王強龍，潘陽陽，閆翠霞，張同享，何翃閎，崔 燕，徐庚全，王立斌，樊江峰，余四九

(甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 甘肅省牛羊胚胎工程技術研究中心，蘭州 730070)

地西泮結合抑制因子(disazepam binding inhibitor，DBI)于1983從鼠的腦組織中分離純化得到，與中、長鏈脂酰輔酶A具有高親和力，在細胞內(nèi)負責?；o酶A(Acyl-CoA)的轉運和儲存，進而調(diào)節(jié)脂肪酸的合成與代謝，因此又稱為脂酰輔酶A結合蛋白(acyl-CoA binding protain,ACBP)[1-2]。研究表明，DBI在類固醇生成細胞中高度表達，可以通過與線粒體外膜上的受體(peripheral-type benzodia-zepine receptor, PBR) 結合促進膽固醇攝入線粒體并且轉化為孕烯醇酮，從而調(diào)節(jié)類固醇激素生物合成與代謝[3-4]。報道稱，ACBP是一種神經(jīng)肽，能夠抑制安定與γ-氨基丁酸結合的GABA受體[5]，在人體中，ACBP是?；o酶A結合結構域(acyl-CoA-binding domain-containing，ACBD)家族的6個成員之一[6]。DBI作為高度保守蛋白，表達于各種類型細胞，是一個具有管家基因性質(zhì)的因子[7]，能對膽固醇的合成、胰島素的分泌、脂肪酸的合成與代謝產(chǎn)生重要調(diào)節(jié)作用[8]。存在于真核生物和原核生物中，為細胞的生命活動提供重要的能源物質(zhì)，保障細胞的正常生長。

牦牛(Bosgrunniens)常年生活在3 000～6 000 m的高寒低氧高海拔地區(qū)[9]。長期適應惡劣環(huán)境，能夠充分利用高原牧區(qū)的物質(zhì)資源，為當?shù)啬撩裉峁┲匾纳畋Ｕ虾徒?jīng)濟來源。同時，牦牛屬季節(jié)性發(fā)情動物，7～10月份為發(fā)情季節(jié)[10]，長期生活在年平均氣溫0 ℃的環(huán)境中[11]。而且，較低的胚胎著床率和產(chǎn)犢率以及較高的流產(chǎn)率等問題均可導致牦牛的繁殖力低下[10,12]。因此，如何有效提高牦牛繁殖率成為焦點問題。研究發(fā)現(xiàn)，DBI在類固醇激素生成和妊娠維持中發(fā)揮重要生理作用，其在自然流產(chǎn)絨毛組織中表達量較正常妊娠低[13]。報道稱，DBI在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、垂體前葉、腎上腺皮質(zhì)、甲狀腺、肝、胸腺和睪丸中強烈表達[14]，但目前未見有關雌性牦牛生殖方面的報道。

本研究以母牦牛作為試驗動物，通過qPCR、Western blotting、IHC等技術檢測DBI在牦牛生殖器官的表達情況，確定其是否參與了牦牛的生殖過程。這些結果對進一步研究牦牛DBI基因在高原哺乳動物生殖生理中的生物學功能具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗樣品 在青海省西寧市定點屠宰場，選擇5頭健康牦牛，待勁動脈放血之后，快速采集不同時期(卵泡期、黃體期、妊娠期)的卵巢、輸卵管和子宮組織，置于加雙抗(青霉素、鏈霉素)的37 ℃生理鹽水中，經(jīng)過清洗，選擇組織，部分置于液氮罐中，部分用10%的福爾馬林溶液固定，帶回實驗室。

1.1.2 主要儀器、試劑 PCR儀(Eppendorf, 德國)、熒光定量PCR儀(Roche生物，上海)、動物組織RNA提取試劑盒、RIPA 裂解液(全式金，北京)；Go ScriptTMReverse Transcription System購自Promega,Taq PCR Master Mix、StarPrep Gel Extraction Kit 購自 GenStar,SYBR Premix Dimer EraserTM(2×)、Anti- DBI antibody(ab232760, abcam, 英國)；Goat Anti-rabbit IgG antibody (bs-0295G，博奧森，北京)；DAB顯色試劑盒(ZSGB-bio，ZILZ-9019)；SP試劑盒(Bioss，北京)、4×蛋白上樣Buffer、氯仿、異丙醇、甲醛、乙醇等其他試劑均為國產(chǎn)分析純生化試劑。

1.2 方法

1.2.1 組織總RNA的提取和cDNA的合成 按照TransZol 操作說明提取牦牛卵巢、輸卵管和子宮組織總RNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，采用分光光度計檢測RNA濃度，將OD260 nm/OD280 nm值控制在1.8～2.0；再參照兩步法反轉錄試劑盒說明反轉錄合成 cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設計與驗證 設計qPCR驗證引物DBI-F/R參考文獻[13]，引物由上海生工生物公司合成(表1)。以牦牛不同時期卵巢、輸卵管和子宮cDNA為模板進行引物驗證，體系為20 μL：cDNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL，Taq PCR mix 10 μL，F(xiàn)ree water 8 μL；PCR反應條件：95 ℃ 3 min；95 ℃30 s，52.5 ℃ 30 s，72 ℃ 16 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min， 4 ℃保存；反應結束后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測反應產(chǎn)物。

表1 DBI基因和內(nèi)參基因引物序列

1.2.3 qPCR檢測DBImRNA的相對表達量 qPCR 反應體系為20 μL：cDNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×Transtart Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，F(xiàn)ree water 8 μL。反應程序為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，52.5 ℃退火16 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；樣品重復4次。每個模板以β-actin為內(nèi)參作為對照。程序運行結束，保存循環(huán)閾值(Ct)，采用2-ΔΔCt方法進行相對表達量分析。

1.2.4 組織蛋白樣品的制備 將牦牛卵巢、輸卵管和子宮組織進行快速冷凍研磨，取110 mg組織樣加入蛋白裂解液，置于冰盒內(nèi)充分反應3 h，放入超速離心機，4 ℃12 000 r·min-1，離心操作10 min。 蛋白上樣緩沖液與蛋白上清液按1∶3混合，100 ℃金屬浴進行蛋白變性10 min，再冷卻5 min， 變性操作完成后，樣品置于-20 ℃保存待用。

1.2.5 Western blotting檢測牦牛DBI蛋白的表達 制備蛋白分離膠(15%)、濃縮膠(5%)，進行SDS-PAGE檢測，將電壓調(diào)至70 V待樣品到達濃縮膠與分離膠界面，再將電壓調(diào)至110 V直至完成，采用濕轉膜法100 mA恒流轉10 min (DBI) 或43 min (β-actin) 將蛋白轉印至PVDF膜上，用PBST洗去膜上殘留的轉膜液，5%的脫脂牛奶封閉，置于搖床室溫封閉3 h，用PBST清洗3次，每次5 min；加入DBI抗體(1∶3 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，再用PBST清洗5次，每次5 min，加入二抗Goat Anti-rabbit IgG(1∶5 000稀釋)，37 ℃搖床孵育50 min，完成之后用PBST洗滌6次，每次10 min。操作完成之后在PVDF膜上滴加電化學發(fā)光液，避光孵育2 min，使用化學發(fā)光儀進行檢測，根據(jù)成像結果，利用Image J灰度值分析DBI蛋白相對表達量。

1.2.6 IHC對牦牛DBI蛋白進行定位 將固定于福爾馬林溶液的卵巢、輸卵管和子宮樣品切成(0.5×0.5×0.5) cm3大小，置于錐形瓶內(nèi)，自來水沖洗24 h，上行梯度酒精脫水后，將組織用酒苯透明后浸蠟，最后進行包埋。使用切片機進行連續(xù)性切片，切片厚度設置為4 μm。切片干燥后，烘片機上60 ℃ 烘烤6 h， 再進行下行梯度酒精脫蠟水化，蒸餾水浸泡5 min，PBS浸泡10 min?？乖迯筒捎脵幟仕猁}緩沖液微波熱修復法(在0.01 mol·L-1的檸檬酸鹽中緩緩放入載玻片，微波爐內(nèi)煮沸，中火15 min)，自然冷卻至室溫。用PBS清洗3次，每次5 min。利用3% H2O2溶液(SP 試劑盒)在37 ℃ 溫箱內(nèi)阻斷 15 min，PBS清洗3次，每次5 min。在室溫條件下,將載玻片置于濕盒內(nèi)封閉液(SP試劑盒A液)封閉15 min，一抗(Anti- DBI antibody)1∶500 稀釋后，4 ℃ 孵育過夜，陰性對照滴加PBS。PBS清洗3次，每次5 min。滴加二抗(SP試劑盒 B 液)后置于37 ℃溫箱內(nèi)孵育 15 min，再用PBS清洗3次，每次5 min。滴加三抗(SP試劑盒 C液)37 ℃溫箱內(nèi)孵育15 min。PBS清洗3次，每次5 min。在DAB 顯色液(濃縮DAB溶液∶DAB底物液=1∶20)中進行顯色(20 s)，終止顯色，置于蘇木精復染90 s，鹽酸酒精分化2 s，最后自來水沖洗返藍 15 min， 梯度酒精脫水，滴加中性樹脂封片，拍照。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理與圖像分析 將試驗數(shù)據(jù)用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析和顯著性分析，數(shù)據(jù)用“平均值±標準誤”表示。P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 PCR驗證DBI短鏈引物

PCR擴增DBI產(chǎn)物大小為124 bp(圖1)，且條帶單一，符合預期，說明引物特異性良好，可用于后續(xù)qPCR檢測。

M.DNA相對分子質(zhì)量標準；1.卵巢；2.輸卵管；3.子宮M. 2 000 bp ladder; 1. Ovarian; 2. Fallopian tube; 3. Uterus圖1 DBI熒光定量引物驗證Fig.1 Verification of DBI fluorescent quantitative primers

2.2 qRT-PCR和Western blotting檢測卵巢中DBI的表達

qPCR數(shù)據(jù)顯示，DBImRNA在不同時期的卵巢組織中具有明顯的表達量差異(圖2A)。在妊娠期卵巢組織中表達量最高，黃體期次之，卵泡期最低。Western blotting結果分析表明，DBI蛋白在不同繁殖階段卵巢組織中均有表達(圖2B)，不同時期的卵巢組織中具有明顯的表達量差異(圖2C),妊娠期表達量最高，卵泡期和黃體期較低。

2.3 qRT-PCR和Western blotting檢測輸卵管中DBI的表達

qPCR數(shù)據(jù)顯示，DBImRNA在不同時期的輸卵管組織中具有明顯的表達量差異(圖 3A)。在黃體期輸卵管組織中表達量最高，卵泡期次之，妊娠期最低。Western blotting結果分析表明，DBI蛋白在不同繁殖階段輸卵管組織中均有表達(圖3B)，不同時期的輸卵管組織中具有明顯的表達量差異(圖3C)，黃體期輸卵管表達量最高，卵泡期次之，妊娠期表達量較低。

A. DBI mRNA在卵泡期、黃體期和妊娠期卵巢中的表達；B. DBI蛋白在卵泡期、黃體期和妊娠期卵巢中的表達檢測；C. DBI蛋白在卵泡期、黃體期和妊娠期卵巢中的表達。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05), 相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，下同A. The expression of DBI mRNA in ovary at follicular, luteal and gestation stages; B. Expression detection of DBI protein in ovary at follicular, luteal and gestation stages; C. The expression of DBI protein in ovary at follicular, luteal and gestation syages. Different lowercase letters mean significant difference (P<0.05), and the same letters mean on significant difference (P>0.05), the same as below圖2 DBI 在牦牛不同時期卵巢中的表達Fig.2 Expression of DBI in ovary of yaks at different stages

A. DBI mRNA在卵泡期、黃體期和妊娠期輸卵管中的表達；B. DBI蛋白在卵泡期、黃體期和妊娠期輸卵管中的表達檢測；C. DBI蛋白在卵泡期、黃體期和妊娠期輸卵管中的表達A. The expression of DBI mRNA in fallopian tube at follicular, luteal and gestation stages;B. Expression detection of DBI protein in fallopian tube at follicular, luteal and gestation stages;C. The expression of DBI protein in fallopian tube at follicular, luteal and gestation stages圖3 DBI在牦牛不同時期輸卵管中的表達Fig.3 Expression of DBI in fallopian tube of yaks at different stages

2.4 qRT-PCR和Western blotting檢測子宮中DBI的表達

qPCR數(shù)據(jù)顯示，DBImRNA在不同時期的子宮組織中具有明顯的表達量差異(圖4A)。在妊娠期子宮組織中表達量最高，黃體期次之，卵泡期最低。Western blotting結果分析表明，DBI蛋白在不同繁殖階段子宮組織中均有表達(圖4B)，不同時期的子宮組織中具有明顯的表達量差異(圖4C)，妊娠期子宮表達量最高，卵泡期和黃體期表達量較低。

2.5 免疫組織化學對牦牛DBI蛋白進行定位

通過IHC發(fā)現(xiàn)，DBI分子在卵巢中主要表達于卵巢生殖上皮、顆粒細胞、卵泡膜細胞和黃體細胞(圖5)；在輸卵管中主要表達于黏膜上皮細胞(圖6)；在子宮中表達于基質(zhì)細胞和子宮腺(圖7)。

A. DBI mRNA在卵泡期、黃體期和妊娠期子宮中的表達；B. DBI蛋白在卵泡期、黃體期和妊娠期子宮中的表達檢測；C. DBI蛋白在卵泡期、黃體期和妊娠期子宮中的表達A. The expression of DBI mRNA in uterus at follicular, luteal and gestation stages; B. Expression detection of DBI protein in uterus at follicular, luteal and gestation stages; C. The expression of DBI protein in uterus in follicular, luteal and gestation stages圖4 DBI在牦牛不同時期子宮中的表達Fig.4 Expression of DBI in uterus of yaks at different stages

A.卵泡期卵巢；B. 黃體期卵巢；C. 妊娠期卵巢； D.陰性對照。SG. 顆粒層； CL. 顆粒細胞A. Ovary at follicular stage; B.Ovary at luteal stage; C. Ovary at pregnant stage; D. Negative control. SG. Granular layer; CL. Granulosa cells圖5 DBI 蛋白在牦牛不同時期卵巢中的分布情況(大圖200×，小圖400×)Fig.5 Distribution of DBI protein in ovary of yaks at different stages(large figure 200×, small figure 400×)

A.卵泡期輸卵管；B. 黃體期輸卵管；C. 妊娠期輸卵管； D.陰性對照。EM. 黏膜上皮A. Fallopian tube at follicular stage; B.Fallopian tube at luteal phase; C. Fallopian tube at pregnant stage; D. Negative control. EM. Mucosal epithelium圖6 DBI 蛋白在牦牛不同時期輸卵管中的分布情況(大圖200×，小圖400×)Fig.6 Distribution of DBI protein in fallopian tubes of yaks at different stages(large figure 200×, small figure 400×)

A.卵泡期子宮；B. 黃體期子宮；C. 妊娠期子宮； D.陰性對照。UG. 子宮腺； SC. 基質(zhì)細胞A. Uterus at follicular phase; B. Uterus at luteal phase; C.Uterus at pregnant phase ; D. Negative control. UG. Uterus gland; SC. Stroma Cell圖7 DBI 蛋白在牦牛不同時期子宮中的分布情況(大圖200×，小圖400×)Fig.7 Distribution of DBI protein in uterus of yaks at different stages(large figure 200×, small figure 400×)

3 討 論

近年來，地西泮結合抑制因子(DBI)受到廣泛關注，在人[13]、檳榔江水牛[15]、大鼠、豬、青鳉魚[8]、非洲爪蟾和酵母等不同物種中均有研究。研究發(fā)現(xiàn)，DBI能夠參與調(diào)控滋養(yǎng)細胞的合體化進程，自然流產(chǎn)可能與胎盤中DBI表達量低具有內(nèi)在聯(lián)系，說明DBI的高表達在動物妊娠維持過程中具有重要作用[13]。DBI能夠與中、長鏈酰基輔酶A結合，參與磷脂、甘油酯、膽固醇的合成，以及類固醇激素的調(diào)節(jié)[16-17]。報道稱，敲低DBI表達，類固醇激素合成酶表達量下降，如CYP11A1、HSD3β1、CYP19A1等，類固醇激素的生成也受到限制[13]。在哺乳動物代謝活性高的組織中DBI的表達量更高，如肝、脂肪組織、皮膚和外分泌腺體等[18]。

卵巢是重要的生殖器官，能夠分泌生殖相關激素和排出卵子[19]。DBI在妊娠期卵巢中相對表達量最高，黃體期卵巢中相對表達量次之，卵泡期卵巢中的相對表達量最低，不同時期具有明顯差異(P<0.05)。但在黃體期DBI蛋白表達存在延遲現(xiàn)象，可能在該時期DBI的表達受到其他激素的調(diào)控，造成基因和蛋白表達量不一致的現(xiàn)象。IHC結果表明，DBI主要分布于卵巢生殖上皮、顆粒細胞、卵泡膜細胞和黃體細胞。研究表明，原始卵泡中兩個相鄰顆粒細胞之間是縫隙連接，次級卵泡中顆粒細胞和卵膜之間是橋粒連接[20]。顆粒細胞向卵母細胞提供營養(yǎng)物質(zhì)和能量，促進卵母細胞的發(fā)育[21]、成熟并維持卵母細胞的正常功能，因此顆粒細胞的狀態(tài)必然會影響卵母細胞及胚胎質(zhì)量，從而改變?nèi)焉锝Y局[22]。牦牛妊娠期間，孕激素含量升高，DBI可能受到孕激素反饋調(diào)節(jié)而表達量上升。DBI和細胞的脂質(zhì)代謝密切相關，妊娠后期母體需要更多的營養(yǎng)物質(zhì)以滿足能量需要[23]。由此推測，DBI因子與卵巢物質(zhì)代謝和孕激素合成相關。

輸卵管是配子運輸通道、受精和早期胚胎發(fā)育的場所[24-25]，其功能受到雌激素的調(diào)控[26]。輸卵管功能的失調(diào)會導致不孕、宮外孕、胚胎發(fā)育異?；虼菩詣游锷a(chǎn)能力下降等[27]。輸卵管的功能受到雌激素的影響，隨著雌激素的變化，可引起輸卵管黏膜在細胞及分子水平的改變，進而影響輸卵管的功能[28]。DBI在輸卵管不同繁殖時期存在明顯差異，其中黃體期輸卵管和卵泡期輸卵管中DBI的表達量明顯高于妊娠期。IHC結果表明，DBI的主要表達部位在輸卵管黏膜上皮。雌激素和孕激素可以調(diào)控輸卵管黏膜上皮細胞的生長、增殖，不同發(fā)情周期黏膜上皮細胞的數(shù)量和體積均不同[29]。雌激素的含量在生理范圍內(nèi)升高也可以促進輸卵管發(fā)育，加強節(jié)律性收縮的振幅，促進輸卵管運動，加速卵子在輸卵管中的運行速度，有利于縮短精子與卵子相遇的時間[30]。研究表明，卵泡期血液中雌激素含量高，孕激素含量低，此時輸卵管上皮細胞代謝活躍，分裂迅速，分泌細胞分泌能力增加；妊娠黃體形成后，血液中孕激素增多，而雌激素減少，導致輸卵管黏膜上皮細胞生長緩慢，纖毛變短，分泌細胞分泌能力下降[31-32]。DBI蛋白可能受雌激素含量的影響參與輸卵管上皮細胞的增殖。研究報道，輸卵管上皮細胞可支持胚胎的體外發(fā)育，且優(yōu)于其它類型的細胞[33]，為早期胚胎發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)，推測DBI可能與早期胚胎發(fā)育有關。

子宮是哺乳動物早期胚胎附植并發(fā)育的場所[34]，其結構與功能常常處于變化之中。早期胚胎的成功附植需要子宮和胚胎之間進行極其精密的分子與細胞之間的信息交流[35]，同時子宮內(nèi)膜具備接受胚胎的狀態(tài)[36-38]。學者認為，子宮的再生變化是由雌二醇引起，依靠孕酮來維持[39]。有研究表明，雌、孕激素的正常水平促進子宮內(nèi)膜容受性，有利于胚泡植入及胎盤形成、對母體正常的妊娠維持與胎兒的生長發(fā)育具有重要作用[13]。DBI 在妊娠期子宮高表達，推測其與孕激素合成，妊娠維持之間存在聯(lián)系。但是，DBImRNA在黃體期子宮顯著高于卵泡期 (P<0.05)，而DBI蛋白在黃體期和卵泡期子宮表達無明顯差異(P>0.05)，可能是由于DBImRNA在翻譯過程中受其它因素的調(diào)控，存在延遲表達的現(xiàn)象。IHC結果發(fā)現(xiàn)，DBI在子宮基質(zhì)細胞、子宮腺均有表達。研究發(fā)現(xiàn)，DBI可以影響滋養(yǎng)細胞的增殖能力，還能通過P450 scc影響滋養(yǎng)細胞合成類固醇激素基因的表達，且DBI低表達可能與自然流產(chǎn)有關[13]。這也進一步說明DBI在妊娠維持過程中具有十分重要的作用。由于雌激素與孕酮的協(xié)同作用[40]，子宮發(fā)育得相當充分，尤其到了妊娠的后期，雌激素和孕酮的分泌同時增加，對子宮組織持續(xù)發(fā)揮作用，促使子宮腺的發(fā)育，為胎兒生長發(fā)育做好充足的準備。DBI在妊娠期的高表達量進一步說明DBI參與妊娠后期子宮內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的調(diào)節(jié)，營養(yǎng)物質(zhì)的合成代謝，進而維持妊娠，防止發(fā)生流產(chǎn)。

4 結 論

本試驗研究了DBI基因在牦牛卵巢、輸卵管和子宮中的表達情況，但不同繁殖階段其表達水平存在顯著差異(P<0.05)，說明DBI在不同繁殖階段發(fā)揮重要生理作用。揭示DBI與牦牛卵泡早期發(fā)育、受精、早期胚胎附植以及妊娠維持存在密切聯(lián)系，但其發(fā)揮作用的具體機制有待進一步的探索。