丁文淇，圖格琴，任秀娟，陶克濤，拉?，敚Z紫潔，安塔娜，鐵木齊爾·阿爾滕齊米克，韓海格,陶娜拉，芒 來*，白東義*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古自治區(qū)馬遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部馬屬動(dòng)物遺傳育種繁殖科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站, 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)馬屬動(dòng)物研究中心，呼和浩特 010018； 2.錫林郭勒盟鑲黃旗農(nóng)牧和科技局，鑲黃旗 013250)

蒙古馬是世界上古老的馬品種之一，具有抗嚴(yán)寒、耐粗食、耐力強(qiáng)等優(yōu)良特性。在長距離比賽中，蒙古馬可以連續(xù)完成30～100 km的耐力比賽[1]。

骨骼肌作為哺乳動(dòng)物最大的產(chǎn)能器官系統(tǒng)，為動(dòng)物運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生動(dòng)力。肌纖維作為骨骼肌的基本組成單位，其性狀主要包括纖維密度、大小、類型等[2]。在動(dòng)物出生以后，肌纖維的數(shù)目已經(jīng)確定，其生長發(fā)育和類型組成是影響動(dòng)物機(jī)體運(yùn)動(dòng)性能的重要因素。根據(jù)肌纖維形態(tài)特征、生理功能可以進(jìn)行區(qū)分為Ⅰ型(慢收縮氧化型)、Ⅱa型(快收縮氧化型)、Ⅱb型(快收縮酵解型)和Ⅱx型肌纖維(中間型)[3]。不同類型的肌纖維形態(tài)特征、收縮性能等生理生化特性存在差異，不同肌纖維類型酶活性的不同決定了其代謝性能的差異。慢肌纖維含有較高活性的有氧代謝酶，線粒體含量高，而ATP酶活性較低，故收縮慢而持久?？旒±w維中含有較高的糖酵解酶和ATP酶，線粒體含量較少，快肌收縮快但不持久[4]。肌纖維類型并不是一成不變的，當(dāng)機(jī)體受到刺激時(shí)，骨骼肌能夠激活細(xì)胞內(nèi)相關(guān)的信號(hào)通路，使肌纖維特異性基因表達(dá)發(fā)生改變[5]。由于骨骼肌具有高度可塑性，從而使肌纖維類型發(fā)生改變以適應(yīng)當(dāng)前機(jī)體需求，不同的生長情況下也可引起不同程度的肌纖維類型的轉(zhuǎn)變[6]。肌纖維類型的轉(zhuǎn)化遵循Ⅰ型 (慢收縮氧化型)?Ⅱa型 (快收縮氧化型)?Ⅱx/d型 (中間型)?Ⅱb型 (快收縮酵解型) 的轉(zhuǎn)化路徑[7]。Sakuma等[8]發(fā)現(xiàn)，MyOD和Myf5主要在快肌中表達(dá)，而MyOG主要在慢肌中表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MyOD通過與MyHCⅡb基因啟動(dòng)子區(qū)域的E-box結(jié)合，激活了肌肉基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)Ⅱb型肌纖維的表達(dá)[9]。MyOD也可以通過激活自身、家族成員互相結(jié)合來激活肌肉特異性基因表達(dá)[10]，還受到細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)，如FGF2-2(成肌細(xì)胞生長因子-2)、TGF-β1(轉(zhuǎn)化生長/分化因子-β1)，共同來調(diào)節(jié)肌纖維的生長和轉(zhuǎn)化[11]。在肌肉中超表達(dá)MyOD能夠使慢肌轉(zhuǎn)化為快肌[12]。敲除MyOD基因后，可以使快肌轉(zhuǎn)化為慢肌[13]。Alapat等[14]研究發(fā)現(xiàn)，低水平的MyOG(肌細(xì)胞生成素)能自身調(diào)節(jié)，與生肌因子其他成員相互作用[15]，同時(shí)還可以調(diào)節(jié)肌肉特異蛋白如肌鈣蛋白、肌球蛋白輕鏈等促進(jìn)成肌分化為快肌纖維[16]，當(dāng)表達(dá)水平提升時(shí)又促進(jìn)慢肌的形成[14]。類似這種肌纖維類型轉(zhuǎn)化受到多個(gè)分子和多種信號(hào)通路共同調(diào)控，肌纖維類型的這種適應(yīng)性重塑過程對于機(jī)體能量穩(wěn)態(tài)、緩解疲勞、成長發(fā)育至關(guān)重要。然而這種肌纖維類型轉(zhuǎn)化的分子調(diào)節(jié)機(jī)理在蒙古馬上還不是很清楚。

為進(jìn)一步研究蒙古馬肌纖維類型轉(zhuǎn)化的分子機(jī)理，本研究對年齡上存在明顯差異的蒙古馬骨骼肌纖維類型進(jìn)行探索，選取快、慢肌纖維組成差異較大的4塊部位肌肉(長臂三頭肌、夾肌、背最長肌、臀中肌)進(jìn)行RNA-seq，比較胎兒期和成年時(shí)期快肌和慢肌類型的轉(zhuǎn)錄組差異。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物樣品采集

本研究選取3匹年齡為5歲、體型基本一致、孕期時(shí)間差距較小的成年雌性蒙古馬，以及胎齡為4月 的3匹胎兒進(jìn)行采樣。試驗(yàn)馬匹來源于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)飼養(yǎng)的試驗(yàn)動(dòng)物，其生活環(huán)境相同。從胎兒和成年馬身上采集4個(gè)具有代表性部位的肌肉組織樣本，長臂三頭肌(前肢)、夾肌(頸部)、背最長肌(背部)、臀中肌(后肢)4個(gè)部位。采集獲得的樣本一部分立即投入液氮存儲(chǔ)后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存；另一部分用4%的多聚甲醛固定24 h后經(jīng)過乙醇梯度脫水至100%無水乙醇溶液，-20 ℃低溫儲(chǔ)存。

1.2 快、慢肌纖維免疫組化染色

本試驗(yàn)采用的是免疫組化染色法，免疫組化染色法是抗原和抗體的專一性結(jié)合，通過酶等化學(xué)反應(yīng)中抗體標(biāo)記顯色劑顯色，對肌纖維類型的區(qū)分是根據(jù)肌纖維類型存在差異找到各類型肌纖維所對應(yīng)的抗體，從而將肌纖維進(jìn)行區(qū)分。

將浸泡在100%乙醇中的組織樣品進(jìn)行石蠟包埋，利用切片機(jī)(Leica RM2245)對包埋的石蠟制作成組織完整、無損傷的6 μm厚度的連續(xù)組織切片，70 ℃烘30 min后，經(jīng)數(shù)小時(shí)晾干，通過二甲苯脫蠟，梯度酒精回水后，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，試驗(yàn)流程依據(jù)UltraSensitiveTM S-P超敏試劑盒說明書制定。切片經(jīng)過氧化物酶阻斷溶液處理，PBS (pH 7.2～7.4) 沖洗后滴加正常非免疫動(dòng)物血清，室溫孵育10 min; PBS沖洗后滴加第一抗體分別為: 1)抗 快速肌球蛋白骨骼重鏈抗體(兔, 稀釋濃度1∶200, Bioss, 中國北京)，該抗體與MHC-Ⅱ特異性反應(yīng)；2)抗肌球蛋白-7抗體(兔, 稀釋濃度1∶200, Bioss, 中國北京)，該抗體與MHC-Ⅰ特異性反應(yīng)。4 ℃孵育過夜，PBS沖洗后滴加第二抗體(小鼠，稀釋濃度1∶200，福州麥興)，室溫孵育10 min，PBS沖洗后滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫孵育10 min；PBS沖洗后，配置新鮮的DAB染色劑，滴加在切片上，顯微鏡下觀察顯色，自來水沖洗終止染色；蘇木素復(fù)染，脫水后用中性樹膠封片徹底晾干，放置在切片盒中常溫避光保存。

經(jīng)過免疫組化染色的蒙古馬4個(gè)部位的肌肉切片置于顯微成像系統(tǒng)(Axio Observer D1, ZEISS)進(jìn)行數(shù)字照片檢測和測量信號(hào)，在連續(xù)切片中快、慢肌纖維均呈現(xiàn)出棕色陽性信號(hào)，由Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件選取出AOI (area of interest)，在通過軟件捕捉得到肌纖維總面積，棕色信號(hào)區(qū)域和白色區(qū)域相比得到快肌和慢肌在肌纖維中的占比。

1.3 骨骼肌RNA文庫的構(gòu)建與測序

3匹胎兒期蒙古馬和3匹成年期蒙古馬的長臂三頭肌、夾肌、背最長肌、臀中肌肌肉樣品使用TRIzol試劑(Invitrogen, CA, USA)和動(dòng)物組織RNA純化試劑盒TRK1002(LC Science, Houston, TX)提取總RNA，使用Agilent 2100生物分析儀和Agilent RNA 6000納米試劑盒(Agilent, CA, USA) 對RNA的數(shù)量和質(zhì)量進(jìn)行分析，然后使用mRNA-Seq樣品制備試劑盒(Illumina, San Diego, USA)生成測序文庫。文庫在Illumina Hiseq 4000平臺(tái)上測序，生成2×150 bp的配對端reads。

1.4 轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析

首先用cutadapt軟件對原始數(shù)據(jù)接頭序列和低質(zhì)量序列進(jìn)行處理，這些數(shù)據(jù)通過FastQC(http:// www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)驗(yàn)證，然后將高質(zhì)量reads比對到馬參考基因組(EquCab3.0)，使用Hisat2[17]進(jìn)行比對，然后使用stringtie[16]得到胎兒期和成年期的基因表達(dá)譜。用DEseq2軟件[18]進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，差異顯著標(biāo)準(zhǔn):| log2(fold change)|>1 &P<0.05。為了比較胎兒期和成年期肌纖維類型的差異基因表達(dá)譜，以胎兒期和成年期肌纖維群體作為兩組進(jìn)行后續(xù)研究。使用DAVID (https://david.ncifcrf.gov/)在線軟件對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 和KEGG富集分析。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

使用HiScript?II qRT SuperMix for qPCR (Vazyme)從總RNA中生成cDNA。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果篩選9個(gè)與蒙古馬肌纖維類型轉(zhuǎn)化相關(guān)的差異表達(dá)基因，利用NCBI在線引物設(shè)計(jì)功能設(shè)計(jì)特異性引物，選擇甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因?yàn)閮?nèi)參基因，后將設(shè)計(jì)好的引物送上海生工生物工程公司合成。然后用10對引物(表1)和SYBR?Premix Ex TaqTMII (TaKaRa)在CFX96 Real-Time PCR檢測系統(tǒng)(Bio-Rad)上進(jìn)行qPCR。反應(yīng)體系如表2所示，選擇GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct定量分析方法。熒光定量PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min；60 ℃退火30 s； 72 ℃延伸1 min。試驗(yàn)進(jìn)行12個(gè)生物學(xué)重復(fù)，從而減少外界以及人為操作因素對試驗(yàn)的影響。

表1 骨骼肌相關(guān)基因擴(kuò)增引物序列信息

2 結(jié) 果

2.1 胎兒期和成年期蒙古馬肌纖維類型差異比較

根據(jù)免疫組化染色圖像，將纖維分為Ⅰ型(慢型)和Ⅱ型(快型)纖維。本研究共采集了6匹蒙古馬長臂三頭肌、夾肌、背最長肌、臀中肌共24個(gè)樣本(6匹*4塊肌肉)，成年期蒙古馬Ⅱ型骨骼肌纖維中，長臂三頭肌(72%)、夾肌(56.1%)、背最長肌(70.3%)如圖1A和圖1B所示、臀中肌(81.5%)。胎兒期蒙古馬Ⅱ型骨骼肌纖維中，長臂三頭肌(89.1%)、夾肌(78.8%)、背最長肌(93%)如圖1C和圖1D所示、臀中肌(94.2%)。如圖2所示，與成年馬肌纖維相比，胎兒馬肌纖維形狀不規(guī)則，肌纖維大小差別較大。胎兒期蒙古馬背最長肌、夾肌和長臂三頭肌中Ⅱ型肌纖維占比極顯著高于成年期蒙古馬(P<0.01)。

表2 熒光定量PCR反應(yīng)體系

2.2 差異表達(dá)基因的表達(dá)與鑒定

在本研究中，兩個(gè)年齡階段4塊不同部位的肌肉作為一個(gè)整體被比較，區(qū)別在于兩個(gè)時(shí)期肌纖維類型存在差異。DESeq2數(shù)據(jù)分析顯示，一些基因在多重對照組中差異表達(dá)，結(jié)果表明，胎兒期和成年期肌纖維表型和肌纖維類型基因表達(dá)存在差異。通過比較胎兒期和成年期骨骼肌的差異基因表達(dá)，共鑒定出250個(gè)差異表達(dá)基因，其中胎兒時(shí)期表達(dá)上調(diào)的基因17個(gè)，成年時(shí)期表達(dá)上調(diào)的基因27個(gè)，如圖3A所示。差異表達(dá)基因分層聚類分析發(fā)現(xiàn)，ENO3、TNNI2等基因主要表達(dá)于胎兒期蒙古馬，ATP2A2、TNNT1等基因主要表達(dá)于成年期蒙古馬(圖3B)。

A.成年期蒙古馬背最長肌快肌纖維； B. 成年期蒙古馬背最長肌慢肌纖維； C. 胎兒期蒙古馬背最長肌快肌纖維； D. 胎兒期蒙古馬背最長肌慢肌纖維。a.快肌纖維；b.慢肌纖維A. Fast muscle fibers of longissimus dorsi in adult period; B. Slow muscle fibers of longissimus dorsi in adult period; C. Fast muscle fibers of longissimus dorsi in fetal period; D. Slow muscle fibers of longissimus dorsi in fetal period.a.Fast muscle fiber;b.Slow muscle fiber圖1 不同部位肌肉快、慢肌纖維分布Fig.1 Distribution of fast and slow muscle fibers in different parts

2.3 差異表達(dá)基因的GO富集分析

約有60%的差異表達(dá)基因被GO富集注釋，主要富集于生物途徑。如圖4所示，在生物途徑中，GO富集顯示了胎兒期和成年期主要富集在成年期蒙古馬骨骼肌收縮(GO:0003009～skeletal muscle contraction)、肌肉收縮調(diào)節(jié)(GO:0006937～regulation of muscle contraction)、ATP酶活性調(diào)節(jié)(GO:0043462～regulation of ATPase activity)，這能夠調(diào)控自身骨骼肌收縮應(yīng)對外面環(huán)境和機(jī)體內(nèi)部因子穩(wěn)態(tài)，為機(jī)體運(yùn)動(dòng)提供充足的動(dòng)力。特別明顯的是有多個(gè)差異表達(dá)基因富集在快慢肌纖維類型轉(zhuǎn)化(GO:0014883～transition between fast and slow fiber)，暗示在胎兒期和成年期肌纖維類型發(fā)生過轉(zhuǎn)化。胎兒期與成年期上調(diào)差異表達(dá)基因不同，胎兒期上調(diào)明顯的差異表達(dá)基因富集在糖酵解過程(GO:0006096～glycolytic process)和肌肉收縮過程(GO:0006936～muscle contraction)，為機(jī)體提供生命活動(dòng)所需要的能量。

f.胎兒期。GM. 臀中肌；LD. 背最長?。籗P. 夾??；TB. 長臂三頭肌f. Fetus period. GM. Gluteus medius; LD. Longissimus dorsi; SP. Splenius； TB: Triceps brachii圖2 蒙古馬4個(gè)部位快、慢肌占比Fig.2 The ratio of fast and slow muscle fiber in 4 parts of Mongolian horse

2.4 差異表達(dá)基因的KEGG途徑分析

為了進(jìn)一步了解成年馬和胎兒馬之間的分子功能差異，本研究使用KEGG通路的功能注釋了差異表達(dá)基因。如圖5所示，在這些通路中，糖酵解和糖質(zhì)新生(ecb00010:Glycolysis/Gluconeogenesis)途徑是肌纖維快速收縮的關(guān)鍵代謝途徑，該通路中基因在胎兒期占有更大比例，且胎兒期占有高比例的快肌纖維。AMPK信號(hào)通路(ecb04152:AMPK signaling pathway)是平衡細(xì)胞能量的重要調(diào)節(jié)酶，除對肌肉能量代謝起到調(diào)控作用外，AMPK還與肌纖維類型轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。鈣信號(hào)通路(ecb04020:Calcium signaling pathway)依賴轉(zhuǎn)運(yùn)途徑使肌纖維類型發(fā)生轉(zhuǎn)化。心肌細(xì)胞脾、腎上腺素能信號(hào)通路(ecb04261:Adrenergic signaling in cardiomyocytes)富集了一些與肌肉轉(zhuǎn)化相關(guān)的基因(TNNI1、TNNC1、TPM3)。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證差異基因的表達(dá)，胎兒期和成年期骨骼肌中，兩組間的差異基因(ATP2A2、MYOZ2、MYL1、ENO3、MYBPC1、TMOD4、TNNT1、TNNT3、TNNI2)參與了骨骼肌收縮、快速和緩慢肌纖維之間的轉(zhuǎn)換以及糖酵解代謝。RT-qPCR檢測這些mRNA的表達(dá)趨勢與mRNA-seq數(shù)據(jù)一致，驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)結(jié)果可信，如圖6所示。

3 討 論

本試驗(yàn)研究了胎兒期和成年期蒙古馬肌纖維類型的差異，免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，胎兒期Ⅱ型纖維比例顯著高于成年期蒙古馬，可能與胎兒營養(yǎng)物質(zhì)豐富有關(guān)，日糧中的營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收后可參與機(jī)體能量代謝，進(jìn)而影響肌肉發(fā)育和肌纖維類型轉(zhuǎn)化[19]。動(dòng)物早期的生長發(fā)育是一個(gè)關(guān)鍵階段，受到了遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)和母源營養(yǎng)環(huán)境的共同影響，最終決定了成年期的表型[20]。動(dòng)物出生后肌纖維發(fā)育肥大，還伴隨肌纖維類型轉(zhuǎn)化[21-22]。胎兒到成年時(shí)期Ⅱ型(快型)纖維向Ⅰ型(慢型)纖維轉(zhuǎn)化，一般Ⅰ型纖維對于大型哺乳動(dòng)物維持其體重非常重要。成年時(shí)期蒙古馬有較高的Ⅰ型纖維比例，在不斷生長發(fā)育過程中，肌纖維類型的轉(zhuǎn)化隨著年齡的增加而不斷發(fā)生轉(zhuǎn)化，以便適應(yīng)不同時(shí)期體重發(fā)生改變的蒙古馬[23]。

A.紅色代表胎兒期蒙古馬上調(diào)基因，藍(lán)色代表成年期蒙古馬上調(diào)基因，黑色代表無顯著變化基因；B.紅色代表上調(diào)基因,綠色代表下調(diào)基因,TD代表成年期蒙古馬,TX代表胎兒期蒙古馬A. Red represents the up-regulated genes in fetal Mongolian horse, blue represents up-regulated genes in adult Mongolian horses, black represents genes with no significant change； B. Red represents up-regulated genes, green represents down-regulated genes, TD represents adult Mongolian horse, TX represents fetal Mongolian horse圖3 胎兒期與成年期差異表達(dá)基因火山圖(A)及胎兒期與成年期差異基因分層聚類(B)Fig.3 Volcano map (A) and stratified clustering(B) of differentially expressed genes at fetal and adult stages

肌纖維轉(zhuǎn)化不是從一個(gè)極端 (快肌纖維) 跨越到另一個(gè)極端 (慢肌纖維)，而是在分子水平中逐級(jí)過渡轉(zhuǎn)化的, 即肌原纖維蛋白亞型的轉(zhuǎn)變[24]。為了確定和比較胎兒時(shí)期和成年時(shí)期肌纖維類型，本試驗(yàn)研究了胎兒期和成年期蒙古馬具有代表性的4個(gè) 部位肌肉(整體)的轉(zhuǎn)錄組，功能富集在這兩個(gè)時(shí)期的肌肉之間出現(xiàn)了高度分化。GO富集結(jié)果中，在胎兒時(shí)期(含有較高的Ⅱ型纖維)中高表達(dá)的差異表達(dá)基因主要富集于糖酵解代謝相關(guān)途徑。GO富集結(jié)果還表明，Ⅰ型和Ⅱ型纖維在胎兒期和成年期肌纖維類型轉(zhuǎn)化，成年時(shí)期Ⅰ型纖維增加，部分基因(TNNT1、TNNC1、ATP2A2)主要在成年時(shí)期慢抽搐骨骼肌中表達(dá)。早期的生長階段是肌纖維類型轉(zhuǎn)化的重要階段，為了適應(yīng)外界環(huán)境的要求和自身?xiàng)l件的需要。調(diào)控肌纖維類型的差異基因在不斷發(fā)生變化，肌纖維類型逐級(jí)過度轉(zhuǎn)化，并且這種轉(zhuǎn)化過程處于動(dòng)態(tài)平衡階段[25]。

肌纖維類型間的相互轉(zhuǎn)化受到復(fù)雜的生物學(xué)通路調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)錄組是特定組織或細(xì)胞在某一生理?xiàng)l件下所表達(dá)的所有RNA，是連接蛋白質(zhì)和基因的橋梁[26]。本研究通過KEGG注釋共得到20條信號(hào)通路，其中差異表達(dá)基因在Ca2+信號(hào)通路中富集。Ca2+信號(hào)通路依賴鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin，CaN)和鈣調(diào)蛋白激酶(calmodulin kinase，CaMK)進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，每一條傳導(dǎo)途徑被激活都能夠促進(jìn)Ⅱ型纖維向Ⅰ型纖維轉(zhuǎn)化[27]。另外還有一條關(guān)于肌纖維轉(zhuǎn)化的相關(guān)通路，5′-腺苷單磷酸激活蛋白激酶(AMPK)是細(xì)胞能量的重要調(diào)節(jié)酶，不僅對肌肉能量代謝起關(guān)鍵調(diào)控作用，還能夠參與肌纖維類型轉(zhuǎn)化[28]。研究發(fā)現(xiàn),AMPK激活劑阿卡地新可誘導(dǎo)大鼠趾長伸肌Ⅱb型肌纖維向Ⅱx型肌纖維轉(zhuǎn)化。AMPK在細(xì)胞能量代謝時(shí)由ATP產(chǎn)生，ATP去磷酸化形成ADP與AMP。而AMP可通過上游激酶增加AMPK磷酸化，通過磷酸酶降低AMPK去磷酸化，AMP還可以變構(gòu)激活磷酸化AMPK。AMPK經(jīng)磷酸化激活后會(huì)調(diào)控其下游通路 PGC-1α，增加線粒體的生物合成，增強(qiáng)線粒體功能，提高氧化代謝能力，從而使Ⅱ型肌纖維向Ⅰ型轉(zhuǎn)化[29]。本研究中,調(diào)控AMPK通路的基因主要表達(dá)于成年期，可能說明了成年期肌纖維受到了AMPK通路調(diào)節(jié)，證明了胎兒期到成年期快肌受到機(jī)體內(nèi)部因子調(diào)控逐漸向慢肌轉(zhuǎn)化。

圖4 差異表達(dá)基因的GO功能富集分析結(jié)果Fig.4 The GO enrichment analysis results of differentially expressed genes

圖5 胎兒期和成年期差異表達(dá)基因KEGG富集分析Fig.5 The KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes in fetal and adult stages

圖6 RNA-seq和qRT-PCR驗(yàn)證Fig.6 RNA-seq and qRT-PCR validation

肌纖維是動(dòng)態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，MYDZs家族蛋白對維持Z盤結(jié)構(gòu)穩(wěn)定有重要意義，已有研究結(jié)果表明，MYOZ2是肌肉組織特異性表達(dá)蛋白[30]，主要在慢肌組織和心肌中表達(dá)，可以激活多種肌肉發(fā)生相關(guān)基因，在肌纖維分化和發(fā)育上起重要作用[31]。MYOZ2基因在成年期表達(dá)水平明顯高于胎兒期，成年期慢收縮肌纖維也顯著高于胎兒期。Frey等[32]發(fā)現(xiàn)，MYOZ2基因敲除的小鼠中, CaN信號(hào)通路的活性顯著增強(qiáng)。MYOZ2可以負(fù)向調(diào)節(jié)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的功能[33],將MYOZ2基因敲除后，鈣調(diào)磷酸酶活性顯著增強(qiáng)，激發(fā)了CaN-NFAT信號(hào)通路，啟動(dòng)生成慢肌纖維機(jī)制。MYOZ2基因?qū)aN的活性起了抑制作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)了慢肌纖維的轉(zhuǎn)化[34]。MYOZ2基因在成年馬慢肌纖維中表達(dá)明顯，可能說明MYOZ2基因在成年期調(diào)控鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶對肌纖維類型產(chǎn)生影響，導(dǎo)致成年期慢肌纖維增加，骨骼肌具有不同收縮程度和代謝特性，從而使肌肉能夠進(jìn)行特定的運(yùn)動(dòng)，成年期肌纖維增多可能與長期負(fù)重勞作有關(guān)，慢肌纖維的增加能夠使馬匹基礎(chǔ)代謝加快，更好地利用氧氣，在長時(shí)間的運(yùn)動(dòng)或者勞作上使馬匹的效率得到提高。

骨骼肌是哺乳動(dòng)物最大的產(chǎn)能器官，是機(jī)體糖代謝的重要場所[35]。肌纖維類型經(jīng)過一個(gè)成熟的過程達(dá)到穩(wěn)定的分布模式[36]。近年來通過遺傳育種和營養(yǎng)調(diào)控多種手段，可以使動(dòng)物肌纖維類型發(fā)生明顯轉(zhuǎn)化[37]。早期生長階段是肌纖維類型轉(zhuǎn)化的重要時(shí)期，營養(yǎng)水平是肌肉能夠發(fā)育轉(zhuǎn)化的基本保障，環(huán)境、訓(xùn)練、飼養(yǎng)條件等后天因素也會(huì)使肌纖維轉(zhuǎn)化，外界因素和機(jī)體內(nèi)部因子協(xié)同調(diào)控是轉(zhuǎn)化的必然結(jié)果[38]。

4 結(jié) 論

本研究分析了胎兒期和成年期蒙古馬肌纖維類型轉(zhuǎn)化情況，發(fā)現(xiàn)胎兒期蒙古馬快肌纖維比例顯著高于成年期蒙古馬。經(jīng)過轉(zhuǎn)錄組篩選出差異表達(dá)基因44個(gè)，其中ATP2A2、MYOZ2等基因主要表達(dá)于成年期蒙古馬肌纖維，ENO3、TNNI2等基因主要表達(dá)于胎兒期蒙古馬肌纖維。鈣信號(hào)和AMPK信號(hào)通路與肌纖維類型轉(zhuǎn)化有關(guān)。