吳鵬 時孝晴 廖太陽 王培民 張農(nóng)山 黃正泉 丁亮 邢潤麟 茆軍

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京210029

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis, KOA)是一種以膝關(guān)節(jié)疼痛、活動受限、僵硬甚至畸形為主要癥狀的慢性退行性骨關(guān)節(jié)疾病[1]。患者年輕化、發(fā)病率逐漸上升，使KOA已成為全球范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問題[2]。目前，無論是藥物還是手術(shù)治療均具有一定局限性，中醫(yī)藥在KOA的治療上歷史悠久、副作用較少、療效確切[3]。羌活-獨活二者經(jīng)常被用于風(fēng)寒濕引起的關(guān)節(jié)疼痛、風(fēng)濕骨病[4]。羌活辛、苦，性溫，辛溫解表、散寒止痛、通利關(guān)節(jié)，為治療風(fēng)寒濕痹之要藥，獨活辛、苦、微溫，祛風(fēng)除濕、疏經(jīng)通絡(luò)、通痹止痛，能散在里之伏風(fēng)，二者一上一下，一表一里，相須為用。二者作為藥對出現(xiàn)最早記載于《外臺秘要》：羌活行上焦而理上……獨活行下焦而理下……二者配伍，直通上下，橫行肢臂、腰膝、治各類風(fēng)寒濕痹皆可[5]。但中藥成分復(fù)雜，具體作用機制還需進一步研究，借助現(xiàn)代網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，探討羌活-獨活藥對治療膝骨關(guān)節(jié)炎的作用機制，為其治療KOA提供有力的理論支撐，有助于中醫(yī)藥的現(xiàn)代化。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過分析藥物、基因和蛋白的相互作用，發(fā)現(xiàn)其相互作用網(wǎng)絡(luò)，這與中醫(yī)藥的“整體觀、系統(tǒng)觀”十分契合[6-8]，目前，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已被廣泛運用于中藥藥理機制研究、藥物重新定位、毒副作用等相關(guān)研究[9-11]。本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，探討羌活-獨活治療KOA的潛在作用靶標和信號通路，為羌活-獨活治療KOA提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 篩選羌活-獨活活性成分

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform, TCMSP)以“羌活，獨活”為關(guān)鍵詞檢索所有化合物活性成分信息，篩選條件：藥物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥ 30%，藥物相似性(drug-likeness，DL)≥ 0.18，篩選出羌活-獨活活性成分[12-14]。

1.2 篩選羌活-獨活和KOA相關(guān)靶點

通過GeneCard、OMIM、PharmGkb、Therapeutic Targets和DrugBank 數(shù)據(jù)庫，以“Knee osteoarthritis”為關(guān)鍵詞，檢索與KOA相關(guān)的基因，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/uniprot/)將上述獲得的羌活-獨活作用靶標轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的基因名稱，再將羌活-獨活活性成分的靶點預(yù)測結(jié)果與檢索出的KOA相關(guān)靶標進行匹配，篩選交集靶點，確定羌活-獨活治療KOA的核心靶點，通過Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)繪制韋恩圖。

1.3 構(gòu)建羌活-獨活活性成分與KOA作用靶點網(wǎng)絡(luò)

將篩選出的12個羌活-獨活活性成分和16個KOA的相關(guān)靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建羌活-獨活活性成分與KOA靶點網(wǎng)絡(luò)[15]。

1.4 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)及篩選核心基因

將上述羌活-獨活的蛋白靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，設(shè)置物種：Homo sapiens，置信度：0.4，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)，通過拓撲分析篩選關(guān)鍵靶點，使用R project軟件制作顯示基因名和與其相連節(jié)點數(shù)的條形圖。

1.5 GO和KEGG富集分析

使用RGUI和org.Hs.eg.db將所得到的羌活-獨活治療KOA潛在靶點轉(zhuǎn)化為entrezID后再使用RGUI、DOSE和ClusterProfiler對相關(guān)靶點進行GO和KEGG富集分析。選擇富集程度最高的前20條通路。

1.6 分子對接

使用Discovery Studio 2016 3.0對羌活-獨活活性成分與3個KOA核心靶點通過分子對接進行間接驗證。羌活-獨活類藥成分與KOA作用靶點分別通過Chemical Book數(shù)據(jù)庫和PCSB PDB數(shù)據(jù)庫獲取。將上述獲得的靶蛋白進行去水、加氫等處理，保存為對接受體。使用LibDock模塊進行分子對接，保存各圖像。通過LibDock score結(jié)果評價活性成分和關(guān)鍵靶點之間的對接效應(yīng)，LibDock score 分數(shù)越高表明配體與受體蛋白結(jié)合性越好。

2 結(jié)果

2.1 羌活-獨活活性成分

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中根據(jù)OB≥ 30%，DL≥ 0.18的原則下篩選出羌活-獨活15種活性成分，最終納入12個有效活性成分，詳見表1。

2.2 羌活-獨活活性成分與KOA作用靶點的構(gòu)建

通過TCMSP平臺篩選出羌活-獨活中分成35個有效活性成分作用靶標，在GeneCard、OMIM、PharmGkb、Therapeutic Targets和DrugBank 數(shù)據(jù)庫中檢索到1 952個與KOA相關(guān)靶點，映射后得到16個共同靶基因，韋恩圖見圖1，羌活-獨活活性成分靶標見表2。

表1 TCMSP中篩選羌活-獨活的活性成分

圖1 羌活-獨活成分與KOA靶點韋恩圖Fig.1 Venn map of ingredient of ligustrilucidi-Notopterygium incisum-Angelica pubescens-KOA

表2 羌活獨活治療KOA潛在靶點信息

圖3 羌活-獨活治療KOA潛在核心靶點Fig.3 Potential core targets for Notopterygium incisum-Angelica pubescenstreating KOA

2.3 羌活-獨活活性成分與KOA靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將12種活性成分與16個KOA相關(guān)作用靶點進行映射后導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0構(gòu)建羌活-獨活成分-KOA靶點網(wǎng)絡(luò)，見圖2。

圖2 羌活-獨活成分-KOA靶點網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Ingredient of Notopterygium incisum-Angelica pubescens-target network of KOA注：藍色長方形：中藥名稱；紅色菱形：疾病名稱；黃色橢圓形：藥物有效成分；綠色橢圓形：疾病作用靶標。

2.4 核心靶點篩選

將16個關(guān)鍵靶標導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，PPI網(wǎng)絡(luò)顯示其中16個節(jié)點，43條邊，將TSV數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape，基于度中心性(degree centrality，DC)、介數(shù)中心度(betweenness centrality，BC)、接近中心性(closeness centrality，CC)使用CytoNCA對上述數(shù)據(jù)進行分析，刪除2個孤立點，對剩下的14個節(jié)點進行第1次篩選，DC≥ 6.000，BC≥ 0.619，CC≥ 2.767，網(wǎng)絡(luò)顯示共有5個節(jié)點，10條邊，再對這5個節(jié)點進行第2次篩選，DC≥ 9.000，BC≥ 0.765，CC≥ 21.867，網(wǎng)絡(luò)顯示共有3個節(jié)點，3條邊，最終得到的JUN、PTGS2、CASP3為核心靶點，見圖3。

2.5 GO和KEGG通路富集分析

GO分析顯示羌活-獨活能夠參與核受體的活動、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性等相關(guān)過程，見圖4。KEGG富集分析顯示主要與細胞凋亡、雌激素、P53、IL-17、AGE-RAGE等信號通路密切相關(guān)，見圖5。

圖4 羌活-獨活活性成分潛在治療KOA靶點的GO功能分析Fig.4 GO biological process enrichment analysis of Notopterygium incisum-Angelica pubescens against KOA

圖5 羌活-獨活活性成分潛在治療KOA靶點的KEGG富集分析Fig.5 KEGG signaling pathway of Notopterygium incisum-Angelica pubescens against KOA

2.6 分子對接分析

分子對接結(jié)果顯示，羌活-獨活活性成分與篩選出的JUN、PTGS2、CASP3均能較好對接，與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選結(jié)果相吻合，間接驗證了羌活-獨活能夠調(diào)節(jié)KOA的核心靶點。配對結(jié)果見表3，部分對接過程見圖6。

3 討論

KOA作為一種慢性、高致殘性疾病，給患者及社會帶了沉重的經(jīng)濟負擔(dān)，現(xiàn)已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的公共健康問題。疼痛是KOA最常見的癥狀，超過65 %的KOA患者以疼痛為最主要表現(xiàn)。多數(shù)就診的KOA患者表示疼痛是影響其生活質(zhì)量的重要原因，控制疼痛是其最主要的就診目的[16]。對癥狀性的KOA患者，口服或局部使用非甾體類抗炎藥或曲馬多是常見的診療手段[17]。但不可否認的是，盡管西藥的運用獲得了一定的成效，但遠期臨床療效仍難盡人意。與此同時，非甾體類抗炎藥在治療

表3 配體受體蛋白分子對接情況Table 3 Molecular docking of Ligand receptor protein

圖6 羌活-獨活活性成分和KOA靶點beta-sitosterol對接過程Fig.6 The docking process of active ingredient of Notopterygium incisum-Angelica pubescens with beta-sitosterol of KOA targets注：a～c依次為CASP3、JUN、PTGS2與beta-sitosterol對接過程。

KOA的同時，還會引起胃腸道及心血管等方面的副作用[18-19]。

在祖國醫(yī)學(xué)中，KOA屬于“痹癥”范疇，《素問·痹癥》記載到：風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也”，大多數(shù)KOA患者為老年人，年老體弱，肝腎不足，氣虛虧虛，不足以濡養(yǎng)經(jīng)脈，再加上風(fēng)、寒、濕三邪入侵，寒濕凝滯，氣血淤阻，不通則痛[20]。中醫(yī)藥具有多通路、多靶點、多途徑的作用特點，對復(fù)雜性疾病往往能更好的發(fā)揮治療作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一種藥物研究策略，在中醫(yī)藥的研究中已得到廣泛應(yīng)用，有利于我們更好的了解藥物及其化合物的作用[21]。此外，分子對接有助于揭示藥物與靶點之間的關(guān)系。

羌活-獨活對KOA的治療療效顯著，然而分子層面的相關(guān)研究相對缺乏。因此，在本研究中，結(jié)合拓撲分析和分子對接策略，通過構(gòu)建和分析目標網(wǎng)絡(luò)，對目標進行富集分析，揭示潛在機制。本研究篩選出了羌活-獨活的12個活性成分和16個防治KOA的作用靶點。有研究[22]顯示，羌活-獨活聯(lián)用較單味藥能更減緩佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠的足趾腫脹，提高機械刺激疼痛閾值，抑制炎癥因子的分泌。其中歐前胡素抗炎鎮(zhèn)痛作用已得到廣泛研究[23-25]。異歐前胡素能夠抑制脂多糖刺激的RAW264.74小鼠巨噬細胞NO的釋放[26]。佛手柑內(nèi)酯對大鼠成骨細胞的增殖和分化具有促進作用[27]。香葉木素可以改善KOA軟骨細胞變形，增加軟骨細胞數(shù)量，能夠緩解軟骨細胞凋亡和免疫反應(yīng)[28]。由此可見羌活-獨活能夠多通路、多靶點治療KOA。

富集分析顯示，羌活-獨活能夠參與半胱氨酸型內(nèi)啡肽酶活性參與凋亡過程，核受體的活動、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體活性等相關(guān)通路，與細胞的增殖、凋亡和調(diào)控細胞代謝密切相關(guān)。KEGG富集分析顯示相關(guān)通路主要包括細胞凋亡、雌激素、P53、IL-17、AGE-RAGE等信號通路。CASP3、CASP8、CASP9和PTGS2都是與凋亡密切相關(guān)的蛋白酶，CASP3不僅能夠激活CASP6、CASP7和CASP9，還能調(diào)控細胞的遷移、侵襲，在KOA中與軟骨的退變和軟骨細胞凋亡關(guān)系密切[29-31]。BAX主要位于細胞質(zhì)，能夠釋放下游凋亡因子，當(dāng)BAX過表達會抑制BCL-2的活性，促進細胞凋亡[32-33]。JUN是激活蛋白1的亞單位之一，JNK受刺激后能促進JUN磷酸化，擴大炎癥反應(yīng)[34]。AR是一種配體依賴性反轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，雄激素能夠通過AR干預(yù)細胞免疫和細胞因子起到抗炎作用[35-36]。ESR1是一種配體依賴的轉(zhuǎn)錄因子，常表達于軟骨細胞、破骨細胞、成骨細胞以及骨髓基質(zhì)細胞等，雌二醇靶向ESR1能夠抑制ERK信號通路，激活自噬，抑制凋亡，調(diào)控軟骨細胞增殖[37]。正常軟骨中沒有NOS2表達，當(dāng)NOS2受到相關(guān)刺激則能升高NO，增加對軟骨的破壞[38]。

綜上，本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，對“羌活-獨活”治療KOA的作用機制進行了探究，同時通過分子對接將核心靶點與關(guān)鍵成分進行對接驗證，間接證實了本研究的準確性和可靠性。通過分析，篩選出羌活-獨活12種活性成分和16個潛在作用靶點，初步推測羌活-獨活可能通過歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯、香葉木素、谷甾醇等有效活性成分調(diào)控CASP3、JUN、CASP8、AR等靶點調(diào)節(jié)細胞凋亡、雌激素、P53、IL-17、AGE-RAGE等信號通路，抑制炎癥，干預(yù)細胞凋亡過程，從而起到治療KOA的作用。本研究初步闡釋了羌活-獨活治療KOA的合理性，為羌活-獨活治療KOA提供了理論依據(jù)和新的方向。