萬 濤，王 澳，張海亮，胡麗蓉，趙善江，張翰霖，王 炎，郭 剛，俞 英，王雅春*

(1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193； 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193； 3. 北京首農(nóng)畜牧發(fā)展有限公司， 北京 100029)

抗繆勒氏管激素(anti-Müllerian hormone, AMH)是轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)超家族中的一種糖蛋白，分子量為140 ku[1]，半衰期為1.5 d[2]。奶牛的AMH特異性表達(dá)于健康卵泡的腔前卵泡和小的有腔卵泡的顆粒細(xì)胞中[3]，在奶牛的自然發(fā)情周期內(nèi)，AMH的表達(dá)在原始卵泡、初級卵泡和次級卵泡中達(dá)到高峰，當(dāng)優(yōu)勢卵泡被選擇后，AMH的表達(dá)開始降低，另外，閉鎖卵泡中不存在AMH的表達(dá)[4]。在卵泡發(fā)育過程中，AMH可以通過降低卵泡對促卵泡素(follicle-stimulating hormone, FSH)的敏感性而抑制FSH對卵泡生長的刺激作用[5]，調(diào)節(jié)卵泡的募集，避免過早耗盡卵泡儲(chǔ)備[6]。Ireland等[7]研究表明，牛血漿AMH濃度與有腔卵泡數(shù)目(antral follicle count, AFC)高度正相關(guān)。因此，血漿AMH濃度通?？勺鳛樵u估卵巢儲(chǔ)備能力的一種可靠標(biāo)志物[8]。

奶牛個(gè)體血漿AMH濃度在整個(gè)發(fā)情周期變化相對穩(wěn)定，獨(dú)立于卵泡發(fā)生波而存在，測定值有效期至少1年[4]。因此，使用奶牛發(fā)情周期內(nèi)任意一個(gè)時(shí)期的血漿AMH濃度測定值進(jìn)行表型分析均有一定參考價(jià)值[9]。部分研究表明，奶牛品種和胎次對血漿AMH濃度影響顯著，而泌乳天數(shù)、奶牛分群情況、體況評分、產(chǎn)后周數(shù)及采樣季節(jié)對血漿AMH濃度無顯著影響[10-11]。加拿大和美國荷斯坦牛群體血漿AMH濃度估計(jì)遺傳力分別為(0.46±0.31)[10]和(0.43±0.07)[12]，屬高遺傳力。有研究指出，高濃度AMH的牛妊娠率較高，低濃度AMH的牛在妊娠后30～65 d的妊娠損失發(fā)生率較高，這表明泌乳奶牛血漿AMH濃度與繁殖指標(biāo)呈正相關(guān)關(guān)系[11]。所以通過對奶牛群體中高濃度AMH個(gè)體的選擇，可能能夠提高奶牛群體的繁殖性能。

國內(nèi)尚未見對奶牛群體血漿AMH濃度遺傳規(guī)律的相關(guān)研究。因此，本研究利用奶牛血漿AMH濃度的測定數(shù)據(jù)，探究中國荷斯坦牛群體中血漿AMH濃度的影響因素，并估計(jì)該牛群血漿AMH濃度的遺傳參數(shù)，為后續(xù)奶牛群體血漿AMH濃度遺傳規(guī)律研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

試驗(yàn)群體來自北京地區(qū)某規(guī)?；觯?98頭中國荷斯坦泌乳牛。所有試驗(yàn)牛按照奶牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)[13]進(jìn)行散欄飼喂，根據(jù)自然發(fā)情周期進(jìn)行人工授精。奶牛生產(chǎn)性能測定(dairy herd improvement, DHI)數(shù)據(jù)來自北京奶牛生產(chǎn)性能測定中心，包括試驗(yàn)牛胎次、產(chǎn)犢日期、父號、母號，妊娠天數(shù)記錄來自牛場管理軟件。本研究中，試驗(yàn)牛的系譜來自中國奶業(yè)協(xié)會(huì)，用于遺傳分析的最終系譜共包含915頭牛，其中母牛787頭，公牛128頭。

1.2 血漿AMH濃度測定方法

使用一次性采血針和抗凝真空采血管分別于2019年7月24日(夏季)、2019年11月9日(秋季)和2020年1月5日(冬季)采集試驗(yàn)牛尾靜脈血樣10 mL共625份，其中夏季血樣219份，秋季血樣184份，冬季血樣222份。每頭牛平均采集1.5次血樣，最多采集3次血樣，最少采集1次血樣。

血液采集完后，經(jīng)離心(3 000 r·min-115 min)獲得上層血漿。將獲得的血漿送至北京萊博泰瑞科技發(fā)展有限公司(北京)，采用ELISA酶免法測定血漿AMH濃度。

1.3 數(shù)據(jù)整理

在建立模型進(jìn)行數(shù)據(jù)分析時(shí)，將泌乳天數(shù)劃分為3個(gè)泌乳階段，分別為泌乳早期(≤ 100 d)、泌乳中期(101～200 d)和泌乳后期(≥ 201 d)[14]。

將妊娠天數(shù)劃分為3個(gè)妊娠階段，分別為妊娠前期(≤ 120 d)、妊娠中期(121～210 d)和妊娠后期(≥ 211 d)[15]。由于妊娠后期觀察數(shù)過少，將其與妊娠中期進(jìn)行合并。并將奶牛未妊娠階段(記為0 d) 歸為一組。

由于血漿AMH濃度數(shù)據(jù)正態(tài)性檢驗(yàn)的概率值小于0.05，不服從正態(tài)分布，因此對數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換以近似滿足正態(tài)分布，轉(zhuǎn)換公式如下：

Y=lnX

式中，Y為轉(zhuǎn)化后奶牛血漿AMH濃度的觀測值，X為原始奶牛血漿AMH濃度的觀測值。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

1.4.1 血漿AMH濃度影響因素分析 使用SAS 9.2軟件MIXED過程對血漿AMH濃度的影響因素進(jìn)行分析，多重比較采用Bonferronit檢驗(yàn)，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

Yijklmn=μ+Seasoni+Parityj+PDk+DIMl+Cowm+eijklmn(模型1)

1.4.2 血漿AMH濃度遺傳分析 基于DMU軟件的DMUAI，采用單性狀動(dòng)物模型對AMH濃度進(jìn)行遺傳分析，估計(jì)AMH濃度的遺傳參數(shù)，遺傳分析模型如模型2所示。

Y=Season+PE+A+E(模型2)

1.4.3 血漿AMH濃度與繁殖性狀的近似遺傳相關(guān) 基于模型2估計(jì)獲得奶牛血漿AMH濃度性狀估計(jì)育種值，并匹配相同群體中繁殖性狀的估計(jì)育種值及其可靠性，根據(jù)以下公式計(jì)算奶牛血漿AMH濃度與繁殖性狀之間的近似遺傳相關(guān)及其標(biāo)準(zhǔn)誤。本研究涉及的繁殖性狀包括初產(chǎn)日齡(age at the first calving, AFC)、初配日齡(age at the first service, AFS)、經(jīng)產(chǎn)牛產(chǎn)犢難易性(calving ease in cow, CE_C)、青年牛產(chǎn)犢難易性(calving ease in heifer, CE_H)、產(chǎn)犢后首次配種間隔(interval from calving to the first service, ICF)、經(jīng)產(chǎn)牛首末配種間隔(interval from the first to the last inseminations in cow, IFL_C)、青年牛首末配種間隔(interval from the first to the last inseminations in heifer, IFL_H)、經(jīng)產(chǎn)牛死產(chǎn)率(stillbirth in cow, SB_C)和青年牛死產(chǎn)率(stillbirth in heifer, SB_H)等，上述性狀的遺傳評估模型和性狀定義細(xì)節(jié)參照陳紫薇等[18]和Liu等[19]的研究。

其中，PEV為估計(jì)育種值的標(biāo)準(zhǔn)誤，rgi,j表示性狀i和性狀j之間的近似遺傳相關(guān)，RLi和RLj分別為性狀i和性狀j的估計(jì)育種值可靠性，ri,j為性狀i和性狀j估計(jì)育種值之間的皮爾遜相關(guān)系數(shù)，n為用于計(jì)算近似遺傳相關(guān)的個(gè)體數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 血漿AMH濃度描述性統(tǒng)計(jì)

本研究中，625頭荷斯坦牛的血漿AMH濃度呈右偏態(tài)分布，如圖1所示，AMH濃度平均值為(96.30±14.25) ng·L-1，最大值為178.39 ng·L-1，最小值為57.06 ng·L-1，中位數(shù)為94.16 ng·L-1。

2.2 血漿AMH濃度影響因素分析

利用模型1分析各因素對奶牛血漿AMH濃度的影響，結(jié)果如圖2所示。采樣季節(jié)對血漿AMH濃度有極顯著影響(P<0.01)，其中夏季血漿AMH濃度顯著高于秋季和冬季，秋季血漿AMH濃度顯著高于冬季。胎次(P=0.45)、妊娠天數(shù)分組(P=0.52)以及泌乳天數(shù)分組(P=0.56)對血漿AMH濃度均無顯著影響。

圖1 荷斯坦牛血漿AMH濃度分布Fig.1 The distribution of plasma AMH concentration in Holstein cows

2.3 血漿AMH濃度的遺傳參數(shù)估計(jì)

利用模型2估計(jì)荷斯坦牛血漿AMH濃度的方差組分，由表1可知，本研究荷斯坦牛群體血漿AMH濃度的遺傳力估計(jì)值為(0.10±0.08)，屬于中等遺傳力[16](0.1

本研究中，荷斯坦牛血漿AMH濃度與部分繁殖性狀的近似遺傳相關(guān)如圖3所示。由圖3可知，奶牛血漿AMH濃度與產(chǎn)犢后首次配種間隔、經(jīng)產(chǎn)牛首末配種間隔、青年牛首末配種間隔、經(jīng)產(chǎn)牛死產(chǎn)率和青年牛死產(chǎn)率呈中高遺傳相關(guān)；奶牛血漿AMH濃度與青年牛首末配種間隔近似遺傳相關(guān)最高，為(0.61±0.04)；奶牛血漿AMH濃度與青年牛產(chǎn)犢難易性近似遺傳相關(guān)最低，為(-0.05±0.05)。

3 討 論

3.1 奶牛血漿AMH濃度

本研究結(jié)果顯示，荷斯坦牛血漿AMH濃度為96.30 ng·L-1，與其他同類研究的結(jié)果((320.3±251.1)ng·L-1[11]，(438.50±604.33) ng·L-1[12])相比差異較大。值得注意的是，上述報(bào)道的奶牛血漿AMH濃度的標(biāo)準(zhǔn)差與變異系數(shù)較大[11-12]，本研究所測定的血漿AMH濃度平均值處于上述研究的變異范圍內(nèi)。Ribeiro等[11]研究表明，荷斯坦牛群體(264 ng·L-1)與荷斯坦牛和娟珊牛的雜交品種群體(298 ng·L-1)的血漿AMH濃度差異顯著，Batista等[23]的研究中，瘤牛(內(nèi)洛爾牛，930 ng·L-1)與普通牛(荷斯坦牛，300 ng·L-1)間血漿AMH濃度差異更大，推測有可能是由于不同群體的遺傳基礎(chǔ)及養(yǎng)殖環(huán)境不同，造成中國荷斯坦牛群體與國外荷斯坦牛群體的血漿AMH濃度存在差異，可進(jìn)一步擴(kuò)大數(shù)據(jù)量進(jìn)行試驗(yàn)，以研究奶牛血漿AMH濃度與群體遺傳基礎(chǔ)的關(guān)系。

3.2 奶牛血漿AMH濃度的影響因素

本研究結(jié)果顯示，奶牛群體血漿AMH夏季采樣濃度最高，而在冬季濃度最低，這與Gobikrush-anth等[10]報(bào)道的采樣季節(jié)對血漿AMH濃度無顯著影響的結(jié)果不同，可能是由于Gobikrushanth等[10]研究中的牛場處于加拿大西部地區(qū)，夏季和冬季氣溫均低于北京地區(qū)，北京地區(qū)奶牛受熱應(yīng)激影響較大，并且兩牛場牛舍管理不同，從而導(dǎo)致血漿AMH濃度差異較大。由于試驗(yàn)條件限制，本研究中荷斯坦牛胎次僅有1胎和2胎，兩者的血漿AMH濃度無明顯差異。部分研究[10-11]表明，奶牛胎次的二次方對血漿AMH濃度影響顯著，其中奶牛2胎時(shí)血漿AMH濃度達(dá)到最高，1胎時(shí)血漿AMH濃度最低。因此，為了進(jìn)一步分析胎次對中國荷斯坦牛血漿AMH濃度的影響，還需擴(kuò)大數(shù)據(jù)量與試驗(yàn)群體的覆蓋范圍。

柱狀圖上方字母相異表示差異顯著(P<0.05),含相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)The different letters above the bar chart indicate significant differences(P<0.05), and same letter or no letter indicate no significant difference(P>0.05)圖2 荷斯坦牛血漿AMH濃度的影響因素Fig.2 The influencing factors of plasma AMH concentration in Holstein cows

表1 荷斯坦牛血漿AMH濃度遺傳參數(shù)估計(jì)

3.3 血漿AMH濃度遺傳分析

本研究通過遺傳分析發(fā)現(xiàn)，中國荷斯坦牛血漿AMH濃度遺傳力為(0.10±0.08)，低于國外的一些研究報(bào)道(0.46±0.31[10]，0.43±0.07[12])，這可能是由于不同群體的遺傳基礎(chǔ)不同和本研究的試驗(yàn)群體規(guī)模較小導(dǎo)致。此外，Gobikrushanth等[10]研究中所采集的樣本是來自產(chǎn)后7 d左右的泌乳奶牛，Nawaz等[12]研究中所采集的樣本是來自青年牛，而本研究的奶牛群體全部為泌乳期的奶牛，各研究中不同的測定時(shí)期也導(dǎo)致AMH濃度的遺傳基礎(chǔ)存在差異。值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)血漿AMH濃度與部分繁殖性狀(產(chǎn)犢后首次配種間隔、經(jīng)產(chǎn)牛首末配種間隔、青年牛首末配種間隔、經(jīng)產(chǎn)牛死產(chǎn)率和青年牛死產(chǎn)率等)的近似遺傳相關(guān)系數(shù)在0.3～0.7之間，AMH濃度與繁殖性狀存在較強(qiáng)的遺傳相關(guān)。有研究指出血漿AMH濃度可以作為一種標(biāo)志物評估奶牛卵巢儲(chǔ)備能力[8]；薛建華等[24]研究發(fā)現(xiàn)，奶牛血漿AMH濃度與超排獲得胚胎總數(shù)呈高度相關(guān)，上述研究均表明血漿AMH濃度具有預(yù)測奶牛繁殖性能的潛力。此外，有研究指出，高濃度血漿AMH的奶牛群體妊娠率相對于低濃度血漿AMH的奶牛群體更高[10-11]。綜上，血漿AMH濃度與奶牛的繁殖性能之間存在密切的關(guān)聯(lián)，兩者之間的詳細(xì)關(guān)系還有待進(jìn)一步深入研究。

AFC. 首次產(chǎn)犢日齡；AFS. 首次配種日齡；CE_C. 經(jīng)產(chǎn)牛產(chǎn)犢難易性；CE_H. 青年牛產(chǎn)犢難易性；ICF, 產(chǎn)犢后首次配種間隔；IFL_C. 經(jīng)產(chǎn)牛首末配種間隔；IFL_H. 青年牛首末配種間隔；SB_C. 經(jīng)產(chǎn)牛死產(chǎn)率；SB_H，青年牛死產(chǎn)率AFC. Age at the first calving; AFS. Age at the first service; CE_C. Calving ease in cow; CE_H. Calving ease in heifer; ICF. Interval from calving to the first service; IFL_C. Interval from the first to the last inseminations in cow; IFL_H. Interval from the first to the last inseminations in heifer; SB_C. Stillbirth in cow; SB_H. Stillbirth in heifer圖3 荷斯坦牛血漿AMH濃度與繁殖性狀的近似遺傳相關(guān)Fig.3 The approximate genetic correlations between plasma AMH concentration and reproductive traits in Holstein cows

4 結(jié) 論

本研究對北京地區(qū)荷斯坦泌乳牛血漿抗繆勒氏管激素(anti-Müllerian hormone, AMH)濃度進(jìn)行了測定和影響因素分析，并初步估計(jì)了AMH濃度的遺傳參數(shù)。發(fā)現(xiàn)采樣季節(jié)對血漿AMH濃度存在極顯著影響，血漿AMH濃度屬于中等遺傳力性狀，遺傳力為(0.10±0.08)，血漿AMH濃度與部分繁殖性狀(產(chǎn)犢后首次配種間隔、經(jīng)產(chǎn)牛首末配種間隔、青年牛首末配種間隔、經(jīng)產(chǎn)牛死產(chǎn)率和青年牛死產(chǎn)率)存在中高遺傳相關(guān)，遺傳相關(guān)系數(shù)介于0.3～0.7。本研究為深入探究血漿AMH的遺傳基礎(chǔ)及其與繁殖性狀的關(guān)系提供了有價(jià)值的信息，為奶牛繁殖性能的選育提供了新的思路。

致謝感謝中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院學(xué)生楊明路、竹磊、安濤和陳少侃等在數(shù)據(jù)采集環(huán)節(jié)對本試驗(yàn)提供的幫助！