孫 吉，岳 華,2，湯 承,2*

(1. 西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041； 2.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041)

犢牛腹瀉在養(yǎng)殖過程中十分常見，具有高發(fā)病率和高致死率的特點(diǎn)，給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。引起牛腹瀉的病原體有細(xì)菌、病毒、寄生蟲等[1]，其中造成牛腹瀉的最常見病毒有牛輪狀病毒 (bovine rotavirus，BRV)[2]、牛冠狀病毒 (bovine coronavirus，BCoV)[3]、牛病毒性腹瀉黏膜病病毒 (bovine viral diarrhea virus，BVDV)[4]。近幾年的國內(nèi)相關(guān)報(bào)道，牛紐布病毒(bovine nebovirus，BNeV)和牛諾瓦病毒(bovine norovirus，BNoV)被報(bào)道與牛腹瀉疾病有關(guān)[5]，二者均屬于牛腸道嵌杯病毒(bovine enteric caliciviruses, BECs)[6-7]。上述5種病毒均可以造成犢牛的腹瀉，并且常發(fā)生混合感染。

牛輪狀病毒(BRV)是呼腸孤病毒科輪狀病毒屬一種雙鏈無囊膜RNA病毒[8]。A群輪狀病毒也是引起家畜感染的最主要的原因[9]。通常導(dǎo)致年齡小于3周齡的小牛腹瀉。臨床癥狀表現(xiàn)為排出水樣淺黃色稀便，嚴(yán)重時(shí)也表現(xiàn)為血便并通常含有大量的黏液，成年牛一般呈隱性感染，并通過糞便將病毒排放到環(huán)境中引起群體大規(guī)模感染[10]。近年來，有研究表明，BRV能跨種間傳播造成人或其他動(dòng)物的感染[11-12]。牛冠狀病毒(BCoV)是單鏈無節(jié)段的正向基因組RNA組成，屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬[13]。BCoV主要引起1～2周齡小牛的腹瀉，成年動(dòng)物出血性腹瀉、并伴有呼吸系統(tǒng)疾病，研究表明，BCoV在我國普遍存在；也是引起犢牛及成年牛腹瀉的重要病原之一[14]。牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)為單股正鏈RNA病毒，是瘟病毒屬的成員[15]，主要導(dǎo)致牛的發(fā)燒，腹瀉，白細(xì)胞減少，產(chǎn)奶量減少[16]；引起機(jī)體的免疫抑制和持續(xù)性帶毒，亦會(huì)導(dǎo)致懷孕母牛的流產(chǎn)、犢牛的腸道和呼吸道的臨床癥狀[17]，病毒的傳播也會(huì)造成其他動(dòng)物的感染[18]。牛諾瓦病毒(BNoV)屬于嵌杯病毒科，是無囊膜病毒，為線性單鏈正鏈RNA[19]。BNoV主要經(jīng)糞-口傳播，引起的小牛感染的臨床癥狀主要表現(xiàn)為被毛凌亂、精神沉郁、嚴(yán)重嗜睡、急性且持續(xù)的腹瀉，以及伴有吸收障礙[20-21]。牛紐布病毒(BNeV)屬于嵌杯病毒科，為無囊膜的單股正鏈RNA病毒[22]，主要引起3日齡到6月齡的小牛腹瀉。其臨床癥狀主要出現(xiàn)糞便顏色變化，嚴(yán)重時(shí)呈血便、嚴(yán)重腹瀉和腸道損傷[23]，該病毒在我國奶牛和牦牛中廣泛流行；具有獨(dú)特的進(jìn)化趨勢(shì)[24]。以上5種病原微生物所引起犢牛腹瀉在病理變化和臨床癥狀等方面極為相似，在臨床診斷中很難進(jìn)行快速準(zhǔn)確的判斷。

有研究對(duì)2017—2018年山東13個(gè)地區(qū)624份牛腹瀉樣本進(jìn)行檢測(cè)，檢出率分別為BRV17.70%、BCoV8.84%和BVDV34.58%[25]。2010—2011年，對(duì)北京3個(gè)地區(qū)1 650份血液樣品進(jìn)行了BVDV、BCoV、BRV感染抗體檢測(cè)，結(jié)果顯示BVDV抗體平均陽性率為48.20%；BCV抗體平均陽性率為57.20%；BRV抗體平均陽性率為52.20%[26]。對(duì)2017年11月—2018年5月采自四川、遼寧、河南、山東、陜西5個(gè)省的共計(jì)93份奶犢牛腹瀉糞便樣本進(jìn)行檢測(cè)，BNoV的檢出率達(dá)到25.81%[27]。2018年8—11月采自新疆和遼寧的135份奶犢牛腹瀉樣本中BNeV的檢出率為67.41%[28]。由上可見這5種病毒在我國廣泛流行。PCR技術(shù)廣泛運(yùn)用在動(dòng)物疫病的診療過程中，是一種重要的分子檢測(cè)的手段[29]。國內(nèi)外已報(bào)道多個(gè)關(guān)于檢測(cè)這5種 病毒引起牛腹瀉[6,28,30-32]的單一PCR方法等。由于檢測(cè)單一病毒的PCR方法耗時(shí)耗力且只能檢測(cè)特定的病毒，存在著部分缺陷。國內(nèi)外學(xué)者在此基礎(chǔ)上建立了可以同時(shí)檢測(cè)BRV和BCoV[12]，BCoV和BNoV[33]，BRV、BCoV和BVDV[34]等兩種及以上引起牛腹瀉病毒的多重PCR方法。尚無就檢測(cè)本試驗(yàn)的5種致牛腹瀉病毒的多重PCR方法的報(bào)道，本試驗(yàn)的目的在于建立能同時(shí)檢測(cè)這5種病毒的多重PCR方法, 對(duì)疾病作出快速準(zhǔn)確的鑒別診斷，節(jié)約實(shí)驗(yàn)室成本和時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 病毒(菌)株和樣本

牛輪狀病毒、牛冠狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛諾瓦病毒和牛紐布病毒的陽性樣本，由本實(shí)驗(yàn)室保存。用于特異性驗(yàn)證的病毒(菌)菌株及核酸樣本；牛星狀病毒(bovine astrovirus, BAstV)Swun0201、牛細(xì)小病毒(bovine parvovirus， BPV)、牛嵴病毒(bovine kobuvirus，BKV)、牛源K99大腸桿菌Swun4025、牛源都柏林沙門菌Swun3736和牛源空腸彎曲桿菌Swun1639的核酸樣本由本實(shí)驗(yàn)室保存。

檢測(cè)方法比較的樣本：16份肉牛腹瀉糞便樣本(采自2020年9月四川省閬中1個(gè)牧場(chǎng))，10份奶牛腹瀉樣本(采自2020年12月四川省西昌市1個(gè)牧場(chǎng))。由本實(shí)驗(yàn)室保存。

臨床樣本：220份采自于阿壩州的牦牛腹瀉糞便樣本(2019年6月四川省阿壩縣和若爾蓋縣2個(gè)牧場(chǎng)共38份和采自于2020年7—8月四川省紅原縣、若爾蓋縣和阿壩縣的8個(gè)牧場(chǎng)共182份)。所有樣本-80 ℃保存。

1.2 主要試劑和儀器

Trizols Reagent、Prime ScriptTMRT-PCR Kit、Premix TaqTM、DNA Marker DL2000、pMD19-T克隆載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、DNA Marker均購自大連寶生物工程有限公司；Gel Extraction Kit膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自O(shè)MEGA BIO-TEK 公司。凝膠成像系統(tǒng)Doc2000(BioRad公司，美國), 超微量核酸蛋白測(cè)定儀(NanoDrop One)。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI上登錄的BVDV、BNoV、BRVA、BNeV 4種病毒基因的保守序列,用Primer5.0軟件對(duì)4種病毒的基因保守區(qū)域各設(shè)計(jì)1對(duì)引物，參考文獻(xiàn)[35]合成BCoV的檢測(cè)引物，引物序列及相關(guān)信息見表1。

表1 多重PCR引物序列

1.4 核酸提取

牛糞便樣本與PBS以 1∶5混勻后制成懸液，-80 ℃ 反復(fù)凍融3次，12 000 r·min-1離心15 min， 取上清250 μL并根據(jù)TrizolTMReagent試劑盒說明書的步驟提取樣本總RNA，并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系為(20 μL)，采用酚-氯仿法提取細(xì)菌的DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 單一RT-PCR的檢測(cè)方法的優(yōu)化

為了確定單一病毒RT-PCR的反應(yīng)條件，退火溫度可以參考引物設(shè)計(jì)時(shí)的軟件和引物合成訂單，從而分別初步建立檢測(cè)BCoV、BNoV、BRVA、BVDV和BNeV的單一RT-PCR，再對(duì)其反應(yīng)程序中設(shè)置不同的退火溫度，在51～60 ℃之間設(shè)置6個(gè)梯度和引物濃度，確定最佳退火溫度和引物濃度。采用的是25 μL的反應(yīng)體系：Premix TaqTM12.5 μL，cDNA 2 μL， 上下游引物各1 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，送生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 陽性質(zhì)粒的制備

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將擴(kuò)增出來的特異性條帶進(jìn)行膠回收，連接至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，克隆加入到含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)10 h， 將陽性克隆送至生工生物有限公司進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序的結(jié)果用生物軟件(BioXm)進(jìn)行比對(duì)和分析，將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品。

1.7 多重RT-PCR擴(kuò)增及反應(yīng)條件的優(yōu)化

以5種病毒的陽性重組質(zhì)粒DNA混合物為模板,將5個(gè)病毒陽性質(zhì)粒等量混后作為多重RT-PCR反應(yīng)模板，建立25 μL的PCR反應(yīng)體系；Premix TaqTM12.5 μL，cDNA 2 μL，上下游引物各0.1～0.8 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。保持緩沖體系不變，對(duì)退火溫度(退火溫度在50～60 ℃之間設(shè)8個(gè) 梯度)和引物濃度進(jìn)行優(yōu)化。

1.8 特異性試驗(yàn)

用本試驗(yàn)建立的五重RT-PCR方法對(duì)“1.1”中待檢病原的核酸樣本進(jìn)行檢測(cè), 并設(shè)立BRVA、BCoV、BVDV、BNoV和BNeV以及5種病毒混合的陽性標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照, 以評(píng)價(jià)該方法的特異性。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn)

將5種陽性質(zhì)粒混合作為反應(yīng)模板并置于-20 ℃保存，用此方法對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增試驗(yàn)重復(fù)3次，每次間隔1周，評(píng)價(jià)其重復(fù)性。

1.10 敏感性試驗(yàn)

用核酸蛋白儀測(cè)定5種病毒陽性質(zhì)粒的濃度分別為BNoV 2.2 ng·μL-1、BRVA1.8 ng·μL-1、BNeV 2.2 ng·μL-1、BCoV 2.2 ng·μL-1和BVDV 2.1 ng·μL-1，進(jìn)行10倍倍比稀釋，分別為10-1到10-8。取混合稀釋液2 μL作為模板。用本試驗(yàn)建立的RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè), 確定檢測(cè)下限。

1.11 與單一RT-PCR的檢測(cè)符合率的比較

利用本試驗(yàn)建立的五重RT-PCR方法對(duì)2020年 采自四川閬中的16份肉牛腹瀉糞便樣本和西昌的10份奶牛腹瀉糞便樣本進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與單一RT-PCR方法進(jìn)行比較。最終評(píng)價(jià)多重RT-PCR方法的符合率情況。

2 結(jié) 果

2.1 單一RT-PCR的優(yōu)化

以BRVA、BCoV、BVDV、BNoV和BNeV的cDNA作為模板，分別用相對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增，獲得的目的片段大小均與預(yù)期結(jié)果一致(圖1)。經(jīng)送生工生物公司測(cè)序，再進(jìn)行blast序列比對(duì)，結(jié)果表明，各個(gè)病毒所擴(kuò)增的目的片段均為所對(duì)應(yīng)病毒的靶基因，基因序列的相似度為100%。

M. DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. BNoV；3. BRVA；5. BNeV；7. BCoV；9. BVDV; 2、4、6、8、10. 陰性對(duì)照M. DL2000 DNA marker; 1. BNoV; 3. BRVA; 5. BNeV; 7. BCoV; 9. BVDV; 2, 4, 6, 8, 10. Negative control圖1 單一RT-PCR的擴(kuò)增Fig.1 Single RT-PCR amplification

2.2 多重RT-PCR反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化

對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，確定最優(yōu)的反應(yīng)條件: 94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55.7 ℃退火35 s， 72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸6 min； 16 ℃反應(yīng)結(jié)束。

通過對(duì)引物濃度以及反應(yīng)體系的優(yōu)化，最終反應(yīng)體系為Premix TaqTM12.5 μL， BCoV F/R各0.5 μL、BNoV F/R各0.4 μL、BRVA F/R各0.4 μL、BVDV F/R各0.5 μL、BNeV F/R各0.4 μL，樣本DNA 2 μL， ddH2O補(bǔ)足至25 μL。

2.3 多重RT-PCR特異性試驗(yàn)

所建立的五重RT-PCR方法能夠擴(kuò)增出五種陽性質(zhì)粒的混合樣本和5種病毒的陽性樣本，同時(shí)對(duì)“1.1”材料中本實(shí)驗(yàn)室所保存其他的細(xì)菌和病毒株的陽性樣本均不能擴(kuò)增出目的片段(圖2)。

M. DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 5種陽性質(zhì)粒混合；2. BVDV；3. BCoV；4. BNeV；5.BRVA；6. BNoV；7. BPV；8. BAstV；9. BKV；10. E. coli；11.Salmonella；12. Campylobacter jejuniM. DL2000 DNA marker; 1. Mixture of five positive plasmids; 2. BVDV; 3.BCoV； 4. BNeV; 5. BRVA; 6. BNoV; 7. BPV; 8. BAstV; 9. BKV; 10. E. coli; 11.Salmonella; 12. Campylobacter jejuni圖2 多重PCR特異性試驗(yàn)Fig.2 Specificity test of the multiplex PCR

2.4 多重RT-PCR重復(fù)性試驗(yàn)

用所建立的方法重復(fù)檢測(cè)陽性質(zhì)?；旌夏０?次，每次間隔一星期，結(jié)果均可見5條清晰的條帶，表明方法穩(wěn)定性良好(圖略)。

2.5 多重RT-PCR敏感性測(cè)定

在本試驗(yàn)的五重RT-PCR中，BNeV能擴(kuò)增的最低檢測(cè)下限為2.0×105copies·μL-1、BNoV最低檢測(cè)下限1.96×105copies·μL-1，BRVA最低檢測(cè)下限1.63×105copies·μL-1，BCoV最低檢測(cè)下限2.0×106copies·μL-1，BVDV最低檢測(cè)下限1.9×105copies·μL-1(圖3)。

M. DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 10-1；2. 10-2；3. 10-3；4. 10-4；5. 10-5；6. 10-6；7. 10-7M. DL2000 DNA marker; 1. 10-1; 2. 10-2; 3. 10-3; 4. 10-4; 5. 10-5; 6. 10-6; 7. 10-7圖3 多重PCR敏感性試驗(yàn)Fig.3 Sensitivity tests of the multiplex PCR

2.6 與單一PCR檢測(cè)結(jié)果符合率的比較

用本試驗(yàn)建立的五重RT-PCR方法對(duì)四川閬中16份肉牛和西昌10份奶牛的腹瀉糞便樣本的檢測(cè)結(jié)果顯示，BNeV陽性為1份，陽性率為3.8%； BVDV陽性為2份，陽性率為7.7%；BCoV陽性為8份，陽性率為30.8%。沒有檢測(cè)出BRVA和BNoV的陽性樣本，與單一RT-PCR方法檢出的陽性樣本數(shù)一致且陽性符合率100%。表明本試驗(yàn)建立的五重RT-PCR可應(yīng)用于臨床檢測(cè)。

2.7 臨床樣本的檢測(cè)

運(yùn)用所優(yōu)化并建立好的五重RT-PCR的方法對(duì)采集(2019年6月—2020年8月)阿壩州的220份 牦牛腹瀉糞便樣本進(jìn)行檢測(cè)，10個(gè)牛場(chǎng)中BRVA牛場(chǎng)陽性占比9/10，BNoV牛場(chǎng)陽性占比3/10，BNeV牛場(chǎng)陽性占比4/10。對(duì)阿壩州地區(qū)的牦牛腹瀉情況做出詳細(xì)記錄，總結(jié)其流行情況(表3)。

表2 與單一PCR檢測(cè)結(jié)果的比較

3 討 論

多重PCR要求引物在同一反應(yīng)條件下對(duì)單個(gè)或多個(gè)病毒的特定DNA基因序列的擴(kuò)增，靶基因的選擇和引物的設(shè)計(jì)成為了多重RT-PCR的兩個(gè)重要的制約條件[36]。針對(duì)牛腹瀉的多種病原混合感染的情況，國內(nèi)外學(xué)者建立了能夠同時(shí)檢測(cè)出引起牛腹瀉的兩種或以上病原的RT-PCR方法。這其中大多數(shù)方法靶基因的選擇都與單一RT-PCR相一致。其中冠狀病毒的N基因、輪狀病毒的VP6基因和牛病毒性腹瀉病毒的5′UTR基因已經(jīng)成為國內(nèi)外研究者建立檢測(cè)方法的首選靶基因。筆者在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在設(shè)計(jì)冠狀病毒的特異性檢測(cè)引物時(shí)，國內(nèi)外研究人員很多都選擇N基因作為首選靶基因，復(fù)核宏病毒組技術(shù)證實(shí)為陽性的牛腹瀉糞便樣本時(shí)，結(jié)果幾種方法均未能檢出[35]，追其方法的檢出率和準(zhǔn)確性有待進(jìn)一步驗(yàn)證，遂選擇本實(shí)驗(yàn)室已建立好的冠狀病毒的檢測(cè)方法。諾瓦病毒的引物設(shè)計(jì)多選擇為ORF1中的RdRp基因，但BNoV在RdRp區(qū)存在著多個(gè)核苷酸發(fā)生突變[37]，所以針對(duì)諾瓦病毒這種靶基因的特點(diǎn)，如何設(shè)計(jì)出特異性檢測(cè)引物成為了非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。輪狀病毒在國內(nèi)外牛腹瀉樣本中主要檢測(cè)出的多為A型，不同品種的牛感染的輪狀病毒在基因位點(diǎn)上也存在著少許的突變。VP6基因常常作為輪狀病毒分子檢測(cè)的首要靶基因，但其存在不同程度的點(diǎn)突變[38]，所以選擇更為保守的基因片段成為了提高檢出率的重中之重。

筆者選擇了與單一PCR檢測(cè)方法同樣的病毒靶基因來設(shè)計(jì)引物，運(yùn)用Mega 7生物軟件進(jìn)行了保守基因的基本的生物信息學(xué)分析，選擇了更為保守的基因片段并同時(shí)設(shè)立兼并堿基作為特異性擴(kuò)增引物。筆者在設(shè)計(jì)引物的同時(shí)，嚴(yán)格控制退火溫度之間的差距，盡量保持引物的Tm值相同或差距不大。通過對(duì)退火溫度的優(yōu)化，最終確定為55.7 ℃。本研究充分考慮擴(kuò)增的目的條帶能夠在電泳圖上被有效分開便于觀察，各條帶之間的差距大于70 bp。在2%的瓊脂糖凝膠濃度時(shí)，可以觀察到的圖像最為清晰，引物之間沒有形成二聚體結(jié)構(gòu)，且有著較好的特異性、靈敏度和穩(wěn)定性。證明本試驗(yàn)建立的五重PCR 方法可用于臨床病料的檢測(cè)與診斷，為這5種病毒提供新的分子檢測(cè)手段。

根據(jù)近幾年國內(nèi)的流行病學(xué)的調(diào)查資料顯示，牛輪狀病毒、牛冠狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒是引起牦牛腹瀉的3種病毒。有研究對(duì)2018年采自西藏林芝市波密縣210份待檢樣品中分別檢出BCoV的抗原陽性率為35.70%；BVDV抗體陽性率為78.60%[39]。對(duì)來源于2012年9—12月川西北阿壩州8縣的1 070份牦牛血清行了抗體檢測(cè)，結(jié)果顯示，BVDV、BCoV和BRV抗體平均陽性率分別為44.3%、84.1%和94.4%[40]。研究結(jié)果表明這3種 病毒在牦牛中普遍存在，需進(jìn)一步加強(qiáng)該地區(qū)牦牛病毒性腹瀉疾病的綜合防制。對(duì)采自2017年1月—2018年7月的354個(gè)牦牛腹瀉樣品進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)， BNeV的陽性率為22.0%[41]。此次檢測(cè)結(jié)果證實(shí)牛諾瓦病毒也可造成牦牛的感染。由于以上5種病毒均可引起牦牛的腸道的炎癥、腹瀉、脫水等臨床病理表現(xiàn)且常常發(fā)生混合感染，大大增加了臨床診斷和病情監(jiān)測(cè)的難度。

在與單一PCR進(jìn)行比較的樣本中，并沒有檢測(cè)出BRV和BNoV，其原因可能是宿主種類、地域或是管理差異帶來的結(jié)果，且可能病毒在不同種類牛上的遺傳演變存在著一定差異。對(duì)2019年6月—2020年8月采自于阿壩州的220份牦牛樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示，BRV依然是引起牦牛腹瀉的主要病毒，在紅原縣和若爾蓋縣的腹瀉樣本中都有較高的檢出率，檢出率達(dá)到40.5%，說明還需要進(jìn)一步加強(qiáng)監(jiān)控輪狀病毒的流行趨勢(shì)，此外BNoV的陽性檢出率為5.9%、BNeV的陽性檢出率為4.5%。關(guān)于這兩種新發(fā)病毒的檢出情況還是要加強(qiáng)監(jiān)測(cè)，由于嵌杯病毒科的靶基因RdRp基因不是很穩(wěn)定，時(shí)有發(fā)生點(diǎn)突變，導(dǎo)致其檢出率下降。所以應(yīng)加強(qiáng)對(duì)BNoV和BNeV兩種病毒的實(shí)時(shí)監(jiān)控，即時(shí)的建立新的檢測(cè)方法來做好進(jìn)一步的防治措施。此次檢測(cè)結(jié)果中并沒有BCoV和BVDV兩種病毒的檢出，筆者分析其原因可能由于疫苗的接種、飼養(yǎng)環(huán)境的改善和更良好的科學(xué)飼養(yǎng)方法導(dǎo)致，也可能存在著5對(duì)引物間的相互干擾，導(dǎo)致多重RT-PCR的靈敏性上還欠缺。在五重RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，牛的腹瀉往往也因?yàn)閮煞N及以上的病毒共同感染所致，兩種病毒引起的混合感染的陽性檢出率為5%，3種病毒混合感染的陽性檢出率為0.5%。混合感染的病毒都為牛輪狀病毒和杯狀病毒，究其原因還有待進(jìn)一步研究。病毒的混合感染可導(dǎo)致更嚴(yán)重的臨床癥狀及病變，更有嚴(yán)重的情況被治療后導(dǎo)致預(yù)后不良。運(yùn)用此方法可以快速準(zhǔn)確地進(jìn)行鑒別診斷，臨床治療時(shí)可以對(duì)癥下藥，爭(zhēng)取了寶貴的治療時(shí)間，且可降低多方面的損失。

4 結(jié) 論

首次成功建立了可以同時(shí)檢測(cè)牛A群輪狀病毒(BRVA)、牛冠狀病毒(BCoV)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、牛諾瓦病毒(BNoV)和牛紐布病毒(BNeV)的多重RT-PCR方法，可以滿足對(duì)臨床樣本的快速診斷。本方法可充分節(jié)省時(shí)間、人力和節(jié)約診斷成本。目前阿壩州部分地區(qū)牛場(chǎng)引進(jìn)牛群中，BRV、BCoV和BVDV仍然是引起牦牛腹瀉的主要病毒， BNoV和BNeV引起的腹瀉更加值得關(guān)注，并且存在著混合感染的情況，檢測(cè)結(jié)果可為當(dāng)?shù)氐囊咔榉揽睾蜕a(chǎn)養(yǎng)殖提供重要參考。