cAMP和cGMP，不僅可以進(jìn)行定性定量檢測(cè)，也可以進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。

4 結(jié)語

近年來，學(xué)者對(duì)紅棗中cAMP和cGMP進(jìn)行了大量研究，劉聰?shù)萚21]對(duì)不同紅棗部分的cAMP進(jìn)行了分析測(cè)定，cAMP含量在棗皮及棗肉中的含量最高，不同品種的紅棗cAMP含量差異性顯著，其中和田玉棗棗皮和棗肉中cAMP的含量高于其他2個(gè)品種。不同學(xué)者對(duì)cAMP和cGMP的提取工藝進(jìn)行不斷優(yōu)化，陳愷等[22]采用水浴提取法，結(jié)合高效液相色譜法對(duì)cAMP的提取量進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定最佳工藝為：料液比1∶10，提取時(shí)間4 h、提取溫度95 ℃。單獨(dú)研究cAMP的文獻(xiàn)有很多，而研究cGMP的內(nèi)容相對(duì)較少，而對(duì)于紅棗中cAMP和cGMP的測(cè)定，不同的提取條件及提取方法都會(huì)影響cAMP和cGMP的提取率。

紅棗中含有豐富的cAMP和cGMP，而紅棗中提取出來的cAMP和cGMP，天然無副作用，具有廣闊的開發(fā)前景。研究出價(jià)格低廉、高效便捷的檢測(cè)cAMP和cGMP的方法，具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，對(duì)推動(dòng)紅棗產(chǎn)業(yè)具有重要意義。

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