李紫仟，陳 卓，任強林，馬義誠，葉倩文，夏瑞陽，王金泉，趙紅瓊，馬忠祥，李紅波，姚 剛*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052； 2.新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所，烏魯木齊 830011； 3.新疆刀郎陽光農(nóng)牧科技股份有限公司，麥蓋提縣 844600)

牛異食行為(PICA)的發(fā)生是由營養(yǎng)、環(huán)境、機體代謝等多種因素引起，多發(fā)生在早春和冬季，臨床表現(xiàn)為舔食、啃咬一些無營養(yǎng)價值異物[1]。許多研究者認為，飼料中礦物質(zhì)、維生素等營養(yǎng)元素的不足是引發(fā)牛異食行為的主要原因，當飼料中維生素A、D、E含量不能滿足動物需求，引起的代謝機能紊亂也會導(dǎo)致異食行為的發(fā)生；患有前胃遲緩或某些寄生蟲也是誘發(fā)異食行為的原因之一[2-3]。肉牛多采用集約化飼養(yǎng)，外界環(huán)境如溫度、濕度、空氣質(zhì)量、病原體含量等多種因素都可能誘發(fā)機體生理代謝異常，導(dǎo)致PICA的產(chǎn)生[4-5]。腸道菌群是動物機體最復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，與宿主的生理、免疫、健康和疾病密切相關(guān)。目前，動物行為與腸道菌群-腸-腦(microbiota-gut-brain，MGB)軸之間的相關(guān)越來越受到研究者的重視，更有研究者認為，所有的疾病都始于腸[6]。Bonaz等[7]指出，腸菌群與迷走神經(jīng)不能直接相互作用，而是通過腸道菌群的代謝和介導(dǎo)腸道上皮細胞分泌對迷走神經(jīng)進行調(diào)控，從而影響動物的行為。劉海鵬[8]在通過對味覺嗜好性與小腸的運動調(diào)節(jié)的研究中表明，迷走神經(jīng)對小腸運動有著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，反之，腸道菌群失調(diào)能夠影響腸道的蠕動，進而影響神經(jīng)系統(tǒng)。Kaakoush等[9-10]研究了專用腸內(nèi)營養(yǎng)(exclusive enteral nutrition, EEN)治療克羅恩病(CD)的病人，發(fā)現(xiàn)EEN治療下CD病人腸道菌群種類豐富度增加，降低了疾病相關(guān)的炎癥因子，反過來，腸道菌群豐度的降低可能增加炎癥因子的產(chǎn)生。牛異食行為的發(fā)生和影響因素已有大量研究報道，但對發(fā)生異食行為牛的腸道菌群變化缺乏足夠的研究。本研究在對安格斯肉牛PICA行為的臨床調(diào)查基礎(chǔ)上，測定PICA肉牛血液和毛發(fā)中的礦物質(zhì)、脂溶性維生素和游離氨基酸等營養(yǎng)代謝物，同時對其腸道菌群的結(jié)構(gòu)和豐度進行分析，探查了腸道菌群變化與PICA發(fā)生的相關(guān)性，以期為通過調(diào)控腸道菌群防治PICA行為提供研究基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及食糞行為觀察

對某商品安格斯肉牛養(yǎng)殖場659頭安格斯牛進行了食糞調(diào)查。所有牛均為初產(chǎn)母牛，分別在9：00和20：00飼喂全混合日糧(TMR，表1)和自由飲水，8：00～20：00用攝像機記錄食糞尿行為的發(fā)生。

1.2 動物分組與樣本收集

臨床調(diào)查結(jié)束后，隨機抽取10頭無臨床異食癥狀的作為正常對照牛(Ctrl)和10頭發(fā)生異食臨床癥狀牛(PICA)，采集下列相關(guān)樣本進行病原學(xué)調(diào)查。

血液樣品：在清晨空腹狀態(tài)下經(jīng)頸靜脈采血，分離血清保存于-20 ℃，主要用于脂溶性維生素、游離氨基酸及總蛋白測定。

毛發(fā)樣品：從牛頭上剪下毛發(fā)樣本，然后保存在4 ℃中，主要用于礦物質(zhì)測定。

糞便樣品：使用一次性無菌PE手套于牛直腸采取糞便，密封后儲存在液氮容器中。主要用于腸道菌群測定。

1.3 檢測指標

1.3.1 礦物元素 對被毛中鈉(Na)、磷(P)、鈣(Ca)、鐵(Fe)、銅(Cu)、鈷(Co)、錳(Mn)和鋅(Zn)離子的測定采用微波消解(ETHOS 1, MILESTONE)、電感耦合等離子光譜儀(Optima 8000，Perkin Elmer，美國)以及電感耦合等離子質(zhì)譜儀(iCAPQ，Perkin Elmer，美國)檢測。

1.3.2 脂溶性維生素 采用高效液相色譜法(1260, Agilent, USA)測定血清中脂溶性維生素A、D、E的含量。

1.3.3 游離氨基酸和總蛋白 血清中天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Alu)、胱氨酸(Cys)、絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、精氨酸(Arg)、蘇氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、纈氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Iso)、苯丙氨酸(Phe)、賴氨酸(Lys)的游離氨基酸采用液相色譜儀(1260，美國安捷倫)測定，總蛋白(TP)用凱氏定氮法(K9840，濟南漢能儀器有限公司)測定。

1.3.4 腸道菌群測定 使用糞便DNA提取試劑盒DP328(天恩生化技術(shù)(北京)有限公司)提取糞便DNA。用分光光度計測定DNA濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。PCR擴增目的序列。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用凝膠提取試劑盒Axygen收集。根據(jù)電泳的初步定量結(jié)果，對回收的PCR擴增產(chǎn)物進行熒光定量。測序文庫用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Libray Prep Kit制備，測序前用Agilent BioAnalyzer和Agilent High Sensity DNA Kit進行質(zhì)量檢驗。使用Promega QuantiFluo系統(tǒng)中的Quant-it Pico Green dsDNA檢測試劑盒對合格的測序文庫進行定量。將合格測序文庫的定量結(jié)果按測序量按一定比例混合，NaOH變性后在MiSeq測序儀上用MiSeq Reagent Kit V3(600個循環(huán))進行2×300 bp的雙端測序，序列長度在200～450 bp之間。選擇V3和V4可變區(qū)進行高通量測序和分析，對PICA組的腸道菌群組成結(jié)構(gòu)的α-多樣性(T檢驗)和β-多樣性(Anosim & Adonis 檢驗)進行差異分析，比較差異差異菌門和菌屬(T檢驗)，并采用Perason相關(guān)分析方法對差異營養(yǎng)成分和菌群組成進行相關(guān)分析。

1.3.5 差異氨基酸和差異菌群相關(guān)性分析 數(shù)據(jù)采用“Mean±SD”表示，采用GraphPad Prism 8.2.1統(tǒng)計軟件進行T檢驗(T-test)方法對組間差異顯著性進行檢驗，P<0.05差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，對差異血液氨基酸指標和差異菌群進行Pearson相關(guān)性分析，0

2 結(jié) 果

2.1 PICA臨床癥狀調(diào)查結(jié)果

本次調(diào)查結(jié)果顯示，659頭安格斯肉牛中有285頭牛出現(xiàn)明顯的采食糞尿行為，占總頭數(shù)43.2%，采食糞尿情況多發(fā)生在10：00至18：00之間，臨床表現(xiàn)為舔食糞便和泥土，患牛易驚恐，對外界刺激敏感性增高，逐漸消瘦、貧血，常發(fā)生消化不良，食欲不振，在發(fā)病初期多便秘，其后下痢或便秘和下痢交替出現(xiàn)。

圖1 安格斯妊娠母牛的食糞行為Fig.1 PICA behavior of Angus pregnant cows

2.2 營養(yǎng)代謝物測定結(jié)果

2.2.1 正常牛與異食行為牛被毛中礦物質(zhì)含量比較 對Ctrl組和PICA組被毛中的礦物質(zhì)含量進行了T-test檢驗(表2)，結(jié)果顯示，Ctrl組與PICA組被毛中礦物質(zhì)含量均無顯著性差異(P>0.05)。

2.2.2 脂溶性維生素A、D、E測定 Ctrl組和PICA組血清中脂溶性維生素含量如表3所示，兩組脂溶性維生素含量無顯著性差異(P>0.05)。

2.2.3 蛋白質(zhì)與氨基酸差異性比較 Ctrl組與PICA組血清中17種游離氨基酸的含量如圖2所示，與Ctrl組相比，PICA組中Iso和Phe顯著升高(P<0.05)，其他氨基酸在組間均無顯著性差異。

2.3 腸道菌群物種組成分析

2.3.1 各水平微生物分類單元ASV/OTU的數(shù)量 如圖3所示，Ctrl組與PICA組腸道菌群在門、綱、目、科、屬水平上均無顯著性差異著。

2.3.2 各水平物種組成差異分析 在Ctrl組和PICA組腸道菌群中共檢測到31個門，其中相對豐度排名前20位的門和屬如圖4所示。有9個門的相對豐度在0.1%以上，其中相對豐度在10%以上的最大的2個門是厚壁菌門(Firmicuts) 和擬桿菌門(Bacteroidetes)，其余的是TM7、螺旋體菌門(Spirochaetes)、放線菌門(Actinobacteria)、軟壁菌門(Tenericutes)、藍細菌門(Cyanobacteria)、疣微菌菌門(Verrucomicrobia)和變形桿菌門(Proteobac-teria)。屬水平上共檢出451個屬，對其中相對豐度在0.1%以上的前20個屬統(tǒng)計如圖4，只有梭狀芽孢桿菌屬的相對豐度在5%以上。

組間進行T-test檢驗，*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01)。下同Unpaired T-test was conducted in each item between Ctrl and PICA, * showed the significant difference (P<0.05), while ** showed the extremely significant difference (P<0.01). The same as below圖2 Ctrl和PICA牛之間血清游離氨基酸和總蛋白差異性比較Fig.2 Comparison of serum free amino acids and total protein between Ctrl and PICA cows

圖3 Ctrl和PICA 組ASV/OTU在不同分類水平上的數(shù)量及其差異Fig.3 The number and difference of ASV/OTU between Ctrl and PICA groups at different classification

圖4 Ctrl和PICA牛之間門和屬水平上的腸道菌群組成(前20)Fig.4 The composition of gut microbiota at the level of phylum and genus between Ctrl and PICA cows(Top 20)

2.3.3 Alpha-diversity分析 對PICA和Ctrl組牛腸道菌群進行α多樣性分析(圖5)，結(jié)果表明，Ctrl組與PICA組腸道微生物的Chao1、Simpson、Shannon、Pielou-e、Goods_coverage、Observed-species和Faith_PD指數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)。

2.3.4 Beta-diversity分析 經(jīng)Weighted UniFrac based PCoA和Weighted UniFrac UPGMA聚類樹分析，Ctrl與PICA組之間腸道菌群分布聚集如圖6。Axis1(PCoA1)的貢獻率為16.2%，Axis2(PCoA2)的貢獻率為11.7%。兩組間菌群不呈現(xiàn)明顯獨立分布。

2.3.5 門和屬水平上腸道菌群差異 如圖7所示，對Ctrl和PICA組相對豐度大于0.1%的菌門、菌屬進行差異性比較，結(jié)果顯示與Ctrl組相比，PICA組中柔壁菌門(Tenericutes)顯著升高(P<0.05)。而顫螺菌屬(Oscillospira)和CF231菌屬顯著降低(P<0.05)。

2.3.6 Pearson相關(guān)分析 經(jīng)Pearson相關(guān)分析(圖8)，結(jié)果提示，Iso與CF231呈顯著負相關(guān)(P<0.05)，Phe與Tenericutes呈顯著負相關(guān)(P<0.05)。

3 討 論

安格斯肉牛是著名的優(yōu)良肉牛品種，肉用性能良好，早熟易肥，肉質(zhì)細嫩、凈肉率高、大理石花紋明顯；較耐粗飼，飼料轉(zhuǎn)化率高。本研究對安格斯肉牛養(yǎng)殖場母牛異食行為進行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)其發(fā)生率為43.2%。異食行為的產(chǎn)生對肉牛的食欲、生產(chǎn)能力都有很大影響，現(xiàn)有觀點認為，礦物質(zhì)元素的缺乏是導(dǎo)致異食行為發(fā)生的重要致病因素[2,11-18]。Nikvand等[19]的研究結(jié)果表明，異食行為的肉牛相較于正常牛血液中鐵、鉀、氯、磷含量顯著降低，而銅、鋅、鈣、鎂、鈉含量差異不顯著。脂溶性維生素是反芻動物機體維持正常代謝和生理機能所必需的低分子有機化合物，幾乎參與所有的新陳代謝反應(yīng)，如維持細胞功能及酶活性，調(diào)節(jié)碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪的代謝，且具有不可替代的作用[18]。王永衛(wèi)等[20]對寧夏固原地區(qū)牛瞎眼病的研究發(fā)現(xiàn)，大部分瞎眼病牛還伴有舔墻、嚼韁繩、啃槽、吃石頭、食毛、叼瓦塊等異食癖現(xiàn)象，大多異食行為的病牛血漿中VA的含量低于正常水平(20 μg·dL-1)[21]，因此VD和VE等多種維生素的缺乏可能是引起骨組織代謝障礙和腦脊髓壓升高，同時也是造成犢牛精神異常并導(dǎo)致異食行為發(fā)生的原因[22]。本研究通過對安格斯肉牛血液維生素A、D、E的檢測發(fā)現(xiàn)，PICA組與Ctrl組相比無顯著性差異，VA和VD含量與他人研究中正常牛含量一致[23-24]，但VE的含量明顯低于Ghaffari等[25]研究中正常牛血液VE的含量(1.82～4.99 mg·L-1)。雖然本研究中PICA與Ctrl組之間VE的含量無顯著差異，但仍然明顯低于他人研究中健康牛血液中VE的含量，提示VE的缺乏可能是導(dǎo)致PICA行為的原因。

圖5 Ctrl和PICA組腸道菌群α多樣性指數(shù)Fig.5 Index of alpha diversity of gut microbiota between Ctrl and PICA cows groups

圖6 腸道菌群UPGMA聚類樹和距離矩陣PcoA分析Fig.6 UPGMA cluster tree and distance matrix PCoA analysis of gut microbiota

圖7 Ctrl和PICA牛腸道中門水平和屬水平菌群差異Fig.7 The differential phyla and genera in gut microbiota between Ctrl and PICA cows

圖8 差異菌群與差異氨基酸Pearson相關(guān)性分析Fig.8 Pearson correlation analysis of differential genera and amino acids

牛血清中的游離氨基酸種類和含量不僅反映牛機體營養(yǎng)代謝狀況，也可反映某些疾病的發(fā)病機制[26-27]。Phe和Iso是動物的必需氨基酸，具有參與營養(yǎng)神經(jīng)遞質(zhì)和分泌激素作用[28]。目前，已有研究證明，機體中Phe過高能夠引起血清中的尿素氮濃度升高，同時，血清尿素氮濃度的增高意味著體內(nèi)氨基酸平衡狀況較差，影響機體的正常生理功能進而影響動物的日常行為[25]。Surez-Belloch等[29-30]的研究證明，Phe與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育也有著重要的關(guān)系，Phe過高會引起苯丙氨酸羥化酶的降低，從而導(dǎo)致苯丙氨酸代謝物的堆積，抑制其他氨基酸通過血腦屏障，減少腦組織神經(jīng)遞質(zhì)的合成，進而損傷神經(jīng)系統(tǒng)，引起動物異常行為。本研究中PICA組牛血液中Phe的含量顯著高于Ctrl組，提示血液中Phe的含量與肉牛異食行為有關(guān)。Iso是已知的支鏈氨基酸，異常濃度下能夠促進脂肪代謝[31]，異亮氨酸缺乏的飲食抑制了十二指腸、空腸和回腸中葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白表達[32]，而異亮氨酸對肌管葡萄糖攝取和肌糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT1和GLUT4)表達有促進作用[32-37]。然而，它發(fā)揮作用的潛在機制仍不清楚?？傮w而言，支鏈氨基酸通過胰島素依賴或非胰島素依賴的方式調(diào)節(jié)肌肉或腸道葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的表達，這些發(fā)現(xiàn)具有重要的意義[32]。本研究比較了PICA組和Ctrl組血液中Iso的含量，結(jié)果顯示，PICA組顯著高于Ctrl組，血液中Iso的含量可能還會與肉牛異食行為的產(chǎn)生相關(guān)。平衡的Iso和Phe能夠促進動物正常生長，血液中含量過高或過低都會影響機體對其他氨基酸的吸收利用[37]，影響動物營養(yǎng)代謝，這些血液游離氨基酸的差異性也會引起氨基酸代謝的不平衡，從而導(dǎo)致動物的某些營養(yǎng)缺乏，影響營養(yǎng)神經(jīng)遞質(zhì)和激素的分泌，進而產(chǎn)生PICA，這些問題尚需進一步研究。

最近研究表明，腸-腦軸促進了大腦和腸道之間聯(lián)系和交流，影響著動物的情緒和行為[38]。腸道菌群對中樞神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)起著調(diào)節(jié)和擾動的重要作用[17]。許多疾病的發(fā)生均與腸道菌群的改變有關(guān)，飼喂益生菌或糞菌移植的方法對腸道菌群的調(diào)節(jié)已被用于治療某些神經(jīng)疾病，包括自閉癥和抑郁癥以及相關(guān)的胃腸道疾病[39-45]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物群的改變與肥胖和2型糖尿病有關(guān)[46-48]，在飲食誘導(dǎo)肥胖的小鼠模型中，小鼠肥胖的發(fā)生與Tenericutes菌門豐度的改變呈正相關(guān)[49]。Oscillospira是梭狀芽胞桿菌中的一種厭氧細菌屬，廣泛存在于草食動物的胃腸道中。Gophna等[50]推斷出，Oscillospira的代謝能夠產(chǎn)生短鏈脂肪酸丁酸鹽，丁酸鹽又被認為是糖發(fā)酵的主要產(chǎn)物[51]，而且丁酸鹽能也夠促進腸道細胞的成熟和對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。有研究指出，Oscillospira的降低可能會使得動物機體對營養(yǎng)物質(zhì)的代謝吸收降低，從而影響機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[48-49]。此外，丁酸鹽對動物腸-腦軸的調(diào)節(jié)也具有一定作用[52]。在本研究中，PICA組肉牛腸道菌群中Oscillospira的相對豐度顯著低于Ctrl組，提示腸道菌群Oscillospira豐度的降低在影響機體對營養(yǎng)物質(zhì)吸收的同時還影響動物的神經(jīng)系統(tǒng)甚至影響動物的情緒和行為，CF231普遍存在于反芻動物胃腸道內(nèi)，參與瘤胃內(nèi)初級和次級膽汁酸合成進而影響腸道對飼料的消化吸收[51-55]，但關(guān)于CF231對牛腸-腦軸的影響未見研究，本研究中，PICA組肉牛腸道菌群中CF231的相對豐度顯著低于Ctrl組，pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，機體血液中Iso的含量與腸道菌群中CF231的豐度呈顯著負相關(guān)，Phe與Tenericutes呈顯著負相關(guān)。

4 結(jié) 論

本研究提示，安格斯肉牛異食行為的發(fā)生可能與血液中異亮氨酸和苯丙氨酸的改變以及腸道菌群中顫螺菌屬(Oscillospira)和CF231的變化有關(guān)，本研究為進一步探索動物腸道菌群-營養(yǎng)代謝和行為變化的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)，為通過調(diào)控腸道菌群防治PICA行為提供了線索。