田秋豐，張 紅，尹珺伊，史同瑞，張 軍，劉秋瑾，王 巖，秦平偉，王 歡，白長勝，陳楠楠，朱慶賀，苗 艷

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，齊齊哈爾 161005)

不動桿菌屬(Acinetobacterspp.)最早是由荷蘭微生物學(xué)家Beijerinck于1911年從土壤中分離出來，不動桿菌典型特征是無芽胞、無鞭毛、無動力，生存能力強，廣泛分布于土壤、水塘等自然界中[1-3]，并且具有廣泛的耐藥性[4]。約翰遜不動桿菌引起畜禽動物感染發(fā)病的報道極少，僅有少量報道從白額雁臟器[5]、肉牛鼻腔拭子[6]、草魚腸道[7]等分離到約翰遜不動桿菌。本研究從奶牛墊料中分離到1株約翰遜不動桿菌，并進行了生物學(xué)特性的研究，研究結(jié)果可為奶牛源約翰遜不動桿菌病的防治提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 從齊齊哈爾市某奶牛場，隨機無菌采集奶牛墊料，低溫運輸至實驗室。

1.1.2 主要試劑及培養(yǎng)基 革蘭染色試劑盒購自比克曼生物科技有限公司；基因組DNA抽提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；細菌微量生化反應(yīng)管和藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司。營養(yǎng)瓊脂、肉湯培養(yǎng)基、鮮血瓊脂培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 實驗動物 選用健康的9周齡、體重約25 g的雌性 BALB/c 小鼠10只，購自齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 分離菌純化及革蘭染色 在超凈臺內(nèi)將采集的墊料用無菌生理鹽水稀釋，混勻后吸取稀釋液100 μL涂布于高壓滅菌后的營養(yǎng)瓊脂平板、血平板，37 ℃恒溫需氧培養(yǎng)24 h，挑取平板上的典型單菌落進行純化培養(yǎng)。將3次劃線傳代純培養(yǎng)后的分離菌命名為HLJBDJ-1，挑取純化后的菌落進行革蘭染色，在1 000倍光鏡下觀察細菌形態(tài)。

1.2.2 生化試驗 按照《伯杰細菌鑒定手冊》進行鑒定，對純培養(yǎng)分離菌株在超凈臺內(nèi)無菌接種到微量生化管進行精氨酸雙水解酶、精氨酸脫羧、葡萄糖、乳糖、蔗糖、木糖醇、半乳糖、麥芽糖、果糖、甘露醇、葡萄糖磷酸鹽、硫化氫、動力試驗、尿素等生化試驗，觀察并記錄結(jié)果。

1.2.3 16S rDNA序列測定及同源性分析 不動桿菌的鑒定采用PCR方法進行判定，選用細菌16S rDNA通用引物擴增，引物序列為 27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R: 5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′。25 μL PCR反應(yīng)體系:DNA模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL(引物濃度為10 μmol·L-1)，2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，加超純水至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s， 72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸20 min， 4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，取7 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳，對陽性PCR產(chǎn)物進行測序分析。將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中參考菌株進行Blast同源比對分析，并利用MEGA6.0軟件中鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 動物致病性試驗 將純化后分離菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃ 培養(yǎng)12～24 h，將分離菌用生理鹽水調(diào)整濃度至6.9×108CFU·mL-1。將10只健康BALB/c 小鼠，隨機分為試驗組、對照組，每組5只，試驗組每只腹腔注射0.2 mL菌液，對照組腹腔注射等體積無菌生理鹽水。接種后分開飼養(yǎng)，觀察記錄小鼠死亡及發(fā)病情況。無菌剖檢死亡小鼠，觀察組織器官病變情況，無菌采取心、肝等組織，按照“1.2.1”方法分離細菌。

1.2.5 藥敏試驗 本分離菌藥敏試驗采用K-B紙片瓊脂擴散法。取100 μL新鮮菌液均勻涂布在營養(yǎng)瓊脂平板上，待菌液稍干后無菌操作貼上藥敏片，置37 ℃溫箱培養(yǎng)18～24 h，使用游標卡尺測量抑菌圈直徑(mm)，記錄菌株的敏感程度，參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI 2019)抗菌藥物敏感性標準，判斷分離菌對不同抗生素的敏感性。

2 結(jié) 果

2.1 細菌的培養(yǎng)特征及鏡檢

該分離菌在營養(yǎng)瓊脂平板上需氧培養(yǎng)生長良好，培養(yǎng)12 h菌落呈露珠狀，菌落表面光滑、灰白色、半透明，直徑1～2 mm(圖1A);在血瓊脂平板上可見圓潤、半透明、不溶血的白色菌落(圖1B)。挑取已純化菌落進行革蘭染色，鏡下可見分離菌為陰性，可見菌體多為短桿狀，常雙排列，偶見單個零散排列(圖1C)。

2.2 生化鑒定

該分離菌對精氨酸雙水解酶和精氨酸脫羧酶呈陽性，對葡萄糖、乳糖、蔗糖、木糖醇、半乳糖、麥芽糖、果糖、甘露醇、葡萄糖磷酸鹽、硫化氫、硝酸鹽還原反應(yīng)、動力試驗、尿素、枸櫞酸鹽、丙二酸鹽呈陰性。參照《伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊》，分離菌HLJBDJ-1與不動桿菌屬標準生化試驗結(jié)果基本一致。

A.營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；B.綿羊血瓊脂培養(yǎng)基；C.革蘭染色鏡檢(1 000×)A. Nutrient agar medium; B.Sheep blood agar medium; C. Gram staining morphology(1 000×)圖1 分離菌培養(yǎng)特性及形態(tài)觀察Fig.1 Culture characteristics and morphological observation of isolated bacteria

2.3 PCR檢測與測序分析

分離菌16S rDNA基因PCR擴增后條帶大小約1 300 bp(圖2)。測序結(jié)果顯示，分離菌16S rDNA核苷酸序列長為1 283 bp，將其進行Blast對比分析，結(jié)果顯示，該分離菌與不動桿菌屬同一分支，與GenBank收錄的約翰遜不動桿菌KJ806475(福建株)相似性最近，相似性為99.45%，與溶血不動桿菌、瓊氏不動桿菌等親緣性較遠(圖3)。

M. DNA相對分子質(zhì)量標準；1～2. 分離菌株 16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物；3～4. 陰性對照N. DL2000 DNA marker；1-2.16S rDNA PCR amplication products of isolated strain；3-4. Negative control圖2 分離菌株16 S rDNA的PCR擴增Fig.2 PCR amplification of 16S rDNA of isolated strains

2.4 動物致病性試驗

接種后3 h內(nèi)，試驗組全部開始表現(xiàn)出精神萎頓、腹式呼吸、畏寒抱團，瀕死小鼠張口呼吸等癥狀，8 h內(nèi)死亡4只小鼠，死亡率為80%(4/5)，剩余1只 小鼠于48 h后恢復(fù)正常狀態(tài)。對照組小鼠無死亡，一切正常。剖檢死亡小鼠可見腸壁變薄積氣積液，肝充血腫大，呈暗紅色。從死亡小鼠的肝和腸道進行細菌分離，經(jīng)鑒定均分離出HLJBDJ-1，證明HLJBDJ-1對小鼠具有較強的致病性。

2.5 藥敏試驗

HLJBDJ-1對鏈霉素、復(fù)方新諾明、阿米卡星、卡那霉素、妥布霉素、慶大霉素敏感，對頭孢噻肟、頭孢呋辛中度敏感，對青霉素、克林霉素、紅霉素、氨芐西林耐藥，具體見表1。

3 討 論

目前，對不動桿菌屬的研究多數(shù)被集中在鮑曼不動桿菌上，很少人研究屬內(nèi)其他菌種[8]。像鮑曼不動桿菌一樣，約翰遜不動桿菌廣泛分布于醫(yī)院內(nèi)和自然環(huán)境中[9-10]，在醫(yī)院器具、患者痰和血液標本、土壤、海洋等均可分離到[11-13]。約翰遜不動桿菌具有較強的外界抵抗力，在一些殺菌劑或者高磷高鹽環(huán)境下依然能夠生存[14]。此外還具有光修復(fù)機制，在3 931 J·m-2的紫外線強度照射下，依然可以存活36 h，一段時間內(nèi)能夠修復(fù)受損的DNA[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，分離菌除精氨酸雙水解酶、精氨酸脫羧酶試驗為陽性外，糖發(fā)酵、硝酸鹽還原動力試驗均為陰性，基本符合不動桿菌“三陰”的生化特性，說明對糖類成分分解利用能力極低。但與奉鑒金等研究并不完全一致，表明細菌生化試驗僅作為未知細菌鑒定的初步判定方法，再結(jié)合核酸擴增或基因測序等分子生物學(xué)檢測方法，可以進一步分型。不動桿菌具有廣泛的耐藥性，耐藥性與其復(fù)雜的耐藥機制有關(guān)。本研究中，分離菌對鏈霉素等6種藥物敏感，對青霉素、氨芐西林等耐藥，與奉鑒金等報道的主要對磺胺類和四環(huán)素類抗生素耐藥的結(jié)果不一致，可能是不同動物來源的細菌地域差異性所導(dǎo)致。

4 結(jié) 論

從奶牛墊料中分離到1株約翰遜不動桿菌，該菌對鏈霉素等6種藥物高度敏感，用6.9×108CFU·mL-1劑量的分離菌攻毒健康BALB/c小鼠，小鼠死亡率達80%，提示該分離菌株具有較強的毒力。

圖3 分離菌株16 S rDNA的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of isolated strains based on 16S rDNA

表1 藥敏試驗結(jié)果