鄧葉龍 孔令俊 劉朝輝 李興國 楊德龍 王晨亮 黃曉焱 袁劍 陳文麗

1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000 2. 甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種骨骼疾病，其特征是骨丟失和骨微結(jié)構(gòu)破壞，伴隨著骨脆性增加和脆性骨折的風(fēng)險增加[1]。骨吸收與形成之間的不平衡導(dǎo)致骨密度和骨質(zhì)量降低，最終導(dǎo)致OP甚至脆性骨折的發(fā)生[2]，隨著人口老齡化日益加劇，OP成為了全球的公共健康問題。目前治療OP的方法包括藥物、手術(shù)、物理療法等。長期使用抗骨質(zhì)疏松藥物可能會導(dǎo)致胃腸道不適、頜骨骨壞死和股骨頭壞死等副作用[3]。脈沖電磁場(pulsed electromagnetic fields ，PEMFs)是一種非侵入性的骨骼疾病物理療法，因其見效快、操作簡便、無副作用而得到廣泛應(yīng)用[4]。PEMFs能夠在組織中誘導(dǎo)生物電流，產(chǎn)生特殊的生物效應(yīng)[5]，其頻率范圍從5～500 Hz[6]，不同頻率、波形、強度的電磁場對特定的骨細胞產(chǎn)生不同的生物效應(yīng)。有研究表明[7]，當(dāng)PEMFs的頻率為7.5～15 Hz或50～75 Hz，強度為0.40～1.55 mT或3.8～ 4 mT時，PEMFs能夠促進成骨細胞的增殖；0.9～4.8 mT和45～60 Hz的正弦電磁場，以及0.1～0.4 mT或400 mT的靜態(tài)磁場，可以促進成骨細胞的分化和成熟。然而，由于各種細胞和分子可以受到具有各種參數(shù)的電磁場的影響，PEMFs對骨細胞的精確生物效應(yīng)和潛在機制仍然不清楚。本文擬就PEMFs對骨代謝的作用及機制研究進展進行綜述。

1 PEMFs對骨代謝的分子細胞學(xué)作用機制

1.1 PEMFs對骨髓間充質(zhì)干細胞的影響

有研究[8-10]報道PEMFs能促進骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)的增殖，然而也存在PEMFs對BMSC的增殖具有抑制作用的報道。這種差異與初始接種培養(yǎng)物的密度不同有關(guān)，高接種密度的BMSC抑制了其自身的擴散，BMSC的成脂化和成骨化受到影響。因此初始接種密度在PEMFs療法確定誘導(dǎo)哪種分子機制分化過程中具有重要作用。脂肪細胞(adipocytes)和成骨細胞來源于BMSC，其分化由PPAR-γ和Runx 2轉(zhuǎn)錄因子的控制。PPAR-γ是一種主要在脂肪細胞中特異表達的轉(zhuǎn)錄因子，它促進BMSC向脂肪細胞而不是成骨細胞的分化，導(dǎo)致骨髓脂肪增加、骨密度降低和骨折風(fēng)險增加。Runx 2的表達可以控制基質(zhì)金屬蛋白酶細胞的分化，刺激骨的形成和抑制脂肪生成[11]。

PEMFs如何影響B(tài)MSC成骨分化的詳細機制尚不完全清楚，存在許多假說。PEMFs可通過調(diào)節(jié)堿性磷酸酶(ALP)活性和Runx 2/Cbfa1的表達，誘導(dǎo)BMSC成骨標志物的早期表達[12-13]；PEMFs還能增強礦化，抑制成脂基因AP-2的表達[14]；PEMFs聯(lián)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)有利于BMSC的成骨分化[15]；BMSC在成骨分化過程中可以表達A2A和A2B腺苷骨活性物質(zhì)受體[16]。由這兩種腺苷受體調(diào)節(jié)的環(huán)磷酸腺苷的上調(diào)能夠介導(dǎo)成骨相關(guān)基因的表達Runx 2和Osterix[17]，表明這些受體可以參與成骨；PEMFs還可能通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)途徑誘導(dǎo)BMSC向成骨細胞譜系的轉(zhuǎn)移[18-19]。mTOR參與多種細胞類型的調(diào)節(jié)，如成骨細胞和脂肪細胞。PEMFs可以消除mTOR誘導(dǎo)的細胞外基質(zhì)礦化的減少，抑制mTOR信號通路可能刺激成骨細胞分化并降低成脂潛能；PEMFs可以通過激活TGF-β信號通路和刺激BMSC中miR21-5p的表達來調(diào)節(jié)其對骨代謝的影響。

1.2 PEMFs對成骨細胞的影響

PEMFs對成骨細胞增殖和分化的影響存在矛盾的結(jié)果，研究發(fā)現(xiàn)[20]在成骨樣MC3T3細胞系中，ALP活性通過PEMFs(15 Hz和7 mT)處理顯著增加，認為PEMFs能增強成骨細胞活性，導(dǎo)致細胞分化增加。也有研究報道[21]，當(dāng)新生小鼠顱骨骨細胞暴露于PEMFs(15 Hz和2 mV/cm)時，ALP活性可能被抑制，認為PEMFs可以刺激成骨細胞增殖，但對分化沒有影響。產(chǎn)生這些矛盾結(jié)果的原因可能在于所使用的細胞類型、PEMFs的頻率和強度、分析選擇的時間點不同。

PEMFs能上調(diào)BMP2、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)、骨保護素(OPG)、骨橋蛋白、Runx 2/Cbfal、ALP、基質(zhì)金屬蛋白酶1和3(MMP-1和MMP-3)、核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)配體，表明PEMFs能直接刺激骨母細胞的成骨分化[22-23]。此外，PEMFs能上調(diào)大鼠骨量和TGF-β濃度，降低白細胞介素6(IL-6)的濃度[24],這可以有效地抑制骨損失。PEMFs不僅能上調(diào)與骨和基質(zhì)成分形成相關(guān)的多種基因，還能調(diào)節(jié)與細胞外基質(zhì)降解相關(guān)的多種基因[25]，如下調(diào)與骨形成相關(guān)的重要基因(HOXA10、AKT1)、轉(zhuǎn)導(dǎo)水平的基因(CALM1、P2RX7)、細胞骨架成分(FN1、VCL)、細胞外基質(zhì)(MMP-11，DUSP4)降解相關(guān)基因，上調(diào)膠原(COL1A2)和非膠原(SPARC)基質(zhì)成分。PEMFs能增強IGF-II和TGF-β分泌，減少前列腺素E2 (PGE2)的分泌，并刺激骨組織的形成[26]。PEMFs上調(diào)Ccnd 1和Ccne 1的表達，導(dǎo)致成骨作用增強[27]。PEMFs可以通過增加一氧化氮(NO)的合成來刺激成骨細胞的增殖和分化，低NO水平與成骨細胞增殖和分化有關(guān)，而高濃度的NO則抑制了成骨細胞的增殖和分化[28]。細胞內(nèi)鈣瞬變在成骨細胞增殖和分化中起重要作用[29]，這可以通過PEMFs處理來實現(xiàn)。

目前關(guān)于PEMFs如何影響成骨細胞的機制有多種假設(shè)。典型Wnt/β-catenin信號通路在調(diào)節(jié)骨量平衡中起著關(guān)鍵作用[30]，能刺激成骨細胞的生成和活性。Wnt蛋白通過細胞外Wnt配體觸發(fā)，最初與細胞膜上的Frizzled和LRP5/6受體結(jié)合，導(dǎo)致Wnt靶向基因的上調(diào)。PEMFs在體內(nèi)和體外均可增加Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)基因的表達，如Wnt1a、Wnt3a、Lrp5和Lrp6。此外，PEMFs還下調(diào)Dickkopf相關(guān)蛋白1 (DKK1)，拮抗Wnt/β-catenin信號通路[27]。PEMFs可能通過BMP2信號通路刺激成骨細胞功能，促進BMP2-catenin的分泌。因此，更多的BMP2-catenin與其受體結(jié)合，受體磷酸化，觸發(fā)細胞內(nèi)信號分子Smad 1/5/8的激活[31]，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子Runx2和Osterix的表達上調(diào)，影響骨形成[32]。PEMFs能抑制參與基質(zhì)降解的基因，如下調(diào)基質(zhì)MMP-11和DUSP4，這些基因可以參與抑制成骨細胞的分化和增殖。此外，PEMFs可以影響C-myc和C-fos的表達，以及觸發(fā)細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2分子途徑，這對成骨細胞增殖和分化的有積極作用[33]。

1.3 PEMFs對破骨細胞的影響

據(jù)報道，PEMFs對破骨細胞生成、凋亡及骨吸收具有影響，PEMFs可以抑制來源于OVX大鼠的原代骨髓細胞的破骨細胞生成，腫瘤壞死因子(TNF-α)、IL-1β和IL-6的濃度降低可能是造成這一結(jié)果的原因[34]。胞核因子KB受體活化因子/細胞核因子KB受體活化因子配體/骨保護因子(RANK/RANKL/OPG)系統(tǒng)在破骨細胞的活化、發(fā)育、成熟過程中起關(guān)鍵性作用[35]。骨細胞和成骨細胞主要表達RANKL，這是一種細胞表面蛋白，與位于破骨細胞膜上的特異性受體RANK結(jié)合，刺激破骨細胞生成。源自成骨細胞的OPG抑制破骨細胞成熟，阻斷破骨細胞生成。PEMFs可能通過OPG/RANK/ RANKL信號通路在破骨細胞形成的調(diào)節(jié)中發(fā)揮抑制作用。PEMFs抑制RANKL的表達，同時增強OPG的表達，導(dǎo)致OPG/RANKL比率增加，PEMFs不僅上調(diào)OPG的表達，而且抑制IL-1β誘導(dǎo)的NF-kB p65亞單位的活性[36]。細胞內(nèi)活性氧(ROS)是破骨細胞分化和形成的關(guān)鍵因素，用二苯基氯化碘降低細胞內(nèi)ROS可顯著抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞分化，表明PEMFs可通過清除細胞內(nèi)ROS抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞生成[37]。PEMFs還可以下調(diào)碳酸酐酶II(CA II)的表達，這是破骨細胞吸收活性的原因[38]。此外，破骨細胞分化可能受Ca2+/鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶-NFATc1信號通路的調(diào)節(jié)，使用FK506鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性抑制劑，可抑制骨吸收，同時降低NFATc1和CTSK的表達[39]。此外，在硝苯地平或FK506存在的情況下，PEMFs進一步降低NFATc1自身擴增和CTSK的表達。這表明PEMFs對Ca2+/鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶-NFAT信號通路有重要影響[40]。

1.4 PEMFs對骨細胞的影響

關(guān)于PEMFs對骨細胞影響的研究較少，PEMFs刺激不影響骨細胞樣細胞(MLO-Y4) 的增殖但能持續(xù)上調(diào)MLO-Y4的總PGE2和總TGF-β1，PEMFs還可以誘導(dǎo)NO2的產(chǎn)生[41]。PGE2在成骨細胞分化中起關(guān)鍵作用，細胞外基質(zhì)合成受TGF-β1刺激，NO2能抑制成骨細胞活性刺激細胞凋亡，促進骨吸收。PEMFs降低了骨壞死的風(fēng)險，并降低了空骨細胞腔隙率[42]。以上提示PEMFs可通過刺激骨細胞調(diào)節(jié)骨代謝。

2 PEMFs在調(diào)節(jié)骨代謝中的作用

骨細胞作為成骨細胞的陽性調(diào)節(jié)因子，通過間隙連接(GJs)、NO和PGE2影響成骨細胞，并通過硬化素(SOST)和DKK1作為成骨細胞活性的陰性調(diào)節(jié)因子[43]。此外，破骨細胞與骨細胞的關(guān)系主要依賴于旁分泌信號和GJs。骨細胞也分泌OPG和TGF-β來影響破骨細胞生成。凋亡的骨細胞是RANK的受體激活劑的主要來源能促進破骨細胞吸收。骨細胞可以調(diào)節(jié)骨礦化，而BMSC可以根據(jù)不同的刺激分化為成骨細胞和破骨細胞。PEMFs能刺激BMSC分化為成骨細胞，并通過不同的機制增強成骨細胞的功能。此外，PEMFs對破骨細胞生成、凋亡和骨吸收有明顯的影響。PEMFs可以通過下調(diào)RANKL和上調(diào)OPG來抑制破骨細胞生成。PEMFs刺激誘導(dǎo)骨細胞的細胞因子如PGE2、TGF-β1和Cx43的產(chǎn)生，影響其他細胞類型之間的通訊。見圖1。

圖1 PEMFs對細胞的影響Fig.1 Effect of PEMFs on cells

3 小結(jié)

本文通過對文獻的綜述，總結(jié)了PEMFs對BMSC、成骨細胞、破骨細胞、骨細胞的影響及其分子信號通路的最新進展。對于BMSC，多種基因的表達和分子細胞通路會受到PEMFs的影響，如PPAR-γ、Runx2、AP-2、BMP-2、A2A、A2B、TGF-β、miR21-5p等；對于成骨細胞，PEMFs影響B(tài)MP2、TGF-β、OPG、Runx2、Cbfal、ALP、MMP-1、MMP-3、NF-KB、Wnt/β-catenin、Smad 1/5/8等；對于破骨細胞，PEMFs影響OPG、RANK、RANKL、CA II、NFATc1、CTSK等；對于骨細胞，PEMFs影響PGE2、TGF-β1等。需要更多高質(zhì)量的工作來探索PEMFs對骨細胞/骨骼的詳細影響和潛在機制，以優(yōu)化PEMFs在骨骼疾病中的應(yīng)用。值得注意的一點是，PEMFs對骨代謝的影響具有窗口效應(yīng)，即不同頻率、波形、強度及作用時間等相關(guān)參數(shù)不同，實驗結(jié)果也不同，一項關(guān)于四種電動勢[低頻(1～100 Hz)、低頻(100～3 000 Hz)、高頻(3 000～50 000 Hz)和高頻(1～50 000 Hz)]對去卵巢(OVX)小鼠骨質(zhì)疏松癥影響的研究發(fā)現(xiàn)[44]，作用3周后與OVX相比，1～100 Hz和100～3 000 Hz顯著增加血清骨形成標志物和成骨相關(guān)基因表達；3 000～50 000 Hz顯著降低了血清骨形成和再吸附標志物以及成骨和破骨細胞生成相關(guān)基因的表達；1～50 000 Hz具有明顯增加骨形成和降低骨吸收活性的累積效應(yīng)。Li等[45]通過比較50 Hz 0.6 Mt低頻脈沖電磁場(PEMFs)和50 Hz 1.8 Mt正弦交變電磁場(SEMFs)對尾部懸吊大鼠骨丟失的預(yù)防作用發(fā)現(xiàn)，50 Hz 0.6 mT PEMFs和50 Hz 1.8 mT SEMFs能有效提高尾部懸吊大鼠的骨密度和生物力學(xué)值，提高大鼠血液中成骨標志物的濃度，通過影響PTH水平激活cAMP通路，從而進一步增加成骨細胞的含量，尤其是PEMFs能阻止尾吊大鼠骨密度和最大負荷值降低50 %左右，并通過促進骨形成增加尾吊大鼠的骨量，但需進一步研究。所以對于最佳的PEMFs刺激參數(shù)需要進一步探索。

4 展望

基于對PEMFs在調(diào)節(jié)骨代謝中潛在作用的研究，其可能被推薦用于骨骼疾病如OP的治療。已有文獻[46-47]報道PEMFs用于臨床治療OP，還沒有關(guān)于長期應(yīng)用PEMFs的不利影響相關(guān)報道，但是大多數(shù)臨床研究樣本量少，PEMFs治療OP效果的證據(jù)等級不高。因此，需要高質(zhì)量、隨機對照試驗、大樣本量和長期隨訪的更可靠證據(jù)來驗證PEMFs治療OP的臨床效果。此外，使用基因敲除小鼠來確定PEMFs治療OP的特定靶點值得更多的關(guān)注。