楊育華 于飛 梁善雄 杜梅珍 黃天壬

摘要：目的： 利用生物信息學(xué)分析TCGA數(shù)據(jù)庫中肝癌組織與癌旁組織中表達(dá)具有差異性的自噬基因并建立肝癌預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型。? 方法? 從癌癥基因圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫獲取肝癌患者臨床信息與mRNA表達(dá)信息，利用R語言DEseq2、Limma、EdegR軟件包分析374例肝癌組織及50例癌旁組織中自噬相關(guān)差異表達(dá)基因（ARGs），對(duì)三個(gè)軟件包獲取的結(jié)果取交集作為差異基因結(jié)果;隨后對(duì)ARGs進(jìn)行基因本體論（GO），京都基因與基因組百科全書（KEGG）功能富集分析。采用單因素與多因素COX回歸分析建立肝癌預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型。結(jié)果：差異分析分別獲取32，35，32個(gè)自噬相關(guān)基因，對(duì)結(jié)果取交集后得到19個(gè)自噬相關(guān)差異表達(dá)基因，其中包括11個(gè)上調(diào)基因和8個(gè)下調(diào)基因; 基因富集化結(jié)果顯示19個(gè)ARGs主要參與了ErbB信號(hào)通路、自噬、細(xì)胞凋亡、Hippo信號(hào)通路等;經(jīng)單因素與多因素COX回歸分析后確定了BIRC5與CLN3基因表達(dá)量與肝癌患者預(yù)后生存時(shí)間相關(guān)，由此建立以自噬基因?yàn)榛A(chǔ)的多因素風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型;對(duì)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型的驗(yàn)證表明該模型的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（HR=1.27，95%CI=1.15～1.41，p=0.001），該模型高風(fēng)險(xiǎn)組患者生存時(shí)間顯著低于低風(fēng)險(xiǎn)組患者（p<0.001），提示該模型在肝癌患者預(yù)后生存時(shí)間預(yù)測上具有較高的準(zhǔn)確性。 結(jié)論? 本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的自噬基因相關(guān)的肝癌預(yù)后評(píng)估模型可獨(dú)立預(yù)測肝癌患者預(yù)后，有助于臨床醫(yī)生選擇精準(zhǔn)化的肝癌預(yù)防和治療策略。

關(guān)鍵詞： 肝癌;自噬 ;預(yù)后模型;自噬基因

【中圖分類號(hào)】R322.4+7 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1673-9026（2022）04--03

Objective To analyze the differentially expressed autophagy genes in hepatocellular carcinoma tissues and adjacent tissues in TCGA database and establish a prognostic risk prediction model for hepatocellular carcinoma. Methods Clinical information and mRNA expression information of HCC patients were obtained from cancer Gene Mapping （TCGA） database. Autophagy-related differentially expressed genes （ARGs） in 374 HCC tissues and 50 paracancer tissues were analyzed using R language DEseq2， Limma and EdegR software packages. The intersection of the results obtained by the three software packages was taken as differential gene results. ARGs were then analyzed by gene Ontology （GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） for functional enrichment. Univariate and multivariate COX regression analysis were used to establish the prognostic risk prediction model of liver cancer. Results： 32，35，32 genes related to autophagy were obtained by differential analysis， and 19 differentially expressed genes related to autophagy were obtained by intersection of the results， including 11 up-regulated genes and 8 down-regulated genes. The results of gene enrichment showed that 19 ARGs were mainly involved in ErbB signaling pathway， autophagy， apoptosis and Hippo signaling pathway. After univariate and multivariate COX regression analysis， it was determined that the expression levels of BIRC5 and CLN3 genes were correlated with the prognosis and survival time of HCC patients， and a multi-factor risk prediction model based on autophagy genes was established. Validation of the risk prediction model showed that the risk score of the model was an independent risk factor for the prognosis of HCC patients （HR=1.27， 95%CI= 1.15-1.41， P =0.001）， and the survival time of patients in the high-risk group was significantly lower than that in the low-risk group （P &lt;0.001）. It suggests that the model has high accuracy in predicting the survival time of HCC patients. Conclusion It is suggested that the autophagy gene related hepatocellular carcinoma prognosis assessment model constructed in this study can independently predict the prognosis of HCC patients， which is helpful for clinicians to select accurate prevention and treatment strategies for HCC.

Key words：Liver cancer; Autophagy. Prognostic model; Autophagy genes

肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma ，HCC）是全球排名第三的癌癥死因，是世界范圍內(nèi)的主要健康問題，嚴(yán)重威脅人類的健康與安全。根據(jù)最新統(tǒng)計(jì)[1]，全球大約有四億人感染了乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus， HBV）;中國的肝癌患者大約占全球50%以上;據(jù)估計(jì)，每年在中國因肝癌死亡的病例達(dá)到42.21萬，新發(fā)病例46.61萬，在惡性腫瘤中的發(fā)病率與死亡率分別排在第四位和第三位[2]。目前在臨床上肝癌的治療主要依靠化療與手術(shù)切除，但由于腫瘤耐藥性，肝癌患者的預(yù)后生存率依然不樂觀;因此研究尋找更有效的臨床預(yù)測肝癌患者預(yù)后指標(biāo)變得十分關(guān)鍵，有助于解決肝癌這個(gè)全球公共衛(wèi)生難題。

細(xì)胞自噬是細(xì)胞自身為調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝與細(xì)胞器更新提供原料及能量的過程，自噬參與了細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞死亡以及免疫在內(nèi)的生理病理過程以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。自噬受到自噬相關(guān)基因（Autophagy-related genes，ARGs）以及多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)控。現(xiàn)有研究表明HBV能夠誘導(dǎo)自噬反應(yīng)，但自噬在肝癌中體現(xiàn)出促進(jìn)與抑制的雙重作用，一方面自噬具有保護(hù)肝細(xì)胞免受內(nèi)外環(huán)境的應(yīng)激，清除細(xì)胞內(nèi)不必要的蛋白質(zhì)等成分及微生物病原體的作用[3]。目前研究提示自噬相關(guān)基因與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但大多數(shù)集中在單一自噬基因上，對(duì)肝癌中總體的自噬基因表達(dá)水平及預(yù)測價(jià)值仍不明確，基于目前相關(guān)研究，本研究分析癌癥基因組圖譜 （the cancer genome atlas，TCGA）肝癌數(shù)據(jù)，獲取肝癌組織與癌旁組織中整體的自噬相關(guān)基因表達(dá)水平，并通過分析自噬基因差異表達(dá)與臨床特征的關(guān)系，探索自噬基因是否是肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提升自噬相關(guān)基因的預(yù)測價(jià)值，有助于臨床上更加精準(zhǔn)預(yù)測肝癌患者的生存時(shí)間。

1. 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)收集與整理分析

從TCGA 肝癌數(shù)據(jù)庫（https：//www.cancer.gov/about-nci/organization/research/structural-genomics/tcga， tcga-lihc）下載424例肝癌患者原始RNA測序信息與臨床信息，樣本包含374例肝癌組織與50例癌旁組織。從人類自噬數(shù)據(jù)庫（http：//www.autophagy.lu/clustering/index.html）獲取222個(gè)人類自噬相關(guān)基因，經(jīng)過與mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)比對(duì)，最終納入210個(gè)有效的人類自噬相關(guān)基因;然后將210個(gè)ARGs與mRNA表達(dá)信息匹配，采用R語言 DEseq2、Limma、edgeR軟件包分別對(duì)mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行基因表達(dá)差異分析，以腫瘤組織中基因表達(dá)量為正常組織1倍以上（log2FC ≥1）且 P<0.05定義差異表達(dá)基因，獲得差異表達(dá)ARGs后采用R語言軟件包pheatmap包繪制熱圖，ggplot包繪制火山圖。

1.2評(píng)估ARGs的相關(guān)生物過程和通路

為了更好的探索自噬相關(guān)差異基因在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用，我們對(duì)19個(gè)自噬相關(guān)差異基因的主要分子功能，細(xì)胞組分，生物學(xué)功能進(jìn)行了富集分析，通過R軟件包enrichplot進(jìn)行分析，并繪制富集分析條形圖、氣泡圖和弦圖對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.3自噬基因差異分析與影響患者預(yù)后生存的因素

通過分析篩選納入374例肝癌樣本臨床信息;為了探索基因表達(dá)水平對(duì)肝癌患者預(yù)后生存時(shí)間的影響，我們對(duì)在肝癌組織中表達(dá)具有差異性的ARGs進(jìn)行單因素與多因素Cox回歸分析，獲取到與肝癌患者預(yù)后顯著相關(guān)的ARGS后，根據(jù)回歸分析的結(jié)果建立肝癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型，對(duì)模型繪制森林圖，并根據(jù)模型計(jì)算樣本風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，按照平均值將風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分對(duì)應(yīng)的樣本分為高風(fēng)險(xiǎn)組與低風(fēng)險(xiǎn)組，進(jìn)一步采用COX回歸分析計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型與其他臨床信息特征對(duì)肝癌患者預(yù)后生存時(shí)間的影響，并通過Kaplan-Meier繪制高風(fēng)險(xiǎn)組與低風(fēng)險(xiǎn)組五年生存曲線，評(píng)估肝癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型對(duì)患者預(yù)后的預(yù)測效果，探索自噬基因?qū)Ω伟┗颊哳A(yù)后的關(guān)系。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

分析基于4.0.5版本R軟件，只有當(dāng)P ≤0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1數(shù)據(jù)獲取和基因差異分析

在TCGA數(shù)據(jù)庫獲取的374例樣本臨床信息如表1，本研究分析了210個(gè)ARGs在TCGA肝癌數(shù)據(jù)庫中的表達(dá)差異并獲取到19個(gè)差異具有顯著性的基因，其中DEseq2包分析得到32個(gè)差異表達(dá)基因，上調(diào)基因數(shù)為22個(gè)，下調(diào)基因數(shù)為8個(gè);Limma包分析得到25個(gè)差異表達(dá)基因，下調(diào)基因數(shù)為14個(gè)，上調(diào)基因數(shù)為11個(gè);edgeR包分析得到34個(gè)差異表達(dá)基因，下調(diào)基因數(shù)為 8個(gè)，上調(diào)基因個(gè)數(shù)為26個(gè)。三個(gè)R包分析均定義為log2FC ≥1 和矯正 P<0.05。對(duì)三個(gè)R包分析結(jié)果取交集得到19個(gè)差異表達(dá)基因，分別為BIRC5，CCL2，CDKN2A，CLN3，DAPK2，DIRAS3，DLC1，F(xiàn)OS，F(xiàn)OXO1，ITGA6，MYC，NAMPT，NRG1，NRG2，PEA15，RAB24，SPHK1，TMEM74，TP73;圖1顯示了差異ARGs交集和在TCGA數(shù)據(jù)集中的分布熱圖及火山圖

圖1 肝癌組織與癌旁組織自噬相關(guān)基因表達(dá)情況? ①-②分別為火山圖與熱圖，其中火山圖中紅色點(diǎn)表示上調(diào)基因，藍(lán)色點(diǎn)表示下調(diào)基因。

2.2差異表達(dá)ARGs基因富集分析

利用KEGG和GO富集分析對(duì)ARGs的分子功能、生物學(xué)過程、細(xì)胞組分進(jìn)行深入分析，如圖3所示，分析發(fā)現(xiàn)KEGG富集的通路主要包括自噬、ErbB信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡和 p53 信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路。GO 富集的結(jié)果包括MAPK活性激活，ERBB2信號(hào)通路，自噬調(diào)節(jié)，轉(zhuǎn)錄激活等。

圖2? 差異表達(dá)自噬基因的KEGG、GO通路富集功能顯示ARGs主要參與自噬、ErbB信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡和 p53 信號(hào)通路

2.3 ARGs表達(dá)與肝癌患者預(yù)后生存分析

通過對(duì)差異表達(dá)的19個(gè)ARGs進(jìn)行單因素COX生存分析發(fā)現(xiàn)BIRC5、CDKN2A、TP73、CLN3四個(gè)自噬基因與肝癌患者生存時(shí)間關(guān)系密切，（p<0.05，HR>1 為高?；?，HR<1 為低危基因）;進(jìn)一步對(duì)差異基因進(jìn)行多因素COX生存分析發(fā)現(xiàn)BIRC5、CLN3對(duì)肝癌患者生存時(shí)間顯著相關(guān)，見表2;為獨(dú)立預(yù)測肝癌患者預(yù)后，根據(jù)COX回歸分析結(jié)果構(gòu)建基于加權(quán)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的肝癌預(yù)后模型，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分計(jì)算公式：0.198*BIRC5表達(dá)量+ 0.0902*CLN3表達(dá)量;繪制K_M生存曲線圖顯示高風(fēng)險(xiǎn)組與低風(fēng)險(xiǎn)組的生存時(shí)間差異，以此檢驗(yàn)該風(fēng)險(xiǎn)模型的預(yù)測能力;如表3所示，與其他臨床信息相比，該風(fēng)險(xiǎn)模型是肝癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（p<0.05）;圖4顯示該模型高風(fēng)險(xiǎn)組的生存率明顯高于低風(fēng)險(xiǎn)組（p<0.05），隨著風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分升高，HCC患者的生存率顯著降低。

圖3? ?①在分析了不同風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)與患者的隨訪時(shí)間、事件及各個(gè)基因的表達(dá)變化的關(guān)系后，可以觀察到患者的生存率隨著風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)的增加明顯下降。

②該模型森林圖顯示BIRC5是肝癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，模型整體具有顯著意義，③生存分析曲線顯示高風(fēng)險(xiǎn)組生存力顯著低于低風(fēng)險(xiǎn)組。

3.討論

目前自噬與HCC的發(fā)生發(fā)展關(guān)系研究主要集中通路抑制，基因突變，耐藥等多方面，但ARGs對(duì)肝癌的具體作用仍不明確，臨床意義也有待研究;大部分基于生物信息學(xué)分析ARGs的研究更多的是研究單基因的表達(dá)差異與肝癌預(yù)后的影響，預(yù)測能力有限;本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫中獲取肝癌數(shù)據(jù)集并采用三種R軟件包分析了肝癌組織與癌旁組織中表達(dá)具有差異性的ARGs，避免了單一R軟件包對(duì)ARGs的漏篩，更好的展現(xiàn)ARGs在肝癌中的表達(dá)情況;由此基于差異表達(dá)ARGs構(gòu)建了HCC風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型對(duì)肝癌患者生存時(shí)間進(jìn)行預(yù)測，最終納入2個(gè)與肝癌患者預(yù)后生存時(shí)間顯著相關(guān)的ARGs，有效的提升了ARGs的臨床預(yù)測價(jià)值。

本研究分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中肝癌數(shù)據(jù)集的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，研究結(jié)果顯示了ARGs在肝癌中的表達(dá)水平以及預(yù)測肝癌預(yù)后的作用。研究共得到19個(gè)差異ARGs，其中11個(gè)基因在肝癌組織的表達(dá)量上調(diào)，8個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。通多單因素COX回歸分析發(fā)現(xiàn)BIRC5、CDKN2A、TP73、CLN3與肝癌患者預(yù)后生存時(shí)間顯著相關(guān)，為進(jìn)一步縮小范圍，采用多因素COX分析ARGs表達(dá)量與生存時(shí)間的關(guān)系，最終確定了BIRC5與CLN3兩個(gè)差異ARGs，并利用這兩個(gè)基因建立了肝癌風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測評(píng)分模型。隨后對(duì)模型的預(yù)測能力進(jìn)行檢驗(yàn)，生存分析顯示通過該風(fēng)險(xiǎn)模型計(jì)算所得高風(fēng)險(xiǎn)組生存時(shí)間顯著低于低風(fēng)險(xiǎn)組，表明該模型在HCC患者生存時(shí)間預(yù)測上具有一定的臨床價(jià)值。

BIRC5（baculoviral inhibitor of apoptosis repeat-containing protein 5）是一種凋亡抑制蛋白，主要參與細(xì)胞凋亡抑制[4]，BIRC5在多數(shù)腫瘤中高表達(dá)，通過調(diào)控細(xì)胞凋亡與細(xì)胞轉(zhuǎn)化影響腫瘤遷移、復(fù)發(fā)，同時(shí)也參與血管生成，細(xì)胞有絲分裂與腫瘤耐藥等，BIRC5是所有凋亡抑制的調(diào)控因子中功能最強(qiáng)的因子[5]，基于這些特性BIRC5成為抑制凋亡靶向因子的研究熱點(diǎn)，有研究表明BIRC5在腫瘤組織中表達(dá)量升高并對(duì)HCC患者的預(yù)后預(yù)測有著顯著影響[6]，與本研究得到的結(jié)果類似;CLN3是定位于核內(nèi)體和溶酶體上的抗凋亡蛋白，CLN3通過抑制內(nèi)源性神經(jīng)酰胺作用而表達(dá)抗凋亡作用[7]，Marcel Klein等[8]研究發(fā)現(xiàn)其與細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和調(diào)控自噬有關(guān)，在CLN3基因敲除的細(xì)胞中，溶酶體活性與溶酶體數(shù)量都出現(xiàn)了降低，而自噬體數(shù)量升高，提示CLN3可能通過溶酶體系統(tǒng)影響細(xì)胞 自噬。但BIRC5與CLN3對(duì)肝癌預(yù)后生存的影響尚未明確，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫肝癌數(shù)據(jù)集確定了ARGs的表達(dá)水平與分布狀況，并對(duì)差異ARGs的生物學(xué)功能及對(duì)肝癌患者預(yù)后影響進(jìn)行了深入探索，發(fā)現(xiàn)了19個(gè)在肝癌組織中表達(dá)具有差異性的自噬基因，并確定了2個(gè)與肝癌患者預(yù)后生存時(shí)間顯著相關(guān)的自噬基因，建立了HCC風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型，該模型有待在臨床一線中進(jìn)一步驗(yàn)證其準(zhǔn)確性，幫助臨床醫(yī)生制定更加精準(zhǔn)的治療策略。

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課題名稱：HBX基因突變調(diào)控PI3K/Akt/mTOR通路對(duì)肝癌細(xì)胞自噬的作用及其機(jī)制研究

課題編號(hào)：2019GXNSFDA245001

課題類型：廣西自然科學(xué)基金