楊沛方，陳 祥*，周志楠，唐 文，張 艷，惠茂茂

(1. 貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025； 2.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025)

N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, NAC)是左旋精氨酸的天然衍生物，作為一種常見(jiàn)的小分子抗氧化劑，NAC易進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體進(jìn)行細(xì)胞代謝，可在體內(nèi)脫去乙?；砂腚装彼?，最終合成谷胱甘肽，是機(jī)體生理代謝的重要物質(zhì)。作為細(xì)胞內(nèi)重要的保護(hù)劑，在降低機(jī)體細(xì)胞活性氧[1]，抑制細(xì)胞自噬，維持細(xì)胞功能和細(xì)胞形態(tài)[2]等方面發(fā)揮重要作用。

Luo等[3]通過(guò)在日糧中添加0.07%NAC，發(fā)現(xiàn)對(duì)山羊妊娠初期胚胎的存活產(chǎn)生了有益的影響；楊震國(guó)等[4]研究發(fā)現(xiàn)，飼喂含NAC的日糧可緩解仔豬由LPS導(dǎo)致的免疫應(yīng)激和能量的過(guò)度損耗，從而達(dá)到促生長(zhǎng)的目的。同時(shí)，NAC可以減少白細(xì)胞在炎癥組織中的浸潤(rùn)，改善炎癥的病理特征，延緩體內(nèi)形成的炎癥信號(hào)[5]，對(duì)提高羅非魚(yú)的抗氧化能力、免疫能力和生長(zhǎng)性能有顯著的作用[6]。細(xì)胞層面的研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)豬卵巢顆粒細(xì)胞時(shí)添加100 μmol·L-1NAC，對(duì)其前期貼壁生長(zhǎng)以及細(xì)胞增殖活力都有所提升[7]；同時(shí)，NAC在減弱毒素物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的損害[8]、增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫能力[9-10]以及抗氧化和抗纖維化[11]、改善抗?fàn)I養(yǎng)因子對(duì)機(jī)體的不良影響[12]等方面也有不同程度的研究?？梢?jiàn)，NAC在動(dòng)物的繁殖、生長(zhǎng)、免疫等方面都具有重要作用，具有較大的研究?jī)r(jià)值和前景。

本研究以山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(goat endometrial stromal cells, gESCs)為研究對(duì)象，在體外培養(yǎng)條件下給予不同濃度的NAC刺激，從細(xì)胞增殖、細(xì)胞ROS變化以及功能基因轉(zhuǎn)錄水平的變化方面探究NAC添加對(duì)gESCs的影響，篩選、優(yōu)化適宜gESCs體外研究的培養(yǎng)體系，為研究NAC影響山羊繁殖機(jī)能的相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品的處理

試驗(yàn)動(dòng)物來(lái)自貴陽(yáng)市山羊屠宰場(chǎng)，選取體況良好、無(wú)疾病的貴州黑山羊母羊，屠宰時(shí)嚴(yán)格按照貴州地方標(biāo)準(zhǔn)《羊屠宰操作規(guī)程》(DB22/T 2740-2017)進(jìn)行，母羊屠宰后立即將其子宮組織用滅菌鋁制剪刀剝離，并先后使用75%消毒酒精、生理鹽水、無(wú)菌PBS(1×)反復(fù)沖洗3遍以簡(jiǎn)單去除細(xì)菌，處理后將其置于預(yù)冷的無(wú)菌PBS(1×)中保存，并于1 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)胞原代分離、培養(yǎng)。

1.2 主要儀器與試劑

細(xì)胞培養(yǎng)箱(SERIES Ⅱ WATER JACKET)、酶標(biāo)儀(PMT 49984)、正置熒光顯微鏡(RH-107C)、超微量紫外分光光度計(jì)(Mano Drop 2000, 美國(guó))購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。細(xì)胞爬片、DMEM/F-12細(xì)胞培養(yǎng)基、CCK-8試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、活性氧檢測(cè)試劑盒(Reactive oxygen species assay kit)、N-乙酰半胱氨酸粉末、Ⅳ型膠原酶、TRIzol?Reagent試劑、DAPI試劑購(gòu)自西寶生物科技有限公司(貴州)；波形蛋白抗體購(gòu)自博奧森生物技術(shù)有限公司(北京)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 山羊原代子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng) 將采集來(lái)的母羊子宮組織置于紫外消殺后的超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行分離。首先，將子宮組織沿著中線剖開(kāi)，用剪刀剔除附著的脂肪組織后，再用無(wú)菌PBS液漂洗多次，至組織樣表面泛白，將其轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，用剪刀剪碎成糜爛狀后轉(zhuǎn)移至50 mL滅菌離心管內(nèi)加入適量Ⅳ型膠原酶進(jìn)行37 ℃、3 h封口消化，每20 min輕微搖晃1次，將消化后的懸液體進(jìn)行200目的細(xì)胞篩過(guò)濾，收集的濾液于1 500 r·min-1離心10 min，除去上清，再加入10 mL細(xì)胞完全培養(yǎng)基進(jìn)行600 r·min-1離心5 min，取上清8 mL于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞初次貼壁時(shí)進(jìn)行換液，之后每2 d對(duì)細(xì)胞進(jìn)行1次換液。待山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)匯合至95%左右時(shí)，胰酶消化進(jìn)行細(xì)胞的傳代培養(yǎng)試驗(yàn)。

1.2.2 山羊原代子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的鑒定 采用間接免疫熒光法對(duì)山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定，參考文獻(xiàn)[13]。依據(jù)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞表面的波形蛋白受體，用相應(yīng)抗體對(duì)其進(jìn)行間接染色。將原代細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后分別置于2個(gè)細(xì)胞鑒定培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，待其匯合至培養(yǎng)皿的70%時(shí)，棄去培養(yǎng)基并用PBS(1×)進(jìn)行洗滌、4%多聚甲醛固定1.5 h、5% BSA封閉、加入波形蛋白抗體過(guò)夜孵育(16 ℃)，孵育后回收一抗，依次加入二抗、SABC-Cy3、DAPI進(jìn)行孵育，孵育后用PBS(1×)反復(fù)洗滌細(xì)胞，在避光條件下用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。

1.2.3 NAC濃度梯度的添加及配置 精確稱取0.163 2 g N-乙酰半胱氨酸粉末于100 mL容量瓶中，用DMEM/F-12細(xì)胞完全培養(yǎng)基逐步定容至100 mL， 即得到濃度為10 mmol·L-1的NAC細(xì)胞培養(yǎng)基，再用10 mmol·L-1的培養(yǎng)基依次稀釋成100、200、400 μmol·L-1的梯度NAC培養(yǎng)基，4 ℃避光保存?zhèn)溆?。分別用NAC濃度梯度培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物的設(shè)計(jì)與合成 用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)細(xì)胞周期及增殖相關(guān)基因CyclinA1(登錄號(hào)：XM_0180 56659.1)、CyclinD2(登錄號(hào)：XM_005680985.3)、CyclinE(登錄號(hào)：XM_018062248.1)、PCNA(登錄號(hào)：XM_005688167.3)以及山羊繁殖性狀相關(guān)基因TGF-β1(登錄號(hào)：NM_001314142.1)、TGF-β3(登錄號(hào)：XM_005686141.3)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物并交由生工生物工程技術(shù)(上海)股份有限公司合成引物，其中β-actin為內(nèi)參基因，引物序列詳見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量引物詳情

1.2.5 山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞總RNA提取及cDNA合成 按照TRIzol?Reagent試劑說(shuō)明書(shū)提取不同濃度NAC培養(yǎng)24 h后的山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞總RNA，使用超微量分光光度測(cè)定儀測(cè)定組織總RNA濃度和純度，觀察光密度比值(D260 nm/D280 nm)以及圖像是否合理，將峰圖單一、曲線平滑、D260 nm/D280 nm比值在1.8～2.0區(qū)間內(nèi)的組織總RNA于-80 ℃冰箱中保存，用于后續(xù)逆轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)。

1.2.6 cDNA第一鏈的合成 采用GenStar的StarScript Ⅱ First-strand cDNA試劑盒將提取的組織總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。逆轉(zhuǎn)錄體系為20 μL，其中包括RNA模板1 μL、50 μmol·L-1、Oligo (dT) Primer 1 μL、DEPC-ddH2O 7 μL、2× Reaction mix 10 μL、StarScript Ⅱ RT mix 1 μL。PCR反應(yīng)條件為42 ℃孵育30～50 min，85 ℃孵育5 min， 產(chǎn)物標(biāo)記后于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定相關(guān)因子的表達(dá)水平 逆轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，以cDNA第一鏈為模板結(jié)合相關(guān)引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)預(yù)混液體系為20 μL，其中上、下游引物(10 μmoL·L-1)各0.6 μL，cDNA模板1 μL，2× RealStar Green Fast Mixture 10 μL，ddH2O補(bǔ)充至20 μL，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 2 min、在40個(gè)循環(huán)下進(jìn)行95 ℃ 15 s、退火(各基因最佳退火溫度見(jiàn)表1)30 s、72 ℃ 30 s，之后添加機(jī)器自帶的熔解曲線分析以獲取擴(kuò)增曲線和熔解曲線。反應(yīng)設(shè)置3個(gè)生物性與技術(shù)性重復(fù)并設(shè)置不加cDNA模板的陰性對(duì)照。反應(yīng)結(jié)束后使用2-ΔΔCt使用計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.8 CCK-8法測(cè)定NAC對(duì)細(xì)胞增殖活力的影響 利用CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒對(duì)不同濃度梯度NAC培養(yǎng)的山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞在不同時(shí)間段進(jìn)行增殖檢測(cè)。將山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞接種在96孔板內(nèi)，5×103個(gè)·孔-1，每孔重復(fù)6次，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h，吸除原有培養(yǎng)基，更換100、200、400 μmol·L-1NAC培養(yǎng)基分別培養(yǎng)12、24、48、72 h，每孔加入10 μL的CCK-8，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3 h后分別測(cè)定進(jìn)行450 nm處的吸光值。

1.2.9 NAC對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧含量變化的影響 用無(wú)菌1×PBS緩沖液按照1∶1 000比例將DCFH-DA探針原液進(jìn)行稀釋備用，待NAC刺激細(xì)胞24 h后用PBS洗滌細(xì)胞2～3次，避光條件下加入稀釋好的DCFH-DA探針，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育20 min，洗去未進(jìn)入細(xì)胞的探針，放置在熒光顯微鏡下觀察并拍照，采用Image J對(duì)圖片熒光平均強(qiáng)度進(jìn)行計(jì)算分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”，使用SPSS19.0軟件包進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)與多重比較分析。兩組之間比較使用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，分別以P<0.01、P<0.05為差異極顯著或顯著。

2 結(jié) 果

2.1 山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的鑒定

間接免疫熒光鑒定山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞結(jié)果如圖1所示，波形蛋白(Vimentin)抗體與細(xì)胞質(zhì)發(fā)生特異性結(jié)合，Vimentin特異性受體標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞呈紅色(圖1A)，所有細(xì)胞核在DAPI的染色下呈藍(lán)色(圖1B)，且A和B能完全重合(圖1C)，表明分離得到的山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞純度為100%。

A.Vimentin特異性受體標(biāo)的記陽(yáng)性細(xì)胞；B. DAPI核染；C. Merge圖A. Vimentin specific receptor labeled positive cells; B. DAPI nuclear staining; C. Merge diagram圖1 山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的鑒定Fig.1 Identification of gESCs

2.2 NAC對(duì)山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果顯示：不同濃度NAC添加對(duì)山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)有不同程度的促增殖作用，其中以200 μmol·L-1的NAC濃度促增殖作用最為顯著，見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度NAC對(duì)山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增殖的影響Fig.2 The effect of different concentrations of NAC on the proliferation of gESCs

2.3 NAC對(duì)山羊ESCs內(nèi)ROS含量變化的影響

利用DCFH-DA熒光探針活性氧檢測(cè)試劑盒對(duì)NAC刺激培養(yǎng)24 h后的山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行活性氧的測(cè)定，結(jié)果如圖3所示，熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)：200 μmol·L-1NAC組的活性氧熒光強(qiáng)度與空白組存在明顯差異，通過(guò)Image J軟件分析計(jì)算兩組間的平均熒光強(qiáng)度Mean值及標(biāo)準(zhǔn)差所知，NAC刺激后的細(xì)胞熒光強(qiáng)度極顯著低于空白對(duì)照組的細(xì)胞熒光強(qiáng)度(P<0.01，圖4)，推測(cè)添加NAC能夠降低細(xì)胞活性氧的含量，從而延緩細(xì)胞衰老。

2.4 NAC對(duì)山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞Cyclin A1、Cyclin D2、CyclinE、PCNA表達(dá)的影響

PCR法對(duì)相應(yīng)的熒光引物進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證，結(jié)果如圖5：擴(kuò)增的條帶均與預(yù)測(cè)片段大小一致，證明各基因熒光定量引物特異性良好，可用于下一步熒光定量試驗(yàn)。

A1、A2、A3和B1、B2、B3分別表示空白組和200 μmol·L-1組的3個(gè)重復(fù)A1, A2, A3 and B1, B2, B3 represent three replicates of the blank group and 200 μmol·L-1 group, respectively圖3 顯微鏡下觀察山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞ROS變化Fig.3 Observation of ROS changes in gESCs under microscope

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果如圖所示：200 μmol·L-1NAC添加培養(yǎng)的山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞能夠極顯著提高細(xì)胞周期相關(guān)因子CyclinA1(圖6A)和CyclinE(圖6C)基因的表達(dá)(P<0.01)，并極顯著降低CyclinD2(圖6B)基因的表達(dá)(P<0.01)；同時(shí)極顯著提高了增殖相關(guān)因子PCNA(圖6D)的mRNA表達(dá)水平(P<0.01)。

2.5 NAC對(duì)山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞TGF-β1、TGF-β3基因mRNA表達(dá)的影響

PCR法對(duì)相應(yīng)的熒光引物進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證，結(jié)果如圖7：擴(kuò)增的條帶均與預(yù)測(cè)片段大小一致，證明各基因熒光定量引物特異性良好，可用于下一步熒光定量試驗(yàn)。

由圖8可知，200 μmol·L-1的NAC添加較空白組極顯著降低了山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中TGF-β1基因的表達(dá)(P<0.01)；顯著降低了TGF-β3基因的mRNA表達(dá)(P<0.05)。

3 討 論

子宮作為雌性動(dòng)物孕育新生命的場(chǎng)所，在物種繁衍中具有重要的功能[14]。其分子調(diào)控是影響母體妊娠早期功能性胚泡附植、發(fā)育及體內(nèi)胎兒正常生長(zhǎng)的重要因素，當(dāng)出現(xiàn)異常的調(diào)控或受到外界不良因素的刺激時(shí)，會(huì)造成胎兒發(fā)育不良、發(fā)育遲緩、流產(chǎn)等諸多問(wèn)題，因此，對(duì)子宮的分子調(diào)控機(jī)制研究必不可少[15]。子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞是子宮固有膜上一類星形的細(xì)胞，在對(duì)母體子宮內(nèi)進(jìn)行胚胎附植以及正常妊娠等生理過(guò)程都發(fā)揮了積極的作用[16]。本研究通過(guò)間接免疫熒光技術(shù)證實(shí)山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)成功，為進(jìn)一步探究其功能奠定基礎(chǔ)。NAC作為一類抗氧化的物質(zhì)，可通過(guò)促進(jìn)還原型谷胱甘肽(GSH)生物合成，清除ROS而達(dá)到抗氧化、抗炎癥的功能[17]。研究發(fā)現(xiàn)，NAC對(duì) PM2.5介導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞的凋亡和自噬有明顯的抑制作用，從而減少細(xì)胞的損傷，證明了NAC在細(xì)胞層面積極的作用[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的NAC對(duì)山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖均具有促進(jìn)作用，這證實(shí)了NAC在細(xì)胞層面的積極作用。

圖4 山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)度變化Fig.4 Changes in ROS fluorescence intensity of gESCs

M表示DL2000 marker,1～3表示PCR產(chǎn)物大小M means DL2000 marker, 1-3 means PCR product size圖5 NAC對(duì)山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞Cyclin A1(A)、Cyclin D2(B)、CyclinE(C)、PCNA(D)表達(dá)的影響Fig.5 Effect of NAC on the expression of Cyclin A1(A),Cyclin D2(B),CyclinE(C),PCNA(D) genes in gESCs

為進(jìn)一步探究NAC對(duì)山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的影響機(jī)制，本研究發(fā)現(xiàn)，NAC刺激細(xì)胞后，促進(jìn)了細(xì)胞中PCNA、CyclinA1、CyclinE基因的表達(dá)，抑制了CyclinD2基因的表達(dá)，細(xì)胞核抗原PCNA作為細(xì)胞增殖標(biāo)記物，對(duì)細(xì)胞的增殖水平起正向調(diào)控[19]；而CyclinA1、CyclinE、CyclinD2均為細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞周期蛋白因子，對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)行為具有重要調(diào)控作用[20]，而NAC刺激能改變這些因子的表達(dá),提示NAC可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞因子的表達(dá)水平來(lái)調(diào)控細(xì)胞的增殖。此外，本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)NAC可以降低細(xì)胞中的活性氧濃度，從而達(dá)到延緩細(xì)胞衰老的作用，同時(shí)驗(yàn)證了本研究中NAC促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，活性氧在機(jī)體內(nèi)承擔(dān)著第二信使的功能，在體內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)和內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)控下，ROS與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)引起多種生理變化，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)外氧化還原平衡相關(guān)的基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞功能[21]。有研究表明，NAC可減輕LPS誘導(dǎo)的感染性休克小鼠肺損傷的嚴(yán)重程度，使肺組織中抗氧化酶水平升高，而氧化應(yīng)激產(chǎn)物和炎癥介質(zhì)水平降低[22]。NAC能夠抑制IL-1β誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞基質(zhì)降解，同時(shí)對(duì)骨關(guān)節(jié)炎具有潛在的治療價(jià)值[23]。日糧NAC可以改善中華絨螯蟹的生長(zhǎng)性能和存活率，0.1%NAC可以有效減輕由T-2毒素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，免疫抑制和細(xì)胞凋亡[24]。對(duì)山羊卵泡顆粒細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，NAC的添加可顯著抵制由甲氧氯誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞凋亡引起的DNA損傷的增加，通過(guò)降低細(xì)胞ROS產(chǎn)生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而防止甲氧氯誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞凋亡和卵泡閉鎖[25-26]。這些研究均證實(shí)，NAC對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的促進(jìn)作用，與本研究發(fā)現(xiàn)NAC對(duì)山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中的積極作用相符。

圖6 山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞周期、增殖因子mRNA表達(dá)水平Fig.6 The mRNA expression levels of cell cycle and proliferation-related factors in gESCs

M表示DL2000 marker,1～2表示PCR產(chǎn)物大小M means DL2000 marker, 1-2 means PCR product size圖7 NAC對(duì)山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞TGF-β1(A)、TGF-β3(B)基因mRNA表達(dá)的影響Fig.7 Effect of NAC on mRNA expression of TGF-β1(A) and TGF-β3(B) genes in gESCs

圖8 山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞TGF-β1、TGF-β3基因表達(dá)譜分析結(jié)果Fig.8 Analysis results of gene expression profile of TGF-β1,TGF-β3 in gESCs

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor β，TGFβ)是一種分泌性、炎癥性細(xì)胞因子，存在于細(xì)胞過(guò)程(包括增殖，分化，遷移和存活)以及生理過(guò)程(包括胚胎發(fā)育，血管生成和傷口愈合)，此外，還可通過(guò)激活多個(gè)細(xì)胞內(nèi)途徑而調(diào)控細(xì)胞的分化、增殖過(guò)程，在組織動(dòng)態(tài)平衡中起著至關(guān)重要的作用[27]。TGF-β1是TGFβs其中一個(gè)亞型，可參與調(diào)節(jié)生物體內(nèi)多種生物學(xué)功能，研究表明，TGF-β1異常表達(dá)可引起機(jī)體的疾病的發(fā)生，并能夠?qū)⒓?xì)胞阻滯在G0/G1期[28]。TGF-β3同樣具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，TGF-β3對(duì)生殖系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制是目前研究的前沿與熱點(diǎn)，劉彧等[29]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度TGF-β3因子可以促進(jìn)黑色素細(xì)胞突起形成，引起黑色素細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。生殖方面，熱應(yīng)激導(dǎo)致豬睪丸TGF-β3表達(dá)升高，下調(diào)血睪屏障緊密連接蛋白Claudin-11的表達(dá)，導(dǎo)致正常的精子發(fā)生受阻，進(jìn)而影響精子發(fā)生和精液品質(zhì)[30]。為研究NAC對(duì)山羊繁殖性能的影響，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NAC刺激細(xì)胞后，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中TGF-β1、TGF-β3基因的表達(dá)水平顯著降低，說(shuō)明NAC可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞中TGF-β1、TGF-β3基因的表達(dá)而間接影響山羊的繁殖性能。

4 結(jié) 論

在體外培養(yǎng)條件下，200 μmol·L-1NAC能夠促進(jìn)山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖，降低細(xì)胞的活性氧，延緩細(xì)胞衰老，降低TGF-β1、TGF-β3基因的表達(dá)水平。